硝基呋喃類藥物代謝物的衍生物及高效液相色譜螢光檢測的製作方法

2023-12-08 20:43:31 4

硝基呋喃類藥物代謝物的衍生物及高效液相色譜螢光檢測的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種硝基呋喃類藥物代謝物的衍生物及高效液相色譜螢光檢測，方法其主要是由甲醇鈉、甲醇、乙醇肼按一定用量配比，並通過新的合成方法合成了硝基呋喃類藥物代謝物的衍生物，從而實現了對液相色譜螢光的檢測。
【專利說明】硝基呋喃類藥物代謝物的衍生物及高效液相色譜螢光檢測
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種硝基呋喃類藥物代謝物的製備，尤其涉及一種硝基呋喃代謝物AOZ的製備方法及其利用高效液相色譜螢光方法檢測Α0Ζ。
【背景技術】
[0002]硝基呋喃類抗生素(Nitrofurans)是人工合成的具有5_硝基呋喃基本結構的廣譜抗菌藥物，該類抗生素對大多數革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、某些真菌和原蟲均有抑制作用，曾經廣泛用於家禽、家畜、水產、蜂等動物傳染病的預防與治療，但是硝基呋喃類藥物的副作用已引起人們的高度關注。例如呋喃唑酮對治療腸炎和痢疾等效果非常顯著，而且又比較經濟實惠，所以，有些養殖企業把呋喃唑酮作為預防動物腹瀉和霍亂等疾病的主要用品，長期使用，使得藥物殘留在被飼餵動物的肌肉組織與內臟組織中，人在食用這些動物性食品後也會出現類似於藥物過敏的症狀，重者會出現心動過速、血壓升高、胸悶和煩燥等。孕婦在長時間食用這些肉食品後還有可能造成新生兒畸形的風險。由此可見，對呋喃唑酮進行監測是保障人類食品安全的重要組成部分，是保障人類身體健康與生命安全的重要措施。
[0003]硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗生素，對大多數革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、真菌和原蟲等病原體均有殺滅作用，而硝基呋喃類藥物代謝迅速，致使在血漿水平中相應的母體化合物在幾分鐘至幾小時內降解。但其代謝物會以結合態形式在體內殘留較長時間，是硝基呋喃類藥物的標記殘留物。因此硝基呋喃抗生素代謝物可在動物餵食的殘留汙染食物中和動物肌肉中檢測到。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種硝基呋喃類藥物代謝物3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)的製備方法，並建立了 AOZ動物源殘留量的高效液相色譜螢光測定方法。本方法以2-羥基-1-萘醛為AOZ的螢光衍生試劑，實現對AOZ的定量分析，建立了 AOZ的液相色譜-螢光檢測方法，該方法靈敏度滿足國際上動物源性食品和水產品中AOZ的殘留要求，操作方便高效穩定，易於推廣，適合工商部門、檢驗檢疫機構及相關產品養殖加工企業對硝基呋喃代謝物AOZ的快速檢測。
[0005]本發明正是出於上述目的，通過新的合成方法合成了硝基呋喃類藥物代謝物Α0Ζ，並採用高靈敏度、高選擇性的螢光衍生試劑柱前衍生、高效液相色譜分離檢測Α0Ζ，建立了AOZ的液相色譜-螢光檢測方法。本發明通過2-羥基-1-萘甲醛作為衍生試劑進行衍生化，其與AOZ結合後產生較強的螢光。用乙酸乙酯萃取，以乙腈硼酸鹽緩衝液為流動相，梯度洗脫，將該代謝產物完全分離並進行測定，建立了一種新型硝基呋喃類抗生素代謝物AOZ的檢測方法。
[0006]本發明所述的硝基呋喃代謝物AOZ與衍生試劑2-羥基-1-萘甲醛反應後，光譜性質研究表明生成了較強的螢光化合物，從而實現了對AOZ的液相色譜-螢光檢測。
【權利要求】
1.一種硝基呋喃類藥物代謝物的衍生物，其特徵在於:它包括下列用量的組合物: 甲醇鈉0.1128g 甲醇0.23ml乙醇肼1.35ml 碳酸二甲酯2.53ml 2-羥基-1-萘甲醛0.344g乙醇25ml。
2.一種硝基呋喃類藥物代謝物的衍生物的製備方法，其特徵在於:它包括下列步驟: (1)稱取甲醇鈉0.1128g，量取甲醇0.23ml，乙醇肼1.35ml，加入50ml三口燒瓶中，充分攪拌20min，使甲醇鈉充分溶解，燒瓶內為無色透明溶液； (2)加入碳酸二甲酯2.53ml，70°C保溫lh，緩慢攪拌升溫至75°C，敞口回流蒸出甲醇，回流2h至甲醇蒸餾完畢，結束反應，得到AOZ的合成液； (3)稱量0.344820mmoL 2-羥基-1-萘甲醛，用25mL乙醇溶解，將此溶液滴加到AOZ合成液中，滴加時要注意速度，約3s —滴，邊攪拌邊滴加，濾液逐漸變渾濁，溶液為淡黃色，70°C回流2小時，三口燒瓶內上層為淡黃色液體，下層為白色沉澱，趁熱過濾後，將淡黃色濾液結晶得到淡黃色晶體，水洗3次，再用無水乙醇洗滌2-3次，最後用無水乙醇重結晶，乾燥稱重，即得代謝物，質量為0.2815g ；
1HNMR(^OMHzjOr6-DMSO) δ: 12.08 (s, 1H)，8.67 (s, IH)) ,8.58 (d,/=4.4Hz, 1H)，7.89 (q,/=5.7Hz，2H)，7.55-7.59 (m, 1H) ,7.40 (t, /=4.3Hz, 1H)，.22 (d，/=4.5Hz, 1H) ,4.59 (t，/=4.3Hz，2H)，4.14(t, /=4.2Hz，2H) ；ES1-MSm/z257.38[M+H]+ ;元素分析實測值 C15H12N2O3:C，65.72; Η, 4.69 ;N, 10.94.理論值:C,65.62; Η, 4.72 ;N, 10.93 ;0,18.73。
3.一種高效液相色譜螢光檢測的方法，其特徵在於:它包括下列步驟: (1)配製溶液 稱取動物源性和水產品樣品5.0Og,加入IOmL甲醇-0.40mol/L鹽酸混合溶液7+3，體積比，充分水解，再加入200 μ L2-羥基-1-萘甲醛甲醇溶液25mmol/L於50°C水浴衍生2h，用乙酸乙酯萃取，萃取液在40°C下用N2吹乾後，用ImL的乙腈水溶液乙腈:水=8: 2/v:v重新溶解，該溶液採用高效液相色譜螢光儀測定，外標法定量； (2)試樣製備 從原始樣品取出有代表性樣品500g，用搗碎機搗碎混勻，裝入潔淨容器作為試樣，密封，並標明標記，將試樣置於_18°C冷凍避光保存，在制樣的操作過程中，應防止樣品汙染或殘留物含量發生變化； (3)樣品處理 ①水解和衍生化 稱取5.0Og試樣精確至0.01g於50mL塑料離心管中，加入IOmL甲醇-0.40mol/L鹽酸混合溶液7+3，體積比充分攪拌後，超聲40min使其充分水解，加入0.20g氯化鉀，充分攪拌後，再超聲30min，然後以7200r/min離心40min，傾倒上清液於IOmL玻璃試管中，再加入200 μ L2-羥基-1-萘甲醛的甲醇溶液25mmol/L，振蕩搖勻後超聲lOmin，置50°C恆溫水浴鍋中反應2h ； ②提取和淨化 將衍生化後的溶液，冷卻至室溫，在60°C下用氮氣吹至lmL，加入4mL純淨水，再加入5mL乙酸乙酯,振蕩提取5min後，以1000r/min離心5min,收集乙酸乙酯層,殘留物用5mL乙酸乙酯再提取一次，合併乙酸乙酯層，收集液在40°C下用N2吹乾，將濃縮物用ImL的乙腈水溶液乙腈:水=8: 2/v:v重新溶解,用0.45μηι有機濾膜過濾後,轉移入進樣瓶待進樣；(4)測定 液相色譜條件:
色譜柱:YMC_Pack PolymerC18, 250 X 4.Bmml.D.S_6Mm ； 柱溫:40°C ； 流速:0.7mL/min ； 進樣量:20yL ; 螢光檢測條件:靈敏度(EUFS):500 ;增益(Gain): 10 ;通道1:激發波長(Ex):395nm發射波長(Em): 463nm ;通道2:激發波長(Ex):260nm發射波長(Em): 463nm ； (5)工作曲線 移取AOZ標準溶液，添加到IOmL甲醇-0.45mol/L鹽酸混合溶液7+3，體積比中，使其濃度分別為 0.5ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL 和 20.0ng/mL,用高效液相色譜儀測定，繪製標準工作曲線，或採用與待測物相近濃度的標樣進行單點測定； (6)加標回收率實驗 以陰性控制樣品為測試樣品，按照實驗方法進行提取、淨化和測定，在1.0、5.0和.10.0yg/kg3個濃度水平 上進行加標回收試驗，對應工作曲線法計算每個樣品的濃度，並計算回收率。
【文檔編號】G01N30/02GK103808821SQ201410014115
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月13日 優先權日:2014年1月13日
【發明者】盛良全, 徐華傑, 杜娜娜, 劉昭第, 宋崇富, 陳明明, 胡小娟 申請人:阜陽師範學院