一種細菌纖維素複合膜及其製備方法和應用的製作方法
2023-05-17 05:27:31 1
專利名稱：一種細菌纖維素複合膜及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種創傷敷料的材料及製作方法和應用，特別涉及一種 細菌纖維素複合膜及其製備方法和應用。
背景技術：
細菌纖維素是在'1886年由Brown發現的，木醋桿菌(Acetobacter xylinum)在靜止培養時於培養基表面形成一層白色纖維狀物質，經化學 與物理方法分析確定此類物質具有纖維素的結構與化學性質，因其屬細 菌合成而命名為細菌纖維素(bacterial cellulose BC)。細菌纖維素直徑僅為 人工合成纖維的1/10，為10nm 100nm，是一種新型的納米級生物材料。 其有許多獨特的性質，如高結晶度和高化學純度，高抗張強度和彈性模 量，很強的水結合性，極佳的形狀維持能力和抗撕力，較高的生物適應 性和良好的生物可降解性。所以這種新型生物納米材料的研究開發日益 受到各國研究者的重'視。
皮膚是人體的天然屏障，對維持體內環境的穩定和阻止微生物入侵起 重要作用。在人體的各種損傷中，皮膚組織的燒、創傷發生率最高。若 皮膚受到大面積損傷，則會引起許多局部甚至全身性問題，如新陳代謝加 劇、水分和蛋白質過度散失、免疫系統失調等，嚴重的還會危及生命。重 建或恢復皮膚屏障功能是燒創傷治療的最終目標,在達到這個目標前，一 個性能優良的創面敷料可以暫時起到皮膚的部分功能,提供一個有利於 創面癒合的環境，等待創面上皮化或過渡到重建永久性皮膚屏障。治療皮 膚缺失的有效方法是皮膚移植，消滅創面。自體皮膚是最佳選擇，但當損 傷面積過大及機體狀態不佳時，自體皮膚移植不僅量不足且會增加新創
4傷,無疑是雪上添霜。同種異體皮從20世紀40年代開始被用於治療燒 傷。低溫冷凍(-8(TC以下)同種異體皮是目前臨床廣為應用的產品，但有 以下不足 一是貯存、運輸需要液氮罐，費用昂貴不便應用，尤其在應急 情況下；二是不經最終滅菌處理，有傳播疾病的危險;三是其為活性組織, 有極強的免疫原性，移植後溶解、排斥，在創面停留不超過2周。所以 研製一種能滿足在各種情況下及時、大量供應皮膚創傷治療所需的生物 敷料意義重大。
細菌纖維素為納米級纖維材料，含水量高，在經過改性後含水量更 高且產量也提高，所'以將改性後的細菌纖維素複合膜應用到作為創傷敷 料使用，目前還未見報導。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種高含水量、高產 量的細菌纖維素複合膜及其製作方法和作為創傷敷料的應用。 本發明的設計方案
在液體培養基包括種子培養基和發酵培養基中添加一定量的海藻酸 鈉，然後進行滅菌，接種，常規方式培養，即可得到高表達量、高含水 量和高機械強度的細'菌纖維素複合膜。
本發明所述利用海藻酸鈉製備
一種細菌纖維素複合膜的製備方法，包括如下製備步驟
(1) 菌株選擇
選擇木醋桿菌(Gluconacetobacter xylinum ) CGMCC No. 1 1812 或木醋桿菌(Gluconacetobacter xylinum) CGMCC No. 1.2378;
(2) 種子培養及液體發酵培養的培養基製備
種子培養及液體發酵培養的培養基原料重量百分比組成為 葡萄糖或果糖或蔗糖2% 4%酵母粉:
0.5% 1%
胰蛋白腖:
0.50/0 10/0
Na2HPO,
0.5% 1%
檸檬酸:
0.2% 0.3%
碳酸牽丐:
2% 3%
海藻酸鈉 0.2 0.8g/L 餘量為水
將上述原料混合後，在12rC的溫度下滅菌20 25min，自 然冷卻至3(TC後即可獲得種子培養及液體發酵培養的培養基。
(3) 種子細胞培養'
取50 100mL步驟(2)所配的種子培養的培養基，用擰檬酸 或醋酸調節pH到5 6，再取1 2環活化好的斜面種子(CGMCC No.1.1812、 CGMCC No.1.2378)接入其中。25° C 32。C振蕩 培養24h 36h，搖床轉速為140 180r/min，即得種子液。
(4) 靜態液體發酵培養生產細菌纖維素複合膜；
將步驟(2)所配的液體發酵培養的培養基，用檸檬酸或醋酸 調節pH到5 6，以體積百分比為5% 10%的接種量將步驟(3) 所得的種子液'接種到其中，充分振蕩使菌液均勻，28。C 32。C靜 置培養6 10天，液面表面生成一層膜。
(5) 細菌纖維素複合膜純化組成；
取步驟(4)生成的膜，用水衝洗6 10次，除去膜表面培養 基及雜質，再將膜浸泡於0.08 0.12M的Na2C03鹼溶液中，80°C 100。C煮20min 30min，去除膜中的菌體和殘留培養基，膜呈乳 白色半透明後，用蒸餾水衝洗並測膜pH值到7.0 7.2時，衝洗 停止，即得本發明的細菌纖維素複合膜。
6本發明的有益效果
本發明獲得的細菌纖維素複合膜，製備工藝簡單，成本低，明顯提 高原料的轉化率及細菌纖維素的產量和含水量，可以使細菌纖維素的幹
重由傳統的8 10g/L提高到14 16g/L，含水量由98%至99%。本發明 獲得的細菌纖維素複合膜可用於做創傷性敷料。
具體實施方式
實施例l
(1) 菌株選擇選擇木醋桿菌(G7wco"aceto6acter ) CGMCC No丄1812。
(2) 種子及液體培養基製備在以重量百分比計，含2%的果糖， 0.5%的酵母粉，0.5%胰蛋白腖，0.5%Na2HPO4， 0.2%檸檬酸，2%碳 酸鈣的種子培養基或液體培養基中添加0.05%的海藻酸鈉，自然pH 值，在12rC的溫度下滅菌20min，冷卻至3(TC後即可獲得種子培養 及液體發酵培養的培養基。
(3) 種子細胞培養取1 2環活化好的斜面種子(木醋桿菌 (G7wco"(3Cdo6acter CGMCC No丄1812)接入種子培養的
培養基中，30。C振蕩培養24小時，搖床轉速為160r/min，得種子液；
(4) 靜態液體發酵生產細菌纖維素以體積百分比為6%的接種 量將種子液接種到液體發酵培養的培養基中，充分振蕩使菌液均勻， 30。C靜置培養8天，有生成的細菌纖維素膜浮於液面。
(5) 細菌纖維素膜純化取生成的細菌纖維素膜，用水衝洗8 10次，除去膜表面培養基及雜質，再將膜浸泡於0.1M的Na2CO3溶 液中，100。C煮20min，去除膜中的菌體和殘留培養基，膜呈乳白色 半透明後，用蒸餾水衝洗並測膜pH值到7.0 7.2時，衝洗停止，80°C
7乾燥至恆重，稱細菌纖維素重量，計算產量和含水量。
經測定纖維素的產量為15g纖維素/L培養基，含水量為98.5%， 而以同樣方法培養的不加海藻酸鈉的細菌纖維素產量為8.5 g纖維素 /L培養基，含水量為97.5%。 實施例2
(1) 菌株選擇選擇木醋桿菌(G/wcowaceto6ac^" ;^/z'"wm )CGMCC No丄2378。
(2) 種子培養及液體培養的培養基製備按重量百分比計算，取 2%的葡萄糖，0.5%的酵母粉，0.5%胰蛋白腖，0.5%Na2HPO4， 0.2% 檸檬酸，2%碳酸鈣，0.05%海藻酸鈉，用檸檬酸或醋酸調節pH至6.0， 121°C滅菌20min，冷卻至3(TC後即可獲得種子培養及液體發酵培養 的培養基。
(3) 種子細胞培養取一環活化好的斜面種子木醋桿菌 (G/Mco"ace/ok cferxy//m/w) CGMCC No丄2378，接入種子培養的
培養基中，30。C振蕩培養24小時，搖床轉速為160r/min，作為種子 液。
(4) 靜態液體發酵生產細菌纖維素以6%的接種量接種到液體 發酵培養的培養基中(500mL三角瓶盛有200mL液體培養基)，接 種時需充分振蕩，以使菌液均勻，30°C恆溫靜置培養6天。恆溫靜 置培養6天後生成的細菌纖維素膜浮於液面。
(5) 細菌纖維素膜純化膜取出後，用水多次衝洗，除去膜表面 培養基及雜質。再將膜浸泡於0.1M的Na2C03溶液，100°C煮沸 20min，去除膜中的菌體和殘留培養基，膜呈乳白色半透明後，用蒸 餾水多次衝洗，用pH試紙輕壓膜測pH值，約7.2時，停止衝洗。 80。C乾燥至恆重，進行稱重。
8經測定纖維素的產量為14g纖維素/L培養基，含水量為99%。
相比較同樣方法培養的不加海藻酸鈉的細菌纖維素產量為7.5 g纖維
素/L培養基，含水量為98%。
實施例3
(1) 菌株選擇選擇木酉昔桿菌(67wcowaceto6flcter x少/z.wwm) CGMCC No丄1812;
(2) 種子培養及液體培養的培養基製備按重量百分比計算，
取2%的葡萄糖，0.5%的酵母粉，0.5%胰蛋白腖，0.5%Na2HPO4， 0.2% 檸檬酸，2%碳酸鈣，0.04%海藻酸鈉，用檸檬酸或醋酸調節pH至6.0。 121°C滅菌20min，冷卻至3(TC後即可獲得種子培養及液體發酵培養 的培養基。
(3) 種子細威培養取一環活化好的斜面種子木醋桿菌 (G7wc畫cetotoer 一"謂)CGMCC No丄1812，接入種子培養的
培養基中，32。C振蕩培養24小時，搖床轉速為160r/min，作為種子 液。
(4) 靜態液體發酵生產細菌纖維素以7%的接種量將種子液 接種到液體發酵培養的培養基(分裝到發酵淺盤中，發酵盤清洗乾淨 後，臭氧水消毒)中，接種時需充分振蕩，以使菌液均勻，厚度為 10mm， 32。C恆溫靜置培養6天。恆溫靜置培養6天後生成的細菌纖 維素膜浮於液面，約'厚為8mm。
(5) 細菌纖維素膜純化膜取出後，用水多次衝洗，除去膜表 面培養基及雜質。再將膜浸泡於0.1M的Na2CO3溶液，100。C煮沸 20min，去除膜中的菌體和殘留培養基，膜呈乳白色半透明。然後用 蒸餾水多次衝洗，用pH試紙輕壓膜測pH值，pH約7.2時80。C幹 燥至恆重，進行稱重。
9經測定纖維素的產量為16g纖維素/L培養基，含水量為99%。
相比較同樣方法培養的不加海藻酸鈉的細菌纖維素產量為9.5 g纖維
素/L培養基，含水量為98%。
實施例4
(1) 菌株選擇選扭木酉昔桿菌(G7w函膨toZ)a"er 一w謂)CGMCC No.1.2378。
(2) 種子及液體培養基製備在以重量百分比計，含4%的蔗糖， 1%的酵母粉，1°/。胰蛋白腖，l%Na2HP04， 0.3°/。檸檬酸，3%碳 酸鈣的種子培養基或液體培養基中添加0.08%的海藻酸鈉，然後用擰 檬酸或醋酸調節培養基的pH值為5.3，在121°C的溫度下滅菌20min， 冷卻至3(TC後即可獲得種子培養及液體發酵培養的培養基。
(3) 種子細胞培養取1 2環活化好的斜面種子(木醋桿菌 (G7wcowac"oZ)"cferxj^"mw) CGMCC No. 1.2378 )接入種子培養的
培養基中，32。C振蕩培養24小時，搖床轉速為180r/min，得種子液；
(4) 靜態液體發酵生產細菌纖維素以體積百分比為8%的接種 量將種子液接種到液體發酵培養的培養基中，充分振蕩使菌液均勻， 32。C靜置培養7天，有生成的細菌纖維素膜浮於液面。
(5) 細菌纖維素膜純化取生成的細菌纖維素膜，用水衝洗10次， 除去膜表面培養基及雜質，再將膜浸泡於0.12M的NaOH溶液中， 100。C煮30min，去除膜中的菌體和殘留培養基，膜呈乳白色半透明 後，用蒸餾水衝洗並測膜pH值到7.0 7.1時，衝洗停止，80。C幹 燥至恆重，稱細菌纖維素重量，計算產量。
經測定纖維素的產量為15.5g纖維素/L培養基，含水量為99%。 而以同樣方法培養的不加海藻酸鈉的細菌纖維素產量為9.0 g纖維素 /L培養基，含水量為98%。實施例5
(1 )菌株選擇選擇木醋桿菌(G/wco"acetoZ acfer "//"Mm ) CGMCC No丄1812。
(2) 種子培養及液體發酵的培養基製備在以重量百分比計，含 3%的葡萄糖，0.8%的酵母粉，0.7%胰蛋白腖，0.8%Na2HPO4， 0.25% 檸檬酸，2.5%碳酸鈣的種子培養基或液體培養基中添加0.07%的海藻 酸鈉，然後用檸檬酸或醋酸調節培養基的pH值為5.7，在12rC的溫 度下滅菌20min，冷卻至3(TC後即可獲得種子培養及液體發酵培養 的培養基。
(3) 種子細胞培養取1 2環活化好的斜面種子木醋桿菌 (G/wco"flcetoZ a"er x_y//"ww) CGMCC No.1.1812接入種子培養的
培養基中，22。C振蕩培養36小時，搖床轉速為150r/min，得種子液；
(4) 靜態液體發酵生產細菌纖維素以體積百分比為5%的接種 量將種子液接種到液體發酵培養的培養基中，充分振蕩使菌液均勻， 28°C靜置培養10天，有生成的細菌纖維素膜浮於液面。
(5) 細菌纖維素膜純化取生成的細菌纖維素膜，用水衝洗10次， 除去膜表面培養基及雜質，再將膜浸泡於0.09M的NaOH溶液中， 80。C煮30min，去除膜中的菌體和殘留培養基，膜呈乳白色半透明 後，用蒸餾水衝洗並測膜pH值到7.1 7.2時，衝洗停止，70。C幹 燥至恆重，稱細菌纖維素重量，計算產量。
經測定:纖維素的產量為15.8g纖維素/L培養基，含水量為99%。 而以同樣方法培養的不加海藻酸鈉的細菌纖維素產量為9.2 g纖維素 /L培養基，含水量為98%。
細菌纖維素複合膜的應用
將所得的細菌纖維素複合膜應用皮膚缺損的大鼠的治療，並以油紗
ii布為對照，進行創面癒合情況觀察和光鏡組織學觀察。細菌纖維素膜治 療組與對照組比較，傷後4d傷口癒合率和組織學檢査無區別；結果傷後
7d、 14d、 21d、 28d傷口創面癒合率較對照組顯著提高，組織病理學檢
查顯示細菌纖維素膜治療組創面局部炎症反應較輕，成纖維細胞和新生 毛細血管增殖較對照組明顯提高，後期表皮細胞分化明顯。說明細菌纖 維素膜可刺激成纖維細胞和毛細血管增殖，促進創傷皮膚的再生，對皮 膚創傷性損傷具有促進癒合和減輕炎症反應的作用。
權利要求
1、一種細菌纖維素複合膜的製備方法，其特徵在於包括如下製備步驟(1)菌株選擇選擇木醋桿菌(Gluconacetobacter xylinum)CGMCC No.1.1812或木醋桿菌(Gluconacetobacter xylinum)CGMCC No.1.2378；(2)種子培養及液體發酵培養的培養基製備種子培養及液體發酵培養的培養基原料重量百分比組成為葡萄糖或果糖或蔗糖2％～4％酵母粉0.5％～1％胰蛋白腖 0.5％～1％Na2HPO4 0.5％～1％檸檬酸0.2％～0.3％碳酸鈣2％～3％海藻酸鈉 0.2～0.8g/L餘量為水將上述原料混合後，在121℃的溫度下滅菌20～25min，自然冷卻至30℃後即可獲得種子培養及液體發酵培養基。(3)種子細胞培養取50～100mL步驟(2)所配的種子培養的培養基，用檸檬酸或醋酸調節pH到5～6，再取1～2環活化好的斜面種子CGMCCNo.1.1812、CGMCC No.1.2378接入其中，25℃～32℃振蕩培養24h～36h，搖床轉速為140～180r/min，即得種子液。(4)靜態液體發酵培養生產細菌纖維素複合膜；將步驟(2)所配的液體發酵培養的培養基，用檸檬酸或醋酸調節pH到5～6，以體積百分比為5％～10％的接種量將步驟(3)所得的種子液接種到其中，充分振蕩使菌液均勻，28℃～32℃靜置培養6～10天，液面表面生成一層膜。(5)細菌纖維素複合膜純化組成；取步驟(4)生成的膜，用水衝洗6～10次，除去膜表面培養基及雜質，再將膜浸泡於0.08～0.12M的Na2CO3鹼溶液中，80℃～100℃煮20min～30min，去除膜中的菌體和殘留培養基，膜呈乳白色半透明後，用蒸餾水衝洗並測膜pH值到7.0～7.2時，衝洗停止，即得本發明的細菌纖維素複合膜。
2、 如權利要求1所述的一種細菌纖維素複合膜的製備方法，其特徵在於 獲得的細菌纖維素複合膜為14 16g/L培養基，含水量由98%至99%。
3、 如權利要求1所述的一種細菌纖維素複合膜的製備方法，其特徵在於 獲得的細菌纖維素複合膜可用於創傷性敷料。
全文摘要
本發明涉及一種細菌纖維素複合膜及其製備方法和應用，其製備步驟包括菌株選擇、種子及液體培養基製備、種子細胞培養、液體發酵生產細菌纖維素複合膜及分離純化等，最終得本發明的細菌纖維素複合膜。本發明獲得的細菌纖維素複合膜，製備工藝簡單，成本低，明顯提高原料的轉化率及細菌纖維素的產量和含水量，可以使細菌纖維素的乾重由傳統的8～10g/L提高到14～16g/L，含水量由98％至99％。本發明獲得的細菌纖維素複合膜可用於做創傷性敷料。
文檔編號C08L5/00GK101509026SQ200910048400
公開日2009年8月19日 申請日期2009年3月27日 優先權日2009年3月27日
發明者華 張, 霞 馬 申請人:上海應用技術學院;東華大學