電轉染的方法及設備的製作方法
2023-05-17 18:19:56 1
專利名稱：電轉染的方法及設備的製作方法
技術領域：
本發明涉及轉基因的方法和設備，特別適合但不僅限於對原代淋巴細胞轉基因中的電轉染的方法及設備。
背景技術：
腫瘤免疫治療領域中，採用轉基因技術設計靶向腫瘤細胞的效應T淋巴細胞是很有前景的免疫治療新方法。同種異體骨髓的幹細胞移植成功和向高度惡性血液癌症患者輸注淋巴細胞的臨床案例表明，人體免疫系統可以控制甚至消滅殘餘病灶。輸入外源淋巴細胞的主要併發症是移植物抗宿主反應，除了攻擊腫瘤細胞也要攻擊正常細胞。由於自體免疫系統的耐受機制，自體淋巴細胞不包含高親和力效應細胞，通過轉基因技術使自體淋巴細胞具有靶向腫瘤抗原並殺傷腫瘤細胞成為腫瘤免疫治療的新方向。
篩選和克隆出針對腫瘤抗原的特異性T細胞受體，通過轉基因技術把該T細胞受體轉入患者外周血T淋巴細胞，然後擴增和激活，回輸患者體內，具有靶向性的T淋巴細胞就能殺傷腫瘤細胞，同時又不會殺傷正常組織細胞。尤其對發生轉移和產生化療藥物抵制的腫瘤幹細胞採用過繼性T淋巴細胞治療能取得好的效果，這彌補了手術和化療手段治療腫瘤幹細胞的不足。
到目前為止，腫瘤免疫治療中使用過繼性轉基因T細胞，都採用逆轉錄病毒載體才能產生有效的穩定的治療效果，這也導致一些安全隱患。第一:由於轉錄病毒載體存在隨機插入整合的問題，會對患者自體細胞造成不可逆的遺傳操作，有產生癌變的潛在風險；第二:目前嵌合抗原受體T細胞一般是用反轉錄或者慢病毒轉染的外周血T淋巴細胞，在體外篩選並擴增出穩定表達細胞，當治療完成或者出現副作用時如何清除掉這些轉基因T細胞成為一個後患問題；第三:病毒載體轉基因技術在操作上繁瑣，會導致產生質量管理與控制的不利因素問題。安全問題成為病毒載體轉基因的固有缺陷。
非病毒載體轉基因方法中最引人關注的是電轉染技術，根據clinicaltrials.gov統計顯示，到目前為止共有35個電轉染的臨床試驗。電轉染DNA疫苗，皮下肌肉注射疫苗並輔以電轉染的臨床試驗有19例，其中結腸癌疫苗I例，前列腺癌疫苗I例，H5N1禽流感病毒DNA疫苗2例，黑色素瘤DNA疫苗2例，HIV疫苗5例，乳頭瘤病毒DNA疫苗2例，宮頸上皮內瘤DNA疫苗I例，慢性C型肝炎疫苗2例，血液惡性腫瘤疫苗I例,抗惡性瘧原蟲DNA疫苗I例，晚期癌症腫瘤疫苗I 例。
電轉染細胞因子質粒，在瘤內注射細胞因子質粒並輔以電轉染的臨床試驗有3例，轉移性黑色素瘤內注射並電轉IL2質粒2例，惡性黑色素瘤內注射並電轉IL12質粒I例。
電轉染化療藥物，對頑固性、皮膚鱗狀、膠質狀腫瘤注射博萊黴素並輔以電轉染的臨床試驗有9例，其中頭頸癌注射電轉博萊黴素2例，皮膚及皮下腫瘤注射電轉博萊黴素I例，胰腺癌電轉博萊黴素I例，黑色素瘤電轉博萊黴素I例，直腸癌電轉博萊黴素I例，腦轉移腫瘤電轉博萊黴素I例，電轉博萊黴素治療腫瘤皮膚潰瘍轉移I例，電轉博萊黴素治療復髮乳腺癌I例。電轉染的其它臨床試驗包括電轉染安全與耐受性測試2例，不可逆電穿孔治療早期原發性肝癌I例。以上統計數據顯示電轉染技術還沒有用於原代淋巴細胞的轉基因治療，原因是以下四點:首先，現有的電轉染技術採用電容單次放電形成高壓電場。如圖1所示現有電轉染儀的電路原理示意圖，電路包含一個充電迴路和一個放電迴路。當開關Ki導通時，控制電路向電容C充電，待電容充電完成後，斷開開關K1。放電時，使K2導通時，電容C向負載放電。整個電路的放電時間是由放電時間RC的值決定，R是放電迴路的等效電阻，包括負載電路的電阻，C是電容的容量值，該電路只能產生單次、正向的高壓放電脈衝，不能產生低壓的放電脈衝。在電容放電中，如果電壓低了，不能在細胞膜上有效的形成小孔，如果電壓高了，能量過於集中，會在細胞膜上形成永久性穿孔，導致靶細胞死亡。由此表明了電容單次放電容易導致原代淋巴細胞凋亡率升高，進而成功轉基因的原代淋巴細胞可得率降低。其次，現有的電轉染技術採用正向脈衝放電，由於細胞內是負電荷，因此正電極附近的細胞轉染效率比負電極附近 的細胞轉染效率高，而且細胞膜穿孔都是面向正電極方向，電轉染細胞總數降低和膜穿孔偏少導致轉基因原代淋巴細胞可得率降低。再次，緊接著高壓脈衝放電之後，長時間的低電壓電泳對提高原代淋巴細胞的電轉染效率是必要的，但目前沒有這項措施。因為在短暫的高壓電場中，細胞膜會形成暫時性小孔，這時施加低電壓電流，外源分子被電泳進入細胞質中。最後，現有的電轉染技術用於植物細胞，微生物和培養細胞系的轉基因，具有一定的轉染效率，但對原代淋巴細胞的轉染效率極低，原因在於現有的基因電轉染技術都是依賴於細胞核的有絲分裂，此時細胞核膜會暫時解聚，外源DNA依靠被動擴散運動進入細胞核中，只有極少數的治療基因能夠通過核膜孔自由的擴散到細胞核內。因此，對於處於靜息期或者極少分裂的細胞，現有的基因電轉染技術的轉染效率極低。因此，安全且高效的轉基因技術已成為細胞免疫治療需要突破的關鍵技術瓶頸。
發明內容
針對傳統電轉儀對原代淋巴細胞轉基因效率極低的技術問題，本發明提供了一種電轉染的方法及設備，可以提高轉基因中的轉染率，提高病毒載體轉基因的安全性。本發明電轉染的方法，包括:對細胞進行四次放電，放電之間進行兩次暫停:第一次放電:電壓為500 1500V的正向脈衝，持續時間20 60 μ s (微秒)；第一次暫停:暫停持續時間600 1200 μ s ；第二次放電:電壓為500 1500V的負向脈衝，持續時間20 60 μ s ;第二次暫停:暫停持續時間600 1200 μ s ；第三次放電:電壓為500 1500V的正向脈衝，持續時間10 50 μ s ;第四次放電:電壓為100 300V的正向電泳電場，持續時間20 IOOms (毫秒)。通過正負方向高壓脈衝電場和低壓脈衝電場組合的方法，能夠對細胞膜進行兩個方向的穿孔，長時間的低壓脈衝能夠使外源分子被電泳進入細胞質中，從而提高電轉染細胞的總數和膜穿孔的數量，由此提高了電轉染率。經過測試，外周血單核細胞轉染pmaxGFP(綠色螢光蛋白)細胞學實驗結果轉染效率達到了 50%左右，為開發腫瘤的生物治療藥物提供了關鍵技術支持。優選的，第一次放電的電壓為800 1100V的正向脈衝，持續時間35 45μ S。優選的，第一次暫停的暫停持續時間800 1000 μ S。優選的，第二次放電的電壓為800 1100V的負向脈衝，持續時間35 45 μ S。優選的，第二次暫停的暫停持續時間800 1000 μ S。優選的，第三次放電的電壓為800 1100V的正向脈衝，持續時間15 25μ S。優選的，第四次放電的電壓為150 200V的正向電泳電場，持續時間40 60ms。進一步的，與上述方法配合使用的電轉染緩衝液的組分可以為:PBS (磷酸緩衝液)緩衝液，濃度 30 200mM ；Tris — HCl，濃度 30 150mM ；Ca (NO3) 2，濃度 0.2 ImM ；KC1，濃度2 8mM ；MgCl2,濃度10 20mM ；NaCl,濃度50 150mM ;葡萄糖，濃度5 30mM ；pH為6.5 ρΗ7.2。所述電轉染緩衝液的另一種組分為:PBS緩衝液，濃度30 200mM ;Tris —HC1，濃度 30 150mM ;Ca (NO3) 2，濃度 0.2 ImM ;KC1，濃度 2 8mM ;MgCl2，濃度 10 20mM ;NaCl，濃度 50 150mM ；pH 為 6.5 ρΗ7.2。本發明還提供了一種用於所述方法的電轉染的設備，包括順序連接的顯示電路、控制電路、邏輯電路和驅動電路，驅動電路的輸出端通過導通元件與低壓直流電源連接，驅動電路的輸出端還通過全橋電路與高壓直流電源連接，全橋電路的輸出端連接負載，並通過電流檢測電路連接所述 的控制電路。所述的導通元件可以為三極體或MOS管。其中:控制電路:用於精確控制時間的MCU控制電路，主要完成波形的發生。可以通過常見的單片機或現有晶片、模塊和常規外圍電路構成。控制電路的主要作用是控制、監督、協調整個設備的正常運行，其主要功能是完成放電波形的產生，精確控制放電時間，與操作顯示面板進行通訊，發送顯示信息並記錄按鍵操作等。其核心是一個單片機，例如可以是PIC16F1937型單片機，也可以是其它具有類似功能的單片機。邏輯電路:用於保證全橋電路正常工作，防止同臂上下橋同時導通，以及快速產生各種波形和快速保護。邏輯電路使用可編程器件PLD (Programmable Logic Device可編程邏輯器)作為電路的核心，編寫相應的嵌入式控制程序，確保下遊的橋式電路按照規定的邏輯順導通。PLD與外圍電路的連接根據具體的PLD型號進行對應連接即可。驅動電路:總計六個驅動導通模塊，此電路包括驅動模塊電源。驅動模塊有過流保護功能。在驅動導通模塊中核心的導通元件為IGBT (Insulated Gate BipolarTransistor，絕緣柵雙極型電晶體)器件，IGBT是由BJT (雙極型三極體)和MOS (絕緣柵型場效應管)管組成的複合全控型電壓驅動式功率半導體器件，兼有MOSFET (金屬-氧化層-半導體-場效電晶體)的高輸入阻抗和GTR (電力電晶體)的低導通壓降兩方面的優點。GTR飽和壓降低，載流密度大，但驅動電流較大；M0SFET驅動功率很小，開關速度快，但導通壓降大，載流密度小。IGBT綜合了以上兩種器件的優點，驅動功率小而飽和壓降低。IGBT採用相對應的驅動電路的進行驅動。每個驅動導通模塊各有一個輸出端，將各模塊的輸出端連接後輸出到全橋電路中。全橋電路:由一個單獨的導通元件和四個相同結構的導通元件組成一個全橋電路，假設左正右負(即圖3中全橋電路部分的左邊一個三極體導通，右邊一個三極體導通，其它三極體截止)，則高壓輸入或低壓輸入直流電源可輸出正負波。全橋電路是四個三極體或MOS管組成的振蕩。全橋電路的優點是不容易產生瀉流。低壓直流電源:當用於過壓保護時，在電壓超過低壓直流閾值時強制關閉此電路的輸入，並報警，正常情況下不會超過低壓直流閾值；用於自放電保護時，在任何情況下，只要電源插頭沒電，自放電路會在幾分鐘內自動放完電容上的電；用於充電電路時，給電容充電；用於電源檢測電路時，檢測此電源上的電壓是否符合要求，不符合要求，充電電路繼續完成充電。高壓直流電源:當用於過壓保護時，在電壓超過高壓直流時強制關閉此電路的輸入，並報警，正常情況下是不會超過高壓直流；用於自放電保護時，在任何情況下，只要電源插頭沒電，自放電路會在幾分鐘內自動放完電容上的電；用於充電電路時，給電容充電；用於電源檢測電路時，檢測此電源上的電壓是否符合要求，不符合要求，充電電路繼續完成充電。電流檢測電路:主要作用是對放電迴路的保護和檢測充電電壓是否符合要求，使設備的整個電路得到保護。當設備電路中沒有負載時，即沒有接入細胞電擊杯時(細胞電擊杯是一個方形杯狀的金屬小盒，在電擊杯中加注細胞及細胞轉染液)，為了避免產生高壓電擊危害，設備的整個放電電路是斷路的，不會放電，並由信號燈提示；當設備電路接入細胞電擊杯時，電流檢測電路檢測高壓直流電源和低壓直流電源的電壓是否符合要求，如果不符合要求，啟動充電電路繼續完成充電，當電壓符合要求後，信號燈提示。本發明的電轉染的方法及設備，能夠大幅度提高電轉染的成功率，在外周血單核細胞轉染pmaxGFP (綠色螢光蛋白)細胞學實驗結果中轉染效率達到了 50%左右，為開發腫瘤的生物治療藥物提供了關鍵技術支持。以下結合實施例的具體實施方式
，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例。在不脫離本發明上述技術思想情況下，根據本領域普通技術知識和慣用手段做出的各種替換或變更，均應包括在本發明的範圍內。
圖1為傳統電轉染儀的電路框圖。圖2為本發明電轉染的方法的放電脈衝示意圖。圖3為本發明電轉染的設備的電路示意圖。圖4為圖3中驅動電路模塊的電路示意圖。圖5為在本發明方法經緩衝液ML16的電轉染的白光視場和突光視場下的顯微鏡對比圖。圖6為在本發明方法經緩衝液GD20的電轉染的白光視場和螢光視場下的顯微鏡對比圖。圖7為經傳統方法和本發明的方法後對外周血單核細胞的流式檢測轉染率的對比圖示。圖8為經傳統方法和本發明的方法後對外周血淋巴細胞的凋亡率和可得率的對比圖示。
具體實施例方式使用本發明的設備進行細胞電轉染。試驗方法:如圖2所示本發明電轉染的方法，本實施例的實驗是用人外周血單核細胞通過本發明方法轉染AMAXA公司的，貨號為VPA1001的pmaxGFP (綠色螢光蛋白)質粒，細胞流式分析轉染效率。方法中包括了對細胞進行I次正向高壓脈衝，暫停一段時間，接著I個負向高壓脈衝，再暫停一段時間，再接著I個正向高壓脈衝，隨後I個長時間的低壓電泳電場。試驗設備:電轉染的設備電路如圖3所示，包括順序連接的顯示電路、控制電路、邏輯電路和驅動電路，驅動電路的輸出端通過三極體結構的導通元件與低壓直流電源連接，驅動電路的輸出端還通過全橋電路與高壓直流電源連接，全橋電路的輸出端連接負載，並通過電流檢測電路連接所述的控制電路。其中:控制電路:用於精確控制時間的MCU控制電路，主要完成波形的發生。邏輯電路:用於保證全橋電路正常工作，防止同臂上下橋同時導通。驅動電路:總計六個如圖4所示的驅動三極體的模塊，驅動模塊有過流保護功能。每個驅動導通模塊各有一個輸出端0UTPUT1，將各模塊的輸出端0UTPUT1連接後輸出到全橋電路中。圖4中的E201是集成的IGBT (Insulated Gate Bipolar Transistor,絕緣柵雙極型電晶體)驅動模塊，型號是VLA517-01R，電路中的埠 OutA由PLD(可編程邏輯器件)控制，是E201模塊的控制輸入端，E201模塊再控制三極體M201的基極G，電流由集電極C流向發射機E，最後由輸出端OUTPUT I。
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全橋電路:由一個單獨的導通元件和四個相同結構的導通元件組成一個全橋電路，假設左正右負，則高壓輸入直流可輸出正負波，低壓輸入直流只能輸出正波。全橋電路是四個三極體或MOS管組成的振蕩。全橋電路的優點是不容易產生瀉流。低壓直流電源:用於過壓保護時，當電壓超過低壓直流閾值時強制關閉此電路的輸入，並報警，正常情況下不會超過低壓直流閾值；用於自放電保護時，在任何情況下，只要電源插頭沒電，自放電路會在幾分鐘內自動放完電容上的電；用於充電電路時，給電容充電；用於電源檢測電路時，檢測此電源上的電壓是否符合要求，不符合要求，充電電路繼續完成充電。高壓直流電源:用於過壓保護時，當電壓超過高壓直流時強制關閉此電路的輸入，並報警，正常情況下是不會超過高壓直流；用於自放電保護時，在任何情況下，只要電源插頭沒電，自放電路會在幾分鐘內自動放完電容上的電；用於充電電路時，給電容充電；用於電源檢測電路時，檢測此電源上的電壓是否符合要求，不符合要求，充電電路繼續完成充電。本實施例中通過傳統的3次正向高壓脈衝和I次正向低壓脈衝放電，與本發明的正負方向高壓脈衝電場和低壓脈衝電場組合的放電方法進行對比試驗。傳統的方法為:3次正向高壓均為800V，I次正向低壓為200V，脈寬分別為50 μ s+T+50 us + Τ+50 μ s+20ms,暫停時間 T=IOOO μ S。本發明的方法為:正向高壓為800V，負向高壓為一 800V，低壓為200V，脈寬分別為50 μ S+T+50 μ S + Τ+50 μ s+20ms,暫停時間 T=IOOO μ s,具體為:第一次放電:電壓為800V的正向脈衝，持續時間50 μ s (微秒)；第一次暫停:暫停持續時間1000 μ s ；第二次放電:電壓為一 800V的負向脈衝，持續時間50μ s ;第二次暫停:暫停持續時間1000 μ s ；第三次放電:電壓為800V的正向脈衝，持續時間50 μ s ;第四次放電:電壓為200V的正向電泳電場，持續時間20ms (毫秒)。本實施例中採用兩種緩衝液進行配合試驗:緩衝液ML16組成:PBS緩衝液(磷酸緩衝液)，濃度30 200mM ；Tris — HCl，濃度30 150mM ；Ca (NO3)2,濃度 0.2 ImM ;KC1，濃度 2 8mM ;MgCl2，濃度 10 20mM ；NaCl,50 150mM ;葡萄糖，濃度 5 30mM ；pH6.5 ρΗ7.2。緩衝液⑶20組成:PBS緩衝液，濃度30 200mM ；Tris — HCl，濃度30 150mM ；Ca(NO3)2,濃度 0.2 ImM ；KC1,濃度 2 8mM ；MgCl2,濃度 10 20mM ；NaCl,50 150mM ；ρΗ6.5 ρΗ7.2。試驗數據及結果:如圖5所示，其中圖5Α是經緩衝液ML16的電轉染在白光視場下的顯微鏡照片圖，圖5Β是經緩衝液ML16的電轉染在螢光視場下的顯微鏡照片圖。目測螢光和白光視場下的轉染細胞比值在40%至50%。如圖6所示，其中圖6Α是經緩衝液⑶20的電轉染在白光視場下的顯微鏡照片圖，圖6Β是經緩衝液GD20的電轉染在螢光視場下的顯微鏡照片圖。目測螢光和白光視場下的細胞比值在30%至40%。採用緩衝液ML16進行傳統方法和本發明方法的轉染率準確數據的對比試驗。如圖7所示，其中圖7Α為傳統方法的轉染率試驗結果，圖7Β為本發明方法的轉染率試驗結果。由圖7的對比圖示可知，圖7Α的傳統方法轉染率為39.6%，圖7Β的本發明方法轉染率為51.3%，本發明方法的轉染率較傳統方法提高了 11.7%。凋亡率和可得率如圖8所示，其中圖8Α為傳統方法的試驗結果，圖8Β為本發明方法的試驗結果。由圖8的對比圖示可知，圖8Α的傳統方法凋亡率為8.8%，可得率為91.2%,圖8Β的本發明方法凋亡率為11%，可得率為89%，本發明方法的凋亡率僅比傳統方法增加了
2.2% (即可得率減少了 2.2%)， 可得率的減少完全在可接受範圍內。通過對比數據可知，通過本發明正負方向高壓脈衝電場和低壓脈衝電場組合的方法，在對細胞膜進行兩個方向的穿孔和長時間的低壓脈衝後，能夠使外源分子被電泳進入細胞質中，從而提高電轉染細胞的總數和膜穿孔的數量，大幅度提高了電轉染率，使外周血單核細胞轉染pmaxGFP (綠色螢光蛋白)細胞學實驗結果轉染效率達到了 50%左右，為開發腫瘤的生物治療藥物提供了關鍵技術支持。
權利要求
1.電轉染的方法，其特徵包括:對細胞進行四次放電，放電之間進行兩次暫停: 第一次放電:電壓為500 1500V的正向脈衝，持續時間20 60μ S ; 第一次暫停:暫停持續時間600 1200 μ s ； 第二次放電:電壓為500 1500V的負向脈衝，持續時間20 60μ s ; 第二次暫停:暫停持續時間600 1200 μ s ； 第三次放電:電壓為500 1500V的正向脈衝，持續時間10 50μ s ; 第四次放電:電壓為100 300V的正向電泳電場，持續時間20 100ms。
2.如權利要求1所述的電轉染的方法，其特徵為:第一次放電的電壓為800 1100V的正向脈衝，持續時間35 45 μ S。
3.如權利要求1所述的電轉染的方法，其特徵為:第一次暫停的暫停持續時間800 1000 μ S。
4.如權利要求1所述的電轉染的方法，其特徵為:第二次放電的電壓為800 1100V的負向脈衝，持續時間35 45 μ S。
5.如權利要求1所述的電轉染的方法，其特徵為:第二次暫停的暫停持續時間800 1000 μ S。
6.如權利要求1所述的電轉染的方法，其特徵為:第三次放電的電壓為800 1100V的正向脈衝，持續時間15 25 μ S。
7.如權利要求1所述的電轉染的方法，其特徵為:第四次放電的電壓為150 200V的正向電泳電場，持續時間40 60ms。
8.如權利要求1至7之一所述的電轉染的方法，其特徵為:配合使用的電轉染緩衝液組分為:PBS緩衝液，濃度30 200mM ；Tris — HCl，濃度30 150mM ;Ca (NO3)2，濃度0.2 ImM ;KC1，濃度2 8mM ;MgCl2，濃度10 20mM ;NaCl，濃度50 150mM ;葡萄糖，濃度5 30mM;pH 為 6.5 ρΗ7.2。
9.如權利要求1至7之一所述的電轉染的方法，其特徵為:配合使用的電轉染緩衝液組分為:PBS緩衝液，濃度30 200mM ；Tris — HCl，濃度30 150mM ;Ca (NO3)2，濃度0.2 ImM ；KC1，濃度 2 8 mM ；MgCl2,濃度 10 20mM ；NaCl，濃度 50 150mM ；pH 為 6.5 ρΗ7.2。
10.用於權利要求1所述方法的電轉染的設備，其特徵為:包括順序連接的顯示電路、控制電路、邏輯電路和驅動電路，在驅動電路中通過導通元件將驅動電路與低壓直流電源連接，驅動電路的輸出端還通過全橋電路與高壓直流電源連接，全橋電路的輸出端連接負載，並通過電流檢測電路連接所述的控制電路。
全文摘要
本發明涉及電轉染的方法及設備。方法中包括了對細胞進行1次500～1500V，20～60μs的正向高壓脈衝放電，暫停600～1200μs，接著1個500～1500V，20～60μs的負向高壓脈衝放電，再暫停600～1200μs，再接著1個500～1500V，10～50μs的正向高壓脈衝放電，隨後1個100～300V，20～100ms的低壓電泳電場放電。本發明的電轉染的方法及設備，能夠大幅度提高電轉染的成功率，在外周血單核細胞轉染綠色螢光蛋白細胞學實驗結果中轉染效率達到了50％左右，為開發腫瘤的生物治療藥物提供了關鍵技術支持。
文檔編號C12M1/42GK103146750SQ20131008662
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月18日 優先權日2013年3月18日
發明者莫邦輝, 馬雨, 王永生, 魏於全 申請人:四川大學