氨基-羧基端互換的黃色螢光蛋白的新用途的製作方法

2023-05-04 00:38:51

專利名稱：氨基-羧基端互換的黃色螢光蛋白的新用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及氨基-羧基端互換的黃色螢光蛋白的新用途。

背景技術：
活性氧是一類化學性質非常活潑的含氧自由基或非自由基，它是一把雙刃劍，其「好壞」取決於活性氧產生的時間、空間及濃度。在生理和病理條件下活性氧都起著至關重要的作用。在生理條件下，活性氧參與多種生理功能，如前列腺素、凝血酶原等的合成，核苷酸的還原，體內藥物、毒物解毒過程，吞噬細胞殺菌過程，另外，活性氧作為信號分子參與多條信號通路，如誘導炎症和免疫反應有關的基因表達，活性氧還作為信號分子在細胞、組織和器官的發生、生長過程中發揮重要作用。在病理條件下，在體內外的各種刺激作用下，活性氧可在體內大量產生、聚積，超過生理劑量的活性氧可通過對脂質進行過氧化反應，破壞細胞膜的通透性，使細胞損傷及脂酶失活，並可攻擊蛋白，使蛋白和蛋白酶變性、失活，還可通過鹼基修飾損傷DNA，這些直接作用都可以引起細胞損傷，甚至引起細胞凋亡或壞死；但超過生理劑量而又不足以引起細胞壞死的活性氧更有可能作為信號分子啟動各種損傷反應。
活性氧主要產生於線粒體呼吸鏈，是電子在呼吸鏈傳遞過程中因電子漏而產生的，其中超氧陰離子(superoxide anion radical，O2·-)是呼吸鏈的直接產物，隨後超氧陰離子再被轉化為過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)、羥自由基(hydroxylradical，·OH)等其他活性氧。
目前，在活細胞內檢測活性氧的指示劑主要是對活性氧敏感的螢光染料，其中，被廣泛使用的是二氯螢光素雙醋酸鹽(2′，7′dichlorodihydrofluorescindiacetate，H2DCFDA)，該螢光染料能夠比較靈敏的測定細胞漿中活性氧的水平，但存在很多缺點，如在雷射掃描下，它會和光子發生相互作用而產生活性氧；缺乏特異性，能夠與多種氧化劑反應；由於該指示劑是有機化合物，不能被定位到特定的細胞區域，只能測定細胞漿中的活性氧水平。因此迫切需要能定位到特定細胞器尤其是線粒體中的特異於活性氧的指示劑。以螢光蛋白為基礎的活性氧指示劑既可以利用分子生物學的手段對其改造，使其定位表達於特定的細胞器，又能夠特異性的測定不同種類的活性氧，而且能夠在整體水平測定活性氧的水平，從而能夠測定不同的生理病理條件下不同種類活性氧的時空特性。


發明內容
本發明的目的是提供一種氨基-羧基端互換的黃色螢光蛋白的新用途。本發明的氨基-羧基端互換的黃色螢光蛋白可作為活性氧螢光蛋白指示劑，該活性氧螢光蛋白指示劑能在分子、細胞及整體水平實時測定不同生理病理狀態下超氧陰離子的時空特性。
本發明的活性氧螢光蛋白指示劑包括兩種，一是能檢測細胞漿中O2·-的活性氧螢光蛋白指示劑，命名為cpYFP，是氨基-羧基端互換的黃色螢光蛋白，其胺基酸序列為序列表中的序列1；二是能檢測線粒體中O2·-的活性氧螢光蛋白指示劑，命名為mt-cpYFP，是在cpYFP的N端加了一段線粒體定位序列獲得的黃色螢光蛋白，其胺基酸序列為序列表中的序列2。
本發明的活性氧螢光蛋白指示劑可通過將cpYFP或mt-cpYFP蛋白的編碼基因構建到真核表達質粒、原核表達質粒和腺病毒表達體系中，再將構建的重組質粒或腺病毒導入宿主細胞中而表達cpYFP或mt-cpYFP蛋白，cpYFP或mt-cpYFP蛋白能夠在分子及細胞水平實時檢測O2·-的特性。
cpYFP蛋白的編碼基因具體可為序列表中的序列3；mt-cpYFP蛋白的編碼基因具體可為序列表中的序列4。
本發明的另一個目的是提供一種能監測超氧陰離子變化的動物模型的構建方法。
本發明所提供的能監測超氧陰離子變化的動物模型的構建方法，是將cpYFP或mt-cpYFP基因導入動物受精卵母細胞中，獲得能監測超氧陰離子變化的轉基因動物模型。
其中，所述動物具體可為ICR小鼠。
利用轉基因動物製備技術，將cpYFP或mt-cpYFP轉入小鼠中，可製備成全身性表達或組織特異性表達(心臟特異性表達、神經特異性表達)所述cpYFP或mt-cpYFP蛋白的轉基因小鼠，從而能在整體水平實時測定不同的生理病理條件下O2·-的變化。全身性表達cpYFP或mt-cpYFP蛋白的轉基因小鼠模型是具體可為將所述的cpYFP或mt-cpYFP基因序列轉入ICR小鼠的基因組中，其表達所用的啟動子是β-actin啟動子；心臟特異性表達cpYFP或mt-cpYFP蛋白的轉基因小鼠模型具體可為將所述的cpYFP或mt-cpYFP基因序列轉入ICR小鼠的基因組中，其表達所用的啟動子是α-MHC啟動子；神經特異性表達cpYFP或mt-cpYFP蛋白的轉基因小鼠模型是將所述的cpYFP或mt-cpYFP基因序列轉入ICR小鼠的基因組中，其表達所用的啟動子是En1啟動子。
本發明的活性氧螢光蛋白指示劑可在細胞中定位、實時測定超氧陰離子的變化，通過製備活性氧螢光蛋白指示劑的轉基因小鼠模型可實時測定不同生理病理條件下不同組織的活性氧變化。



圖1SDS-PAGE鑑定從E.coli中分離純化的cpYFP蛋白 圖2為超氧陰離子黃色螢光蛋白指示劑cpYFP的光譜特性 圖3為線粒體定位的超氧陰離子黃色螢光蛋白指示劑mt-cpYFP在不同細胞中的表達 圖4為單個線粒體中的超氧炫 圖5為心肌細胞的超氧炫在缺氧再灌注處理過程中的變化 圖6為cpYFP轉基因小鼠心臟中超氧陰離子的變化，整體心臟上的超氧炫
具體實施例方式 實施例1、超氧陰離子黃色螢光蛋白指示劑 (1)超氧陰離子黃色螢光蛋白指示劑的製備 以pcDNA3-ratiometric-pericam-mt(Nagai，T.，Sawano，A.，Park，E.S.，andMiyawaki，A.(2001).Circularly permuted green fluorescent proteinsengineered to sense Ca2+.Proc Natl Acad Sci USA 98，3197-3202.)(北京大學)為模板，利用引物P1和P2擴增超氧陰離子黃色螢光蛋白基因(cpYFP)，引物P1和P2的序列如下 P1PstI CTGCAGATGTACAACAGCGAC P2KpnI GGTACCTTAGGTACCGTTGTAC PCR擴增出約750bp的cpYFP片段，cpYFP片段回收後連接到pRSET載體上，構建重組質粒pRSET-cpYFP，進行測序，測序結果表明cpYFP片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示，編碼序列表中序列1所示的蛋白。將重組質粒pRSET-cpYFP轉化入E.coli.(BL21(DE3)LysS中，獲得重組菌BL-cpYFP。
重組菌BL-cpYFP在LB培養基中37℃培養至菌體濃度OD600為0.7，加入0.1mMIPTG，37℃誘導表達6h，用Ni親和層析柱從菌體裂解液中分離純化cpYFP蛋白，經SDS-PAGE鑑定，只在約30kD處有一條蛋白條帶，為cpYFP蛋白(圖1)，圖1中1為Marker，2為用Ni親和層析柱分離純化的cpYFP蛋白。
(2)超氧陰離子螢光蛋白指示劑的光譜特性 cpYFP蛋白溶解於平衡溶液中配製成終濃度為1μM的蛋白溶液，平衡溶液中含有75mM的HEPES，125mM的KCl和1mM的EDTA(pH＝8.0)。
在連續充氮的惰性環境下(氧分壓為零)，1μM cpYFP溶液分別與10mM還原型的二硫蘇糖醇(DTT)或1mM的Aldrithiol孵育至少3小時，還原型的DTT能維持cpYFP的還原狀態，Aldrithiol能維持cpYFP的氧化狀態，去除還原型的DTT後，完全還原態的cpYFP進行如下任一種處理 (a)完全還原態的cpYFP溶液暴露在有氧環境中(圖2B中用「d」表示)； (b)完全還原態的cpYFP溶液暴露在有氧環境中，加入次黃嘌呤，使次黃嘌呤的終濃度為2mM，再加入20mU的次黃嘌呤氧化酶(圖2B中用「e」表示)； (c)完全還原態的cpYFP溶液暴露在有氧環境中，加入次黃嘌呤，使次黃嘌呤的終濃度為2mM，再加入20mU的次黃嘌呤氧化酶，最後加入超氧化物歧化酶，使其終濃度為600U/ml(圖2B中用「f」表示)。
(d)完全還原態的cpYFP溶液在無氧環境下加入H2O2，使H2O2的終濃度為0.1mM(圖2C中用「h」表示)； (e)完全還原態的cpYFP溶液在無氧環境下加入H2O2，使H2O2的終濃度為10mM(圖2C中用「i」表示)； (f)完全還原態的cpYFP溶液在無氧環境下加入H2O2，使H2O2的終濃度為1mM，再加入FeSO4，使FeSO4的終濃度為0.1mM(圖2C中用「j」表示)。
測定上述各個處理條件下cpYFP的發射光譜。激發和發射光譜利用螢光光譜儀(ModelCM1T10I，HORIBA Jobin Yvon，Inc.)進行測定。
光譜特性測定的實驗結果表明，cpYFP在完全還原(圖2中用「a」表示)和完全氧化狀態下(圖2中用「b」表示)的激發光和發射光波長分別為488nm和515nm，cpYFP強氧化狀態下的螢光強度是還原狀態下的5倍(圖2A)；cpYFP能選擇性地對黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶產生的O2·-發生反應，在有氧條件下黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶產生的O2·-增強了cpYFP的螢光強度(圖2B中用「e」所示)；O2分子和過氧化物歧化酶產生的過氧化氫及0.1和10mM的H2O2都不增強cpYFP的螢光強度，而1mM的H2O2和FeSO4產生的·OH降低了cpYFP的螢光強度(圖2C)。
(3)超氧陰離子螢光蛋白指示劑mt-cpYFP在線粒體中的定位表達 以pcDNA3-ratiometric-pericam-mt(Nagai，T.，Sawano，A.，Park，E.S.，andMiyawaki，A.(2001).Circularly permuted green fluorescent proteinsengineered to sense Ca2+.Proc Natl Acad Sci USA 98，3197-3202.)(北京大學)為模板，利用引物P1和P2擴增超氧陰離子黃色螢光蛋白基因(cpYFP)，引物P1和P2的序列如下 P1Hind III AAGCTTATGCTGAGCCTGCGC P2EcoR V GATATCTTAGGTACCGTTGTAC PCR擴增出約800bp的mt-cpYFP片段，mt-cpYFP片段回收後連接到pShuttle-CMV載體上，構建重組質粒pShuttle-mt-cpYFP，進行測序，測序結果表明mt-cpYFP片段mt-cpYFP片段的核苷酸序列如序列表中序列4所示。利用stratagene公司的病毒包裝試劑盒(#240010)進行腺病毒包裝，利用所得的表達mt-cpYFP的腺病毒分別轉染新生大鼠心臟成纖維細胞、Hela細胞和成年大鼠心肌細胞，用雷射共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM 510)觀察轉染後的細胞，激發光和發射光波長分別為488nm和＞505nm。
實驗結果表明，mt-cpYFP在新生大鼠心臟成纖維細胞(圖3A)、Hela細胞(圖3B)和成年大鼠心肌細胞(圖3C)中高效、定位表達於線粒體。
實施例2、超氧陰離子螢光蛋白指示劑檢測活性氧的變化 (1)超氧陰離子螢光蛋白指示劑實時測定細胞中的活性氧水平 雷射共聚焦顯微鏡實時觀測實施例1中轉染的成年大鼠心肌細胞、細胞外液中加入超氧化物岐化酶的類似物MnTMPyP的實施例1中轉染的成年大鼠心肌細胞和細胞外液中加入超氧陰離子清除劑tiron的實施例1中轉染的成年大鼠心肌細胞。
雷射共聚焦顯微鏡實時觀測的結果如圖4所示，表明單個線粒體會自發的在短時間內(~10s)突然產生大量超氧陰離子，將此現象命名為「超氧炫」(superoxideflash)，並且其發生頻率和幅度可被超氧化物岐化酶的類似物MnTMPyP和超氧陰離子清除劑tiron降低。
圖4A中上部分為雷射共聚焦顯微鏡所拍攝的表達cpYFP的成年大鼠心肌細胞，下部分為局部放大區，局部放大區域顯示按時間展開的單個線粒體的超氧炫，每幅圖像間隔2S；圖4B為典型的超氧炫的時間和幅度特性；圖4C為超氧化物岐化酶的類似物MnTMPyP和超氧陰離子清除劑tiron降低了超氧炫的頻率，1代表實施例1中轉染的成年大鼠心肌細胞，2代表細胞外液中加入超氧化物岐化酶的類似物MnTMPyP的實施例1中轉染的成年大鼠心肌細胞，3代表細胞外液中加入超氧陰離子清除劑tiron的實施例1中轉染的成年大鼠心肌細胞；圖4D為超氧化物岐化酶的類似物MnTMPyP和超氧陰離子清除劑tiron降低了超氧炫的幅度，1代表實施例1中轉染的成年大鼠心肌細胞，2代表細胞外液中加入超氧化物岐化酶的類似物MnTMPyP的實施例1中轉染的成年大鼠心肌細胞，3代表細胞外液中加入超氧陰離子清除劑tiron的實施例1中轉染的成年大鼠心肌細胞。
對轉染的成年大鼠心肌細胞進行缺氧再灌注處理，測定超氧陰離子的變化，實驗結果如圖5，表明在心肌細胞缺氧-再灌注早期，超氧炫頻率出現上調，因此超氧炫可作為多種氧化應激相關疾病的生物標誌物。
圖5A是心肌細胞的二維圖像，方框表示心肌細胞在復氧5分鐘時，100秒內記錄到的超氧炫的位置。圖5B表示3個具有代表性的細胞分別在缺氧6小時和復氧5分鐘的情況下，一定時間內記錄到的超氧炫的數目的統計結果(一條小豎線表示發生一次超氧炫)，其中左側的圖表示缺氧6小時情況下超氧炫數目的統計結果，右側的圖表示復氧5分鐘的情況下超氧炫數目的統計結果。
(2)整體動物水平上利用超氧陰離子螢光蛋白指示劑測定不同的生理病理條件下活性氧的變化 (a)超氧陰離子螢光蛋白指示劑轉基因小鼠模型的建立 首先將實施例1中擴增的mt-cpYFP基因分別克隆到pUC-CAGGS載體(HiroakiHonda，Koichiro Harada，Issei Komuro，Fumio Terasaki，Hiroo Ueno，Yuji Tanaka，Keishiro Kawamura，Yoshio Yazaki and Hisamaru Hirai.(1999).Heart-specificactivation of LTK results in cardiac hypertrophy，cardiomyocyte degenerationand gene reprogramming in transgenic mice.Oncogene，183821-3830)(北京大學)的XhoI位點及pBSIISK(+_)-α-MHC載體(Tomoaki Osugi，Yuichi Oshima，Yasushi Fujio，Masanobu Funamoto，Atsuko Yamashita，Shinji Negoro，KeitaKunisada，Masahiro Izumi，Yoshikazu Nakaoka，Hisao Hirota，Masaru Okabe，KeikoYamauchi-Takihara，Ichiro Kawase，and Tadamitsu Kishimoto. (2002).Cardiac-specific Activation of Signal Transducer and Activator ofTranscription 3 Promotes Vascular Formation in the Heart.J.Bio.Chem.2776676-6681.)(北京大學)的HindIII和EcoRV位點間，構建重組表達載體pUC-CAGGS-mt-cpYFP和pBKSII-α-MHC-mt-cpYFP，然後將pUC-CAGGS-mt-cpYFP和pBKSII-α-MHC-mt-cpYFP分別利用NotI和ScaI酶切進行線性化，利用顯微注射的方式將線性化的pUC-CAGGS-mt-cpYFP和pBKSII-α-MHC-mt-cpYFP分別轉入ICR小鼠受精卵母細胞中，獲得轉pUC-CAGGS-mt-cpYFP載體的新生小鼠和轉pBKSII-α-MHC-SV40mt-cpYFP載體的新生小鼠；轉pUC-CAGGS-mt-cpYFP載體的新生小鼠全身性表達mt-cpYFP蛋白，轉pBKSII-α-MHC-mt-cpYFP載體的新生小鼠心臟特異性表達mt-cpYFP蛋白。提取新生小鼠的基因組，並以其作為模板，利用PCR的方式進行基因鑑定，篩選轉入了超氧陰離子螢光蛋白指示劑的轉基因小鼠。
鑑定轉pUC-CAGGS-mt-cpYFP載體的小鼠的引物P1和P2的序列如下 P1TTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTAC P2GACTGGAAGCTCAGGTAGTGGTT 鑑定轉pBKSII-α-MHC-mt-cpYFP載體的小鼠的引物P3和P4的序列如下 P3AGTTAACCAGGTGAGAATGTTTCC P4ATGATATAGACGTTGTCGCTGTTG (b)整體水平測定心臟中超氧陰離子的變化 將mt-cpYFP的轉基因小鼠麻醉後取心臟，主動脈插管，進行Langendorff灌流，灌流心臟放到雷射共聚焦顯微鏡的載物臺上，採集心臟表面下大約30μm的螢光信號。
mt-cpYFP的轉基因小鼠測定心臟中超氧陰離子變化的實驗結果如圖6，在整體心臟上也觀測到了超氧炫。
圖6中左上角的圖是實驗模式圖，用結紮線將心臟主動脈固定在插管上。圖6中間的圖是跳動心臟表面(或近表面)的心肌細胞的二維圖像。圖6下部分的圖為心肌細胞中兩個發生超氧炫的線粒體(1，2)和一個靜息的線粒體(3)的螢光強度隨時間變化的曲線。
因此，利用mt-cpYFP的轉基因小鼠模型，結合病理模型，能夠實時測定不同病理生理條件下活性氧的變化。
序列表
北京大學
氨基-羧基端互換的黃色螢光蛋白的新用途
CGGNARW81480
4
1
249
PRT
多管水母屬的維多利亞多管水母(Aequorea victoria)
1
Tyr Asn Ser Asp Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
1 5 10 15
Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly Val
20 25 30
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
35 40 45
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Phe Gln Ser Ala Leu Ser
50 55 60
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
65 70 75 80
Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Val Asp
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Thr Gly Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr
100 105 110
Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His
115 120 125
Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Gly Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys
130 135 140
Leu Thr Leu Lys Leu Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp
145 150 155 160
Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Gly Tyr Gly Leu Lys Cys Phe Ala Arg
165 170 175
Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro
180 185 190
Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn
195 200 205
Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn
210 215 220
Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu
225 230 235 240
Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Gly Thr
245
2
268
PRT
多管水母屬的維多利亞多管水母(Aequorea victoria)
2
Leu Ser Leu Arg Gln Ser Ile Arg Phe Phe Lys Arg Ser Gly Ile Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gly Tyr Asn Ser Asp Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln
20 25 30
Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp
35 40 45
Gly Gly Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly
50 55 60
Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Phe Gln Ser
65 70 75 80
Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu
85 90 95
Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr
100 105 110
Lys Val Asp Gly Gly Ser Gly Gly Thr Gly Val Ser Lys Gly Glu Glu
115 120 125
Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val
130 135 140
Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr
145 150 155 160
Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Leu Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro
165 170 175
Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Gly Tyr Gly Leu Lys Cys
180 185 190
Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser
195 200 205
Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp
210 215 220
Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr
225 230 235 240
Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly
245 250 255
Asn Ile Leu Gly Hi s Lys Leu Glu Tyr Asn Gly Thr
260 265
3
753
DNA
多管水母屬的維多利亞多管水母(Aequorea victoria)
3
atgtacaaca gcgacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggcc 60
aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcggcgtgc agctcgccga ccactaccag120
cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcttc180
cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc240
gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaaggtcga cggtggcagc300
ggtggcaccg gtgtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc360
gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat420
gccacctacg gcaagctgac cctgaagctc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc480
tggcccaccc tcgtgaccac cttcggctac ggcctgaagt gcttcgcccg ctaccccgac540
cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc600
accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc660
gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc720
ctggggcaca agctggagta caacggtacc taa 753
4
810
DNA
多管水母屬的維多利亞多管水母(Aequorea victoria)
4
atgctgagcc tgcgccagag catccgcttc ttcaagcgca gcggcatcgg gtctgcaggc 60
tacaacagcg acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggccaac120
ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc ggcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag180
aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcttccag240
tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg300
accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca aggtcgacgg tggcagcggt360
ggcaccggtg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag420
ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc480
acctacggca agctgaccct gaagctcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg540
cccaccctcg tgaccacctt cggctacggc ctgaagtgct tcgcccgcta ccccgaccac600
atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc660
atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac720
accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg780
gggcacaagc tggagtacaa cggtacctaa 810
權利要求
1、如下a)或b)的蛋白作為活性氧螢光蛋白指示劑的應用；
a)其胺基酸序列是序列表中的序列1；
b)其胺基酸序列是序列表中的序列2。
2、如下1)或2)的基因在製備活性氧螢光蛋白指示劑中的應用；
1)其核苷酸序列是序列表中的序列3；
2)其核苷酸序列是序列表中的序列4。
3、一種能監測超氧陰離子變化的動物模型的構建方法，是將如下1)或2)的基因導入動物受精卵母細胞中，獲得能監測超氧陰離子變化的轉基因動物模型；
1)其核苷酸序列是序列表中的序列3；
2)其核苷酸序列是序列表中的序列4。
4、根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述動物為ICR小鼠。
全文摘要
本發明公開了一種氨基-羧基端互換的黃色螢光蛋白的新用途。本發明的氨基-羧基端互換的黃色螢光蛋白可作為活性氧螢光蛋白指示劑。本發明還公開了一種能監測超氧陰離子變化的動物模型的構建方法。本發明的活性氧螢光蛋白指示劑可在細胞中定位、實時測定超氧陰離子的變化，能監測超氧陰離子變化的動物模型可實時測定不同的生理病理條件下不同組織的活性氧變化。
文檔編號G01N33/68GK101315366SQ20081011669
公開日2008年12月3日 申請日期2008年7月15日 優先權日2008年7月15日
發明者程和平, 王顯花, 敏 陳, 銘 鄭, 方華強, 張宛睿, 王豔茹 申請人:北京大學