一種土荊芥水提取物的新用途的製作方法

2023-05-04 07:17:46 1

專利名稱：一種土荊芥水提取物的新用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物提取物的用途，確切地說是中草藥土荊芥水提取物在 製備抗B肝病毒藥物中的應用。
二背景技術：
B型肝炎病毒(HBV)感染是常見的感染性疾病之一，據估計目前全球範 圍內大約有4.2億朋￥慢性攜帶者。我國是HBV感染的高發區，其中HBV 攜帶者約1.6億，B型肝炎病毒嚴重威脅人類的健康，慢性B型肝炎發展為原 發性肝癌的危險性比正常人高100倍，B型肝炎在臨床上呈現各種不同的疾病 的類型，包括無症狀攜帶者，急慢性肝炎，肝硬化，最終可能發展為肝癌。其 根本原因在於HBV寄宿在人的肝臟細胞中並不斷釋放病毒顆粒感染其它正常 細胞，同時也釋放入血液中，從而通過血液等體液途經傳播給別人。目前臨床 上治療B肝的藥物很多，主要有幹擾素(IFN)、核苷類似物、反義核酸及核酶 等，各類藥物分別作用於HBV感染及複製的不同階段，也各有優缺點，療效 均不滿意，且副作用大。對HBV的防治己成為我國乃至世界傳染病控制的首 要問題。
在我國，中藥具有來源廣泛，毒性低和副反應小等特點，傳統中草藥治療 B型肝炎病毒感染的臨床應用，已取得令人滿意的效果，積累了豐富的經驗。 土荊芥(Chenopodium ambrosioides L.)為藜科藜屬植物土荊芥的地上部分，一 年生或多年生草本。英文名:Herba chenopodii，別名:臭草、鵝腳草、鉤蟲草。 原產於熱帶美洲，現廣泛分布於世界熱帶及溫帶地區。我國廣西、廣東、福建、 臺灣、江蘇、浙江、江西、湖南、四川等省有野生，常生於村旁、路邊、河岸 等處，北方各省常有栽培。辛，溫，有毒。歸肺經。功能祛風，除溼，殺蟲， 通經，止痛。治療皮膚風溼痺痛，鉤蟲，蛔蟲，痛經，閉經，皮膚溼疹，蛇蟲 咬傷等症。
土荊芥全草含揮髮油(土荊芥油)0.4-1%，以果實中最多(1-4%)，葉次之，莖 最少。油中主成分為驅蛔素(ascaridole，約60-70%)，對-聚傘花素(p-cymene，約25%)，及其他萜類化合物，如土荊芥酮(aritasone )，檸檬烯(limonene)， L 一豐公香齊酮(L-pinocarvone)， d-a—旅;);希(d-a-pinene)、黃,章、油素(safrole)。
葉除含揮髮油外，還分出9種黃酮類化合物:山奈酚(kaempfrol)、異鼠李素 (isorhamnatin)， 槲皮素 (quercetin)、 山奈酚-7-鼠李糖苷 (kaempfrol-7-rhamnoside)、 土荊芥苷(ambroside)、山奈酚-3-鼠李糖-4-木糖苷 (kaempferol 3-rhamnoside-4-xyloside )、山奈酚-3-鼠李糖-7-木糖苷(kaempfero1 3-rhamnoside-7-xyloside), 4-0去甲基相思子黃酮-7-O-a-L-鼠李糖-3-0-(3-D-呋喃 7t^1^^ (4-0-demethylabrectorin-7-0-a-L-rhamnopyranoside~3-0-|3-D"Xylopyranoside)，山 奈酚-3, 7-二鼠李糖苷(kaempferol-3， 7-dirhamnoside)。
此外尚含飽和烴(C21-31 ，主為C29烴),三十烷醇，菠菜甾醇(a-spinasterol)， 由剌囊酸、葡萄糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖等組成的三萜皂苷藜屬皂苷 B(ChenopodosideB)，草酸、枸櫞酸、琥珀酸等。
土荊芥在民間應用廣泛，具有抗癌、祛風除溼、驅蟲、通經止痛等功效。 國內外學者對土荊芥進行了多年的研究，主要是針對其揮髮油成分的分析和揮 髮油藥理作用的研究。土荊芥的揮髮油有很強的抗菌、殺蟲作用。而對水提取 物的研究報導較少。土荊芥的水提取物成分主要是黃酮類化合物，黃酮類化合 物具有很強的藥理活性，能抗菌、抗毒素、抗氧化，能夠淨化血液，減少自由 基的損傷，預防過氧化脂質形成，排除體內毒素。對該類成分研究較少，而黃 酮類化合物具有多種藥理活性，因此對該類化合物的研究將有良好的發展前景。
發明內容
本發明旨在對土荊芥水提取物進行研究，所要解決的技術問題是分離並鑑 定水提取物中的主要活性成分及其在藥學上的應用。
申請人對土荊芥的水提取物的化學成分進行了提取分離，用HPLC-MS聯 用得到了樣品的分子信息。將樣品的質譜圖與標準品的質譜圖對照，並依據薄 層色譜及通過與文獻資料對照，驗證了土荊水提取物中主要兩種黃酮類化學成 分槲皮素和山奈素。槲皮素 山奈素
同時建立了槲皮素和山奈素的高效液相色譜含量測定方法，為土荊芥水提 取物的質量評價及開發提供科學依據。
研究表明，土荊芥水提物中，當槲皮素和山奈素的含量分別>2.4%和》1.8% 時，其新的用途是在製備抗B肝病毒(HBV)藥物中的應用。
具體實施例方式
(一)土荊芥水提物的研究
1、 土荊芥水提取物的製備
藥材來源土荊芥藥材購自安徽亳州藥材市場。
樣品的製備取土荊芥藥材5Kg，加10倍量水煎煮三次，每次1小時，合 並煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.35 1.40 (55 60°C)的稠膏，
備用o
2. 提取物的薄層層析鑑別
對照品溶液的製備分別取槲皮素和山奈素對照品適量，加甲醇製成每lml 含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。
供試品溶液的製備取本品稠膏4g，蒸乾，殘渣加20%鹽酸20ml加熱水 解0.5小時，水解液迅速冷卻，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20ml，合併乙 酸乙酯液，蒸乾，殘渣加甲醇使溶解，作為供試品溶液。照薄層色譜法(中國 藥典2005年版一部附錄VI B)試驗，吸取上述對照品溶液和供試品溶液各5pl， 分別點於同一矽膠G薄層板上，以三氯甲垸-甲醇-甲酸(8:2:1)為展開劑，展 開，取出，晾乾，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，在105。C加熱烘乾。置365nm 螢光燈下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的 螢光斑點。
53.提取物的指標成分含量測定
槲皮素和山奈素的含量測定:通過薄層色譜分析結果表明土荊芥提取物中含 槲皮素和山奈素。這兩種黃酮類化合物均有較強的生理活性，因此選取這兩個 指標成分，建立槲皮素和山奈素的高效液相色譜含量測定方法。
儀器與試藥日本島津SPD-10A高效液相色譜儀，LC-10ATvp泵，AB135-S 十萬分之一電子天平(德國賽多利斯)，JL-180超聲波清洗器(上海傑理科技 有限公司)Phenomenex Luna-ODS色譜柱(4.6X250mm; 5um);浙江大學 N-2000色譜工作站。
試藥:槲皮素、山奈素對照品，購自中國藥品生物製品檢定所。乙腈、甲醇 為色譜純(天津四友生物醫學技術有限公司)；鹽酸天津博迪)、乙酸乙酯(蚌 埠華星)均為分析純；水為重蒸去離子水；其餘試劑均為分析純。 方法與結果
色譜條件與系統適用性試驗
用十八垸基矽烷鍵合矽膠為填充劑；乙腈-0.1%磷酸水溶液(38:62)為流 動相；檢測波長為360nm，流速為l.OmL'min";柱溫為室溫。在此條件下，樣 品中待測組分槲皮素和山奈素得到良好的分離，分離度為〉1.5，理論板數〉 3000，符合規定。
據液相色譜分析，土荊芥水提取物中槲皮素含量為2.4%，山奈素含量為 1.8%。
(二) 土荊芥水提取物體外抑制HBsAg實驗研究 1材料和試劑
1.1 土荊芥水提物2.73g生藥/lml的混懸液(指懸浮液中，含2.73g生藥的水提取 物)。0.1mol/L的NaOH/HCl調至pH7.0，煮沸消毒30分鐘，檢菌陰性4。C冰箱保存。
1.2B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)HBsAg來自安徽醫科大學第一附屬醫院檢 驗科B肝患者的血清，經ELISA試驗定為HBsAg強陽性，分裝小瓶後-4(TC冷 存。實驗前按適當倍數稀釋並測定HBsAg的P/N值。
1.3試劑ELISA試劑盒為上海科華生物工程有限公司生產。批號200S09171.4細胞株Hep-G細胞株購自上海細胞所。
1.5細胞培養試劑小牛血清、DMEM培養基和胰蛋白酶購自合肥中江生物技術公司。
2方法
2.1 土荊芥水提物對Hep-G細胞的最大無毒濃度的篩選將Hep-G2細胞接種於 96孔板,加入含10%小牛血清的.DMEM培養液細胞濃度為1.0 X 1 (^個/ml,200u1/ 孔置5%<302孵箱中培養箱中培養24~4811待生成單層細胞後棄去上清，加入含3% 小牛血清的DMEM培養液將2730mg/ml土荊芥水提物系列2倍稀釋成8個終濃度 為1365mg/ml、682.5 mg/ml、341.3mg/ml、 170.6 mg/ml、85.3 mg/ml、42.7 mg/ml 、 21.3 mg/ml和10.7 mg/ml換含有不同藥物濃度的培養基並設空白藥孔對照繼續 培養2d，結晶紫染色法觀察細胞最大無毒濃度。以鏡下觀察和結晶紫染色法觀 察試驗孔細胞與細胞對照孔細胞在形態和數量一致，該孔藥物濃度為最大無毒 濃度。試驗表明，最大無毒濃度為85.3mg/ml。 2.2土荊芥水提物的初篩(定性)
2.2.1土荊芥水提物與HBsAg的直接作用取96孔微量細胞板,每孔用移液管加
入最大無毒濃度土荊芥水提物50ul和P/N比值為6.35的HBsAg各50ul，經微型
震蕩器均勻混合後，置於37"全溫度培養箱靜止接觸240分鐘。
2.2.2加樣將上述土荊芥水提物與病毒血清混合液50ul加入到包被有抗HBs的
孔中，另設HBsAg陽/陰性的血清/生理鹽水對照，藥物(不含HBsAg)、洗滌液空
白對照。
2.2.3加酶標抗體在上述各孔中(空白對照孔除外)加入酶標抗體，微型震蕩器 均勻混合，37'C作用30分鐘後甩幹並用洗滌液洗板。
2.2.4加底物顯色每孔加顯色劑A、 B各50ul震蕩均勻後，置37匸15分鐘後，加 2mol/L硫酸50ul/孔終止反應。
2.2.5觀察結果在以上各對照孔反應正常時，於ST37型酶聯免疫檢測儀(上海科 華生物工程有限公司生產)比色，450nm波長讀出A值，實驗重複4次，根據平 均A值計算P/N值以判斷藥物是否有效。 2.3 土荊芥水提物的復篩(定量)
2.3.1不同藥物劑量微量細胞板孔內加入濃度為85.31、 42.66、 21.33、 10.66 和5.33 mg/ml各50ul的初篩有效藥和P/N為6.79HBsAg各50ul，經微型震蕩器均 勻混合後，37"C溫箱培養靜止接觸240分鐘，以後各步驟同前述初篩法，記錄結
7果。實驗重複4次，結果取平均值。
2.3.2不同HBsAg滴度微量細胞板孔內加入85.31、 42.66、 21.33、 10.66和5.33 mg/ml各50ul的初篩有效藥和P/N6.50 、 6.35的HBsAg各50ul， 37"溫箱培養靜 止接觸240分鐘，以後各步驟同前述初篩法，記錄結果。實驗重複4次，結果取 平均值。
2.4藥效判斷3項復篩中使用HBsAg濃度的平均P/N值為 (6.79+6.50+6.35=6.55)，以 P/N 《2.10 定為高效藥；P/N2.10 2.69[3.28-(3.28-2.10 )X50。/。]為中效藥；P/N2.69 3.28(6.55 X 50%)為低效藥；P/N 》3.28為無效藥。綜合藥效指數(SEI)取5項復篩結果的平均值。 3結果與討論
3.1藥物對Hep-G細胞的最大無毒濃度為85,3mg/ml。
3.2藥物對B型肝炎表面抗原的作用的初篩P/N2.46 2.64， 2.54±0.09，在
2.10 2.69為中效藥。
3.3藥物的復篩(定量)，結果見表
_表土荊芥水提物對B型肝炎表面抗原的作用_
不同批次 土荊芥水提物對細胞最大無毒劑量(85.31mg/ml)
HBsAg85.3142.6621.3310.665.33PBS(對照)SEI
HBsAgl2.512.893.153.283.646.423.09
HBsAg22.462.663.093.243.686.513.03
HBsAg32.642.742.983.163.576.353.02
3.4藥物對HBsAg總抑制率和最大無毒劑量藥物對HBsAg總抑制率分別為53。/0 和61%
HBsAg陽性P/N=6.79+6.50+6.35=6.55
土荊芥水提物HBsAg總抑制率二 〔6.55- (3.09+3.03+3.02) +3〕〕 /6.55X100% =53%
土荊芥水提物最大無毒劑量對HBsAg總抑制率=(6.55- (2.51+2.46+2.64+3)〕 /6. 55X 100% = 61%
4結論土荊芥水提物在體外對HBsAg血清有較強的抑制作用，最大無毒 劑量達到中效藥物範圍(P/N2.10 2.69)。
權利要求
1、一種土荊芥水提取物的新用途，其特徵在於土荊芥水提取物在製備抗B肝病毒藥物中的應用，提取物中槲皮素含量≥2.4％，山奈素含量≥1.8％。
全文摘要
一種土荊芥水提取物的新用途，其特徵是土荊芥水提取物中當槲皮素含量≥2.4％、山奈素含量≥1.8％時該水提取物在製備抗B肝病毒藥物中的應用。本發明同時建立了槲皮素和山奈素的高效液相色譜含量測定方法，為土荊芥水提取物的質量評價及開發提供科學依據。
文檔編號A61K36/185GK101647832SQ20091014492
公開日2010年2月17日 申請日期2009年9月11日 優先權日2009年9月11日
發明者劉經星, 王舉濤, 偉 魏 申請人:合肥恆星藥物研究所