治療糖尿病合併周圍神經病變併發症的蛇毒酶神經生長因子的製作方法

2023-05-03 12:22:26

專利名稱：治療糖尿病合併周圍神經病變併發症的蛇毒酶神經生長因子的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療糖尿病合併周圍神經病變併發症的藥物，尤其是指利用生物活性物質提取配製而得的藥物。
背景技術：
糖尿病是一種由於體內糖代謝紊亂導致血糖升高為主臨床特徵為全身性內分泌代謝性疾病。糖尿病發展到一定程度，尤其是合併有慢性血管、神經病變時，或者長期使用胰島素治療者常常伴有瘀血症表現，諸如面有瘀斑、面部晦暗、肢體疼痛、麻木，痛處固定不移，心前區疼痛，舌邊有瘀斑或瘀點等等。西醫治療糖尿病人多用磺脲類，雙胍類及胰島素藥物治療，它們降血糖作用雖然明顯，但僅僅能夠達到調節代謝紊亂的程度，而且西藥副作用大，長期服用會損害肝、腎，影響胃腸功能，導致發生多種糖尿病合併症。中醫治療糖尿病歷史悠久、滋陰清熱、生津止渴一直是治療糖尿病所遵循的基本法則。糖尿病患者通過中藥治療以後，雖然在血糖和尿糖方面控制比較理想，但主觀症狀仍未消除。致使糖尿病周圍神經病變的患病率約為60％。

發明內容
本發明的目的是提供一種利用生物活性物質改善神經組織中的糖代謝，促進神經元增大，改善微循環的治療糖尿病合併周圍神經病變併發症的蛇毒酶神經生長因子。
本發明的技術方案是製備工藝所有操作均在10℃以下完成。
①CM-SephadexC50層析取眼鏡蛇毒10g，溶於0.01M乙酸鈉緩衝液100ml中，PH5.8，溶解後，離心10000轉，10分鐘，取上清，對上述緩衝液5000ml透析，換3次緩衝液，然後樣品上樣於用0.01M乙酸鹽緩衝液平衡好的層析柱5.5×100cm中，用0-0.7MNaCL線性梯度洗脫，收集具有神經生長因子活性的蛋白峰，濃縮凍幹。
②CM-SpharoseFF層析將上述濃縮的樣品，溶於20ml0.01M乙酸鈉緩衝液中，PH5.8，上樣於用0.01M乙酸鈉緩衝液PH5.8平衡好的層析柱2.6×50cm中，用0-1MNaCL線性梯度洗脫，收集具有神經生長因子活性的蛋白峰，濃縮凍幹。
③SephdexG75層析將上述CM-SpharoseFF層析下的樣品，溶解在10ml0.01M乙酸鈉緩衝液，PH5.8，內含0.15MNaCL中，離心10000轉，取上清，上樣於用0.01M乙酸鈉緩衝液，PH5.8，內含0.15MNaCL平衡好後的SephdexG75柱中，收集含有NGF活性的對稱峰，經電泳及高效液相色譜證明為單一峰後，透析除鹽，凍幹即得半成品，約3mg。
④製劑處方原料神經生長因子半成品，按質量標準的測定半成品的活性，每支規格1000單位，按135％-145％投料。加入1％右旋糖苷(分子量1萬)，及每支藥中含有1.5mg人血白蛋白，過濾分裝，凍幹製得。
本發明的有益效果是糖尿病周圍神經病變的患病率約60％，其發病機制考慮可能與下列因素有關。①代謝障礙，近年通過動物實驗和臨床研究發現糖尿病時，周圍神經中Myo-肌醇(myo-inositol)減少和山梨醇積存，Na+/k+三磷酸腺苷酶的活性降低，從而影響興奮細胞的傳導性。由於胰島素不足，葡萄糖代謝不能正常進行，而不需胰島素參與的山梨醇旁路代謝活躍，這種代謝主要在神經組織中進行，因山梨醇難以透過神經細胞膜，使其在神經組織中堆積，神經細胞滲透壓升高、水分增多，導致細胞水腫、缺氧、壞死、神經纖維脫髓鞘、軸索變性以及神經傳導速度減慢。②血管閉合，糖尿病病人營養神經的血管閉合率較非糖尿病病人為高，伴有神經病變者更高。血管的閉合，可致神經組織缺血壞死，其原因可能與糖尿病病人血脂增高，血小板聚集性增強以及血管基底膜增厚有關。③神經生長因子功能異常，神經生長因子NGF是維持神經組織正常生長和作用不可缺少的物質，文獻報導實驗性糖尿病小鼠其NGF減少。糖尿病病人可能有NGF減少和功能異常。因NGF與胰島素有相似的胺基酸序列，兩者有相同的抗原簇。糖尿病病人NGF減少和功能異常可能是引起神經病變的原因之一。採用蛇毒酶神經生長因子治療糖尿病並發周圍神經病變取得明顯的療效，其原因(1)蛇毒酶神經生長因子含有NGF，NGF是從蛇毒中分離出來，是促進神經生長的生物活性分子。它能促進神經元的增大，使軸突從近端向遠端生長，使細胞器數量增多，從而改善神經細胞功能。(2)調節糖代謝，本申請含有NGF，它與胰島素有類似的結構和作用部位，可彌補神經細胞中NGF的不足，促進神經細胞利用葡萄糖及合成蛋白與脂質，改善代謝狀況，使神經組織中的糖代謝進入正常途徑，減少山梨醇積聚，糾正神經細胞的水腫和缺氧。(3)改善微循環，蛇毒酶神經生長因子含有精氨酸脂酶、水解蛋白酶及磷酸二脂酶等，能抑制血小板聚集，改善血液粘度，具有溶栓、擴血管等功能。實驗研究證實本申請製劑能降低TxB2濃度，抑制血小板聚集，擴張局部小血管，改善微循環。由於蛇毒酶神經生長因子的獨特作用，為防治糖尿病合併的神經病變開闢了一條新途徑。另外經神經生長因子對糖尿病大鼠周圍神經病變作用的實驗研究，得出結論為早期、長期應用外源性神經生長因子，可增加糖尿病大鼠坐骨神經髓鞘面積，減少神經纖維髓鞘脫失，軸突萎縮，可以改善糖尿病大鼠脊髓前角運動神經元，運動終板和骨髓肌纖維的形態和功能。
具體實施例方式以下結合實施例及病例對本發明進行詳細說明。
實施例製備工藝為所有操作均在10℃以下完成。
①CM-SephadexC50層析取眼鏡蛇毒10g，溶於0.01M乙酸鈉緩衝液100ml中，PH5.8，溶解後，離心10000轉，10分鐘，取上清，對上述緩衝液5000ml透析，換3次緩衝液，然後樣品上樣子用0.01M乙酸鹽緩衝液平衡好的層析柱5.5×100cm中，用0-0.7MNaCL線性梯度洗脫，收集具有神經生長因子活性的蛋白峰，濃縮凍幹。
③CM-SpharoseFF層析將上述濃縮的樣品，溶於20ml0.01M乙酸鈉緩衝液中，PH5.8，上樣於用0.01M乙酸鈉緩衝液PH5.8平衡好的層析柱2.6×50cm中，用0-1MNaCL線性梯度洗脫，收集具有神經生長因子活性的蛋白峰，濃縮凍幹。
③SephdexG75層析將上述CM-SpharoseFF層析下的樣品，溶解在10ml0.01M乙酸鈉緩衝液，PH5.8，內含0.15MNaCL中，離心10000轉，取上清，上樣於用0.01M乙酸鈉緩衝液，PH5.8，內含0.15MNaCL平衡好後的SephdexG75柱中，收集含有NGF活性的對稱峰，經電泳及高效液相色譜證明為單一峰後，透析除鹽，凍幹即得半成品，約3mg。
④製劑處方原料神經生長因子半成品，按質量標準的測定半成品的活性，每支規格1000單位，按140％投料。加入1％右旋糖苷(分子量1萬)，及每支藥中含有1.5mg人血白蛋白，過濾分裝，凍幹製得。
臨床病例112例均為住院治療者，男58例，女54例。年齡40～65歲，平均53.8歲。糖尿病史1年～14年，平均7.5年。神經病變病程6個月～5年，平均3.4年。全組除2例為胰島素依賴型糖尿病外，其餘均為非胰島素依賴型糖尿病。為觀察感覺神經症狀，特設對照組40例，男女各20例。年齡42～66歲，平均54.2歲。神經病變病程8個月～6年，平均4.2年。此組均為非胰島素依賴型糖尿病。
糖尿病的治療方法是兩組均在飲食治療基礎上加用降血糖藥物，治療組2例用胰島素，其餘均用中藥消渴丸或世良降糖散治療。
神經病變的治療，治療組用蛇毒酶神經生長因子，每日1u，溶於生理鹽水250ml中靜滴，3周為1療程，必要時用第2療程。對照組用vit B130mg/d，vit B12150mg/d，口服。
觀察項目(1)、空腹血糖水平。(2)、感覺神經症狀(肢體疼痛及麻木)的變化。(3)、治療組中40例觀察治療前後右尺神經和右腓神經的傳導速度。(4)、療效判定，顯效症狀完全消失，肌電圖示運動神經傳導速度明顯增快。有效症狀減輕，運動神經傳導速度增快。無效病情無變化。
結果感覺神經症狀，治療組用蛇毒酶神經生長因子後，第4～10天症狀開始改善，一般上肢恢復先於下肢，肢體近端先於遠端，兩組對比，具有明顯的差別，見表1。
表1 兩組感覺神經症狀有效率比較(％)疼 痛 麻 木n顯 有 無有效 n顯 有 無 有效效 效 效 率 效 效 效率治療112 42 68 2 98.2112 26 86 0 100組對照4005 3512.540063415組運動神經傳導速度，40例採用1500 DISA型肌電圖機，觀察尺神經和腓神經傳導速度。治療組經治療後神經傳導速度明顯增快。見表2。
表2 治療前後運動神經傳導速度比較(m/s)尺神經X±S 腓神經X±S治療前 53.04±7.62 44.06±8.50治療後 56.66±8.46 46.36±7.64P值 ＜0.05 ＜0.05血糖變化，經治療後兩組血糖平均有不同程度的下降，治療組治療前後分別為17.2±6.4mmol/L和9.6±6.6mmol/L(p＜0.05)；對照組治療前後為18.2±8.4mmol/L和10.7±7.6mmol/L(p＜0.05)。促進神經元增大，調節糖代謝，改善微循環。
用法和用量及給藥途徑①每次1000-2000單位，肌肉注射，每日一次，20天為一個療程。
②四肢損傷手術中，可在術局部噴灑給藥或損傷神經處局部注射，每次1-2支。
權利要求
1.治療糖尿病合併周圍神經病變併發症的蛇毒酶神經生長因子，其特徵是製備工藝為所有操作均在10℃以下完成，①CM-SephadexC50層析取眼鏡蛇毒10g，溶於0.01M乙酸鈉緩衝液100ml中，PH5.8，溶解後，離心10000轉，10分鐘，取上清，對上述緩衝液5000ml透析，換3次緩衝液，然後樣品上樣於用0.01M乙酸鹽緩衝液平衡好的層析柱5.5×100cm中，用0-0.7MNaCL線性梯度洗脫，收集具有神經生長因子活性的蛋白峰，濃縮凍幹，②CM-SpharoseFF層析將上述濃縮的樣品，溶於20ml0.01M乙酸鈉緩衝液中，PH5.8，上樣於用0.01M乙酸鈉緩衝液PH5.8平衡好的層析柱2.6×.50cm中，用0-1MNaCL線性梯度洗脫，收集具有神經生長因子活性的蛋白峰，濃縮凍幹，③SephdexG75層析將上述CM-SpharoseFF層析下的樣品，溶解在10ml 0.01M乙酸鈉緩衝液，PH5.8，內含0.15MNaCL中，離心10000轉，取上清，上樣於用0.01M乙酸鈉緩衝液，PH5.8，內含0.15MNaCL平衡好後的SephdexG75柱中，收集含有NGF活性的對稱峰，經電泳及高效液相色譜證明為單一峰後，透析除鹽，凍幹即得半成品，④製劑處方原料神經生長因子半成品，按質量標準的測定半成品的活性，每支規格1000單位，按135％-145％投料，加入1％右旋糖苷，及每支藥中含有1.5mg人血白蛋白，過濾分裝，凍幹製得。
全文摘要
治療糖尿病合併周圍神經病變併發症的蛇毒酶神經生長因子，涉及一種治療糖尿病合併周圍神經病變併發症的藥物，尤其是指利用生物活性物質提取配製而得的藥物。從產率、比活性等技術參數優選眼鏡蛇毒作為分離純化神經生長因子的基料，經三步層析，提純單一組份的神經生長因子。利用生物活性物質改善神經組織中的糖代謝，促進神經元增大，使軸突從近端向遠端生長，使細胞器數量增多，從而改善神經細胞功能。改善微循環，蛇毒酶神經生長因子含有精氨酸脂酶、水解蛋白酶及磷酸二脂酶等，能抑制血小板聚集，改善血液粘度，具有溶栓、擴血管等功能。可廣泛應用。
文檔編號C07K14/48GK1470528SQ0313347
公開日2004年1月28日 申請日期2003年6月17日 優先權日2003年6月17日
發明者郝文學 申請人:郝文學