精子活力的調節的製作方法

2023-04-23 07:32:56

專利名稱：精子活力的調節的製作方法
技術領域：
本發明涉及精子的活力(motility)，更具體地涉及提高精子活力的方法。 背景4支術
精子活力不足是雄性哺乳動物(例如人)不育的常見原因。因而，提高精 子活力的簡單無毒的方法將提供令人高度期望的對不育中的精子活力不足 的治療。

發明內容
本發明人已經發現使來自人精子活力不足(asthenozoospermic)的受試者 的精子體外暴露於腺苷5'-三磷酸(ATP)提高了精子運動的前進速度 (progressive velocity)和直線性(linearity)。因此本發明的特徵為通過使精子暴 露於細胞外的ATP來提高精子活力的方法以及使用ATP處理過的精子進行 人工受精和體外受精(IVF)的方法。
更具體而言，本發明^是供了一種提高哺乳動物精子活力的方法。該方法 包括使來自哺乳動物受試者的精子與細胞外的腺苷5'-三磷酸(ATP)接觸。在 所述接觸之前，來自所述哺乳動物受試者的多個精子已經被鑑定為具有降低 的活力。所述哺乳動物受試者可以是例如人受試者或馬科動物受試者。所述 精子可以得自精子活力不足的受試者。所述接觸可包括在其中溶有ATP的生 理培養基中培養精子。此外，所述接觸可以達約IO分鐘至約120分鐘，例 如達約60分鐘。在所述接觸初始時細胞外ATP的濃度可以為約100pM至約 5mM,例如約2.5mM。所述接觸可以在約18。C至約37°C,例如在約37。C。 在所述接觸之前，所述精子可以基本上已經與精漿分離。在所述接觸之後， 可以評定精子的活力。此外，所述接觸可以在雌性哺乳動物的生殖道 (reproductive tract)中進行，以及所述雌性哺乳動物可以是人或馬科動物受試 者。
本發明的特徵還為 一種使哺乳動物卵子(egg)受精的方法。所述方法包括
4使哺乳動物卵子與已經經歷了上述提高哺乳動物精子活力的方法的哺乳動 物精子接觸。所述哺乳動物卵子的接觸可以在體外發生，以及在哺乳動物卵 子的接觸和經接觸過的卵子已經受精並成為胚胎之後，可以將所述哺乳動物 卵子置於哺乳動物子宮內。可選擇地，所述哺乳動物卵子的接觸可在體內例 如在雌性生殖道中發生。所述哺乳動物精子可以是人的精子以及所述哺乳動 物卵子可以是人的卵子。此外，所述哺乳動物精子可以是馬科動物的精子以 及所述哺乳動物卵子可以是馬科動物的卵子。所述精子可以得自精子活力不 足的受試者。
本文所用術語"ATP"是指腺苷5'-三磷酸。它包括酸形式以及鹽，例如但 不限於腺苷5'-三磷酸二(三)鹽二水合物(5'-ATP-二(三)鹽)；腺苷5'-三磷酸二 鉀鹽二水合物(5'-ATP-K2);腺芬5'-三磷酸二鈉鹽(ATP二鈉鹽)；腺苷5'-三磷 酸二鈉鹽一水合物(ATP 二鈉鹽一水合物)；腺香5'-三磷酸鎂鹽(ATP鎂鹽)； 及耐水解的ATP類似物例如腺苦5'-(3-硫代三磷酸)四鋰鹽(ATPYS)和腺苷 5'-((3j-亞氨基)三磷酸四鋰鹽(AppNHp, AMP-PNP)。
應理解的是，在本文所述的本發明所有方法中，ATP可被尿苷-5'-三磷 酸(UTP，包括與上面針對ATP列出的那些形式相對應的化學形式)代替。
在本文中術語"精子(spermatozoon)"和"精子(spermatozoa)"與術語"精子 (sperm)"互換使用。
除非另外指出，本文中所用的所有科技術語具有與本發明相關的領域內 的普通技術人員所通常理解的含義相同的含義。當發生沖突時，以本文件(包
材料用於本發明的實施或試驗中，但是下文描述了優選的方法和材料。本文 提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻均整體併入本文作為參 考。本文披露的材料、方法和實例僅用於說明並不旨在受限於此。
基於下面的說明、附圖和權利要求書，本發明的其它特性和優點(例如 提高精子活力)將是顯然的。


圖1是利用自動細胞運動分析儀觀察到的活動精子所採取的軌跡的圖 示。圖中說明了術語VSL、 VCL、 ALH、 VAP、中位軌跡(median trajectory), 曲糹戔4九跡(curvilinear trajectory)和直糹戔運動。圖2是一系列棒圖，顯示了在具有或不具有細胞外ATP的條件下已經 培養1小時的精子(來自27位精子活力不足的男性受試者)的平均直線速度 (mean straight line velocity(VSL)， 見圖2A)、 平均曲線速度(mean curvilinear velocity(VCL)，見圖2B)、平均直線性(mean linearity即LIN,見圖2C)和外 側頭位移(lateralheaddisplacement(ALH),見圖2D)。所示的P值是通過斯氏 t試驗由標準偏差確定的。
具體實施例方式
部分基於本發明人的上述發現，本文提供了提高哺乳動物精子活力的方 法和利用所述精子進行哺乳動物授精的方法。 提高哺乳動物精子活力的方法
此處提供了提高哺乳動物精子活力的方法。所述方法包括使來自哺乳動 物受試者的精子與細胞外ATP源接觸。所述精子通過本領域已知的方法來源 於相關物種的雄性受試者，包括作為雄性受試者射出的精液的一種組分。作 為選擇，可通過從所述雄性受試者的輸精管、附睪或睪丸抽吸來取出精子。 所述精液優選是在克制射精一段時間(例如，6小時、12小時、l天、2天、 3天，4天、5天、7天、10天、12天、14天或更長)後獲得的。在與ATP 接觸之前，可以任選地通過標準方法(例如實施例1中所述的一種方法)洗滌 精子，從而使精子與ATP的接觸在基本上不含精液(seminal fluid)的溶液(例 如培養基)中進行。本文所用的"基本上不含精液"是指包含低於10%(例如低 於8%; 6%; 4%; 2%; 1%; 0.1%或0.001%)源於精液的組分(例如蛋白質、 脂質或者核酸)，所述源於精液的組分出現在用於獲得所述精子的精液中。
雄性哺乳動物受試者可以是任何哺乳動物，包括人(例如人類患者)，非 人類的靈長動物(例如猴、猩猩或猿)，馬科動物受試者(例如馬、驢或斑馬)， 豬，山羊，牛科動物(例如公牛)，綿羊，狗，貓，兔，豚鼠，倉鼠，沙鼠，
大鼠或者小鼠。
一般而言，所述哺乳動物受試者將是其精子具有低於正常直線速度(前 進速度)並因此是相對不育的哺乳動物。本文所用的"正常直線速度"是該物種 能育雄性受試者(即，其精子不具有明顯喪失的使與所述精子相同物種的卵 子受精的能力的受試者)的精子所呈現的直線速度。然而，應理解的是，所 述方法也可用於來自看上去上完全正常的受試者(例如其精子不具有明顯喪失的使合適的卵子受精的能力但希望提高其受孕可能性的受試者)的精子。
在所述4妄觸之前，可以任選地對來自所述受試者的多個(例如，5、 10、 15、 20、 30、 40、 50、 70、 100、 200、 500、 800、 1000、 2000、 5000、 10000
或更多個)精子進行活力(即，正常的、增高的或降低的活力)測試。以該方式 測試的精子可以從與用於獲得與ATP接觸的精子相同的精液樣品獲得或者 從與所述受試者的精液不同的樣品獲得。此外，在所述接觸之後，可以任選 地針對活力對所述精子的數目進行測試，目的是測試所述接觸的效力。本文 所用的、應用於精子的術語"活力"指的是直線速度或前進速度，兩者均用縮 寫"VSL"進行指定(參見實施例1)。與活力不同，可以在所述接觸之前和之後 測量直線性(即，精子軌跡的筆直程度)。
所述接觸可以在體外或體內進行。當所述接觸在體外進行時，將精子(通 常作為多個精子之一)培養在處於各種溫度中的任意溫度(例如，在約15。C至 約39。C，在約17。C至約38°C，在約18。C至約37°C，在約34。C,在約35。C, 在約36。C，在約37。C，或者在約38。C)的生理培養基(例如，組織培養基)中。 這些溫度的上下文中所用的術語"約"是指所述溫度可偏離所指出的溫度至 多2°C。所述生理培養基可以是其中哺乳動物精子可以保持活力並保持其4受 精能力的任意培養基。合適的培養基的實例包括BWW培養基或Dulbecco 改良的Eagle培養基(DMEM)。可將各種培養基增補劑(supplement)中的任意 一種增補劑加至所述培養基中。所述增補劑包括細菌抗生素和真菌抗生素 (例如，青黴素、鏈黴素、慶大黴素和/或兩性黴素B)以及來自相同物種但與 供精者不同個體的血清(即，同種異體的血清)，來自供精者的血清(即，自體 同源的血清)或者來自與供精者不同物種的一個或多個個體的血清(即，異種
的血清)。異種的血清可以是例如胎牛血清(FBS)、馬科動物血清(例如馬血 清)、山羊血清、綿羊血清或者豬血清。用於增補組織培養基的血清優選是 同種異體的血清或自體同源的血清。因此，當供精者是人時，所述血清優選 是人血清；而當供精者是馬時，所述血清優選是馬血清。當使用人血清時， 所述血清優選來自一個或多個具有AB血型的個體。在使用之前，也可對用 作培養基增補劑的血清進行篩選以確定是否存在抗精子抗體。含有可檢測水 平的所述抗體的那些血清將排除使用。其它培養基增補劑包括各種非必需氨 基酸或者必需胺基酸(例如穀氨醯胺)、蛋白質(例如，人或牛的血清白蛋白、 胰島素和運鐵蛋白)、碳水化合物(例如糖類如葡萄糖)、核酸、核苷酸、核苦和/或脂質。
將精子的含精子樣品(優選至少洗滌一次以基本上除去精液)與培養基
結合。可以在培養基與精子混合之前已經將ATP加至培養基中，或者可以在 培養基與精子混合之後將ATP加至培養基中。加入的ATP使得初始濃度(即， 在培育ATP/精子/生理溶液混合物之前的濃度)為約100 mM至約10mM,即， 約100 pM至約5mM，約500 pM至約5mM,約1 mM至約5mM，約1 mM 至約2.5mM,約1 mM，約2 mM，約2.5mM或者約3 mM。在這些ATP濃 度的上下文中，術語"約"說明所述濃度可以以所指出的值的至多約10%變化。 可用的ATP的化學形式包括所有上述的那些形式。
在將精子、ATP和生理培養基混合之後，將所得的混合物在上面列出的 溫度中的一個或多個溫度培育任意寬範圍的時間，例如，培育約5分鐘至約 180分鐘、約IO分鐘至約150分鐘、約IO分鐘至約120分4中、約20分鐘至 約120分鐘、約30分鐘至90分鐘、約30分鐘至約60分鐘、約120分鐘、 約90分鐘、約60分鐘或約30分鐘。在這些時間段的上下文中，術語"約" 說明所述時間可以以所指出的值的至多約20%變化。在培育之後，精子的含 並青子群(spermatozoon-containing population)可以用於各種4受津青方'法(參見下文) 中的任意一種中，任選地在用生理溶液(例如生理鹽水、磷酸緩衝鹽水(PBS) 或者組織培養基)洗滌之後。
精子與ATP在體內的接觸可以通過將含ATP的組合物和精子的含精子 樣品遞送至雌性生殖道中來實現。因此，例如在相關物種的;^性受試者和雌 性受試者性交之前或者緊接其後將含ATP的組合物置入所述雌性受試者的 陰道中。可選擇地，將精液或者經洗滌基本上不含精液的精子人工灌入或注 入到所述雌性受試者的陰道中。 一般而言，在將精子遞送至雌性生殖道之前 或之後不超過約60分鐘、約45分鐘、30分鐘、20分鐘、10分鐘、5分鐘、 2分鐘或1分鐘時將所述組合物置入。在這些時間段的上下文中，術語"約" 說明所述時間可以以所指出的值的至多約10%變化。在這些方法中，遞送至 雌性陰道中的精子與ATP接觸。自然地，雌性物種可以是上面作為精子來源 的供精者列出的物種中的任一物種。作為精子來源的^M生和向其生殖道中遞 送精子的雌性通常是同一物種，但這不是必須的。
遞送至雌性生殖道(例如，通過施力o(application)、灌入或注入)的ATP組 合物可以採用下面的形式，例如散劑、顆粒劑、片劑、膠嚢劑、錠劑(troche)、液體(例如洗劑)、凝膠劑、軟膏劑、乳膏劑或者乳劑。當採用液體、凝膠劑、
軟膏劑、乳膏劑或者乳劑形式時，所述ATP可以是溶解的或在懸浮液中，並 且其在組合物中的濃度一般與上面針對精子和ATP體外接觸所列出的濃度 相同。所述組合物通常包含ATP和可藥用載體。本文所用的"可藥用載體" 包括與藥學給藥相容的溶劑、^:介質、包衣(coating)、抗菌劑和抗真菌劑、 等滲劑和吸收延遲劑(absortion delaying agent),等等。也可將增補的活性化 合物結合到所述組合物中。
所述組合物優選是無菌的。其在製造和存儲條件下應該是穩定的，且應 防腐保存以防止微生物如細菌和真菌的汙染作用。所述載體可以是含有例如 水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)或者它們的合適混 合物的溶劑或分散介質。例如，可以通過使用包衣例如卵磷脂、通過在^t 情形下保持所需的顆粒大小以及通過使用表面活性劑來維持適當的流動性。 可通過各種抗菌劑和抗真菌劑來實現防止微生物的作用，所述抗菌劑和抗真 菌劑為例如對羥基苯曱酸酯類(paraben)、氯丁醇(chlorobutanol)、苯酚 (phenol)、抗壞血酸(ascorbic acid)、硫柳汞(thimerosal)等。在許多情形時，常 常期望在所述組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇(例如甘露醇和山梨糖 醇)以及氯化鈉。在散劑情形下，製備方法可包括真空乾燥或冷凍乾燥，這 從其溶液中產生活性成分加上任何其它所期望的成分的散劑。
所述散劑、顆粒劑、片劑、膠嚢劑和錠劑包含1。/o至95。/o(w/w)的活性化 合物。在一些實施方案中，所述活性化合物的範圍為5。/。至70。/。(w/w)。合適 的載體是碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、果膠、糊精、澱粉、明膠、 黃蓍膠、曱基纖維素、羧曱基纖維素鈉、低熔蠟(lowmeltingwax)、可可油， 等等。術語"製劑"旨在包括以封裝材料作為載體的活性化合物的劑型，提供 如下膠嚢，在所述膠嚢中，具有或不具有其它載體的活性組分被載體包圍， 所述載體因此與所述活性組分結合。
可通過將ATP溶於水中並按需要加入合適的著色劑、穩定劑和增稠劑 來製備水溶液。可用粘性物質(例如天然膠或合成膠、樹脂、曱基纖維素、 羧曱基纖維素鈉和其它公知的懸浮劑)將微細粉碎的活性組分分散在水中來 製備水性混懸劑。
所述組合物也可以製備成栓劑形式(例如， -使用常規的栓劑基底 (suppository base)如可可油和其它的甘油酯)或者製備成用於陰道遞送的持留灌腸劑(retention enemas)形式。
在一個實施方案中，將ATP與載體一起製備，所述載體將保護所述化 合物免於從身體快速消去，例如控制釋放製劑，包括植入物和微嚢遞送系統。 可使用可生物降解性、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚 酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。製備上述製劑的方法對本領域的 4支術人員來i兌是顯而易見的。材料也可從Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc商購。脂質體混懸液也可用作可藥用載體。這些可才艮據 本領域技術人員已知的方法(例如在美國專利4,522,811中所述的方法)製備。
為了易於給藥和使劑量一致，有利的是可以劑量單位形式配製組合物。 本文所用的劑量單位形式指的是對於治療的受試者適於作為單元劑量的物 理上離散的單位；各單位包含預定量的ATP,對所述預定量進^f亍計算以與所 需的藥用載體結合產生所期望的活力提高效果。劑量單位還可附有用法說明 書。
本文還提供了製品，其包含含有ATP和包裝材料的容器和/或遞送媒介 物(例如瓶、小瓶(vial)、膠嚢或藥片)和/或包裝嵌入物(insert),所述包裝嵌入 物含有如何實施上述提高精子活力的方法中任一種方法的說明書。
授精方法
如上所指出，已經體外與ATP接觸的精子群中的精子可用於本領域已 知的各種IVF和人工受精方法中的任種一方法中。這樣的方法的實例詳細描 述於Hall等人的(1997) Sa/〃&my C7/w. (7;/""eco/. 11:711-24; Van
Steirteghem的(1994) CWr. Op/w. 06"". G^weco/. 6:173-177;以及Van Voorhis 的(2007)W.人iV/ed 356:379-386中，將它們公開內容整體併入本文作為
參考。 '
在用於這些方法—之前，可任選地(但不是必須地)清洗精子從而使其不含 或者基本上不含含有ATP的生理培養基。本文所用的"基本上不含含有ATP 的生理培養基"是指包含少於10%(例如，少於8%; 6%; 4%; 2%; 1%; 0.1%或0.001°/。)用於使精子與ATP接觸的含ATP的生理培養基。
實質上，IVF方法牽涉培育來自任一上面所列物種的雌性受試者的卯子 與來自相同物種的任一雄性受試者的、並且已經經歷上述活力提高方法的精 子。在培育之後，將在精子穿入一個或多個卵子後發育成的一個或多個胚胎 置入雌性受試者的子宮中，所述受試者是(通常但非必須)最初從其獲得卵子的受試者。同樣，精子的雄性供體和卵子的雌性供體可以是上面所列物種中 的任一種。通常但不是總是，所述雄性和雌性是同一物種。
一般而言，在卵
子被精子穿入的16-24小時後，出現精子和卵核的熔合(即，形成受精卵)。 在精子穿入卵子的約48小時後，形成胚胎即通常含有兩個細胞的結構。在 該階段或者在胚胎成熟的稍後階段(精子穿入卵子後的至多5天)，將胚胎移 至雌性受試者的子宮中。在轉移之前，可通過本領域內技術人員熟悉的方法 對卵子的受精和隨後胚胎的形成進行測試。
人工受精方法包括，例如，將已經經歷上述活力提高方法的精子遞送至 雌性受試者的生殖道(例如，陰道和/或子宮)。在這種情形下，希望所述精子 會與由雌性受試者所產生的卵子接觸並使之受精。同樣，精子的雄性供體和 雌性受試者可以是上面列出物種中的任一種。通常但不是總是，所述雄性和 雌性是同一物種。
下面的實施例用於說明而非限制本發明。
實施例
實施例1:材並+和方法 精子活力
根據世界衛生組織(WHO)實驗室手冊[用於檢查人的精液和精子-子宮 頸粘液相互作用的世界衛生組織(1999) WHO實驗室手冊，第128頁。劍橋 大學出版社，劍橋，其公開內容整體併入本文作為參考]標準對精子活力按a 至d的等級進行評級，如下所述
等級a(快速前進)精子以直線形式快i4向前遊動；
等級b(緩慢前進)精子向前遊動，但是以曲線形式或歪斜形式遊動， 或緩慢遊動(緩慢的線性或者非線性的活動(motility));
等級c(不前進)精子移動其尾部，但不向前移動(只是原地活動)；以及
等級d(不遊動的)精子根本不動。
"快速"和"緩慢"是精子運動的定性特徵，其是由觀察樣品的操作者基於 他或她^r查精子的經^r來確定。
認為低百分率的等級a和b活力和高百分率的等級c和d表明了弱的精 子授精能力。
患者選擇分析了因不育而求助於男科中心(帕多瓦大學，內^"與外科科學系，內
分泌學部分)的27位精子活力不足而其它方面健康的男性的精子。本文所用 術語"精子活力不足的"指的是其具有活力等級a的精子的百分數加上具有等 級b的精子的百分數低於50%的雄性受試者。來自所有受試者的精液樣品的 等分試樣的培養物都顯示樣品沒有細菌汙染，並且在上述任一受試者的精液 中均未檢測到抗精子抗體。 精子特徵如下
精子活力等級a的百分數+等級b的百分數(用光學顯微鏡評價)< 50%。
精液中的精子濃度220 x 106/ml
具有正常形態學的精子2 30%
精子存活率(viability): 2 50%
實驗方案
節慾3天後，將精液樣品收集在無菌的容器中。在室溫時液化30分鐘 之後，根據WHO實驗室手冊[同上]檢查標準精液參數。
對於精子移動分析，將精液等分試樣(IO pl)置於Makler室，隨機檢查每 室的10個不同區域(field)，並且就所述室的每個區域而言對至少100個精子 進行評分。利用自動分析儀(37°C) (CellTrack VP1 10，美國加州Palo Alto的 Motion Analysis Corporation)對能遊動的精子的百分悽t和移動特性進行分析。 僅對能遊動的精子進行精子速度和動態參數的評價，並表達為平均值。計算 標準偏差並通過斯氏t檢驗(Stuents，s West)確定顯著性P值。
確定下面的精子參數
曲線速度(VCL)，也稱為軌跡速度，並且是精子沿各軌道的速度(單位為 (j_m/s);
直線前進速度(VSL),是從軌道的起點到終點以直線測量的平均速度(單 位nm/s);
外側頭位移(ALH)的幅度，是精子頭部擺動的平均寬度(單位拜)；以及
直線性係數(linearity coefficient)(LIN = VSL/VCL x 100)，是精子軌跡的 筆直程度(單位％)。
這些參數圖表形式顯示於圖1中。在圖1中，VAP指的是平滑精子路線 的平均速度(lim/s)。
為了分析細胞外ATP對來自精子活力不足的受試者的精子活力參數的作用，通過如下方式將來自該受試者的精子樣品進行一次洗滌添加BWW 培養基(Biggers-Whitten-Whittingham培養基；95mMNaCl， 4.8mMKCl， 1.7 mM CaCl2, 1.2 mM KH2P04, 1.2 MgS04， 25 NaHC03, 5.6 mM果糖，0.25 mM 丙酮酸鈉，3.7 ml/1的60%乳酸鈉糖漿，104 IU/ml青黴素，以及10 mg/ml 鏈黴素)，並以800xg離心10分鐘。離心後棄去上清液，將精子沉澱小5求 以濃度10x 1(^個精子/毫升懸浮於BWW培養基中，分成兩等分，並^f吏它們 恢復15分鐘。然後將一等分試樣用ATP(2.5mM的最終濃度，由100mM母 液通過用生理溶液(0.9%的NaCl蒸餾水溶液)稀釋ATP而製備)在37。C培育， 而另一等分試樣僅用相同量的生理溶液在37。C培育(作為陰性對照)。在培育 60分鐘之後，如上所述確定精子活力參數。
實施例2:用細胞外ATP處理來自精子活力不足的受試者的精子 檢查了細胞外ATP對如下精子的精子活力參數的作用，所述精子來自 患有精子活力不足症受試者，洗去精液後懸浮於BWW培養基(10x 106個精 子/毫升)。
精子活力不足的受試者的精子在2.5mM的ATP存在下培育60分鐘改 進了精子的活力參數，包括前進速度(對照23.81±6.04 pM/s， ATP: 28.85±7.27 pm/s; pi.0024)以及直線性(對照29.59±6.25， ATP: 37.7士7.9; p-0.0004)(參 見圖2)。在ATP處理(2.5mM)後未觀察到ATP處理對曲線速度和精子外側頭 位移的顯著影響。
因此看來，來自精子活力不足的受試者的精子的ATP處理提高了精子 活力特性。這些發現對ATP如何提高人IVF成功率提供了機械學支持，並 說明使精子培育暴露於細胞外ATP對於不育可以是一種有用且無毒的治療。
已經描述了多個本發明的實施方案。但是，應理解在不偏離本發明的精 神和範圍的條件下可進行各種修改。因此，其它實施方案在所附的權利要求 書的保護範圍內。
權利要求
1.一種提高哺乳動物精子活力的方法，該方法包括使來自哺乳動物受試者的精子與細胞外腺苷5′-三磷酸(ATP)接觸。
2. 權利要求1的方法，其中，在所述接觸之前，來自所述哺乳動物受 試者的多個精子經鑑定為具有降低的活力。
3. 權利要求1或2的方法，其中所述哺乳動物受試者是人受試者。
4. 權利要求1或2的方法，其中所述哺乳動物受試者是馬科動物受試者。
5. 權利要求1至4中任一項的方法，其中所述接觸包括在其中溶有ATP 的生理培養基中培養精子。
6. 權利要求1至5中任一項的方法，其中所述接觸達約IO分鐘至約120 分鐘。
7. 權利要求1至6中任一項的方法，其中所述接觸達約60分鐘。
8. 權利要求1至7中任一項的方法，其中在所述接觸初始時細胞外ATP 的濃度為約lOOpM至約5mM。
9. 權利要求1至8中任一項的方法，其中在所述接觸初始時細胞外ATP 的濃度為約2.5mM。
10. 權利要求1至9中任一項的方法，其中所述接觸在約18。C至約37 'C進行。
11. 權利要求1至10中任一項的方法，其中所述接觸在約37。C進行。
12. 權利要求1至11中任一項的方法，其中在所述接觸之前，所述精 子基本上與精漿分離。
13. 權利要求1至12中任一項的方法，其中在所述接觸之後，對精子 活力進行評定。
14. 權利要求1至4中任一項的方法，其中所述接觸發生在雌性哺乳動 物的生殖道中。
15. 權利要求14的方法，其中所述雌性哺乳動物為人。
16. 權利要求14的方法，其中所述雌性哺乳動物為馬科動物受試者。
17. —種使哺乳動物卵子受精的方法，該方法包括使哺乳動物卵子與已 經經歷權利要求1-16中任一項的方法的哺乳動物精子接觸。
18. 權利要求17的方法，其中所述哺乳動物卵子的接觸在體外發生。
19. 權利要求17的方法，其中在哺乳動物卵子的接觸和接觸過的卵子 已經受精並成為胚胎之後，將所述哺乳動物卵子置於哺乳動物子宮內。
20. 權利要求17的方法，其中所述哺乳動物卵子的接觸在體內發生。
21. 權利要求20的方法，其中所述哺乳動物卵子的接觸在雌性生殖道 內發生。
22. 權利要求17至21中任一項的方法，其中所述哺乳動物精子是人的 精子，所述哺乳動物卵子是人的卵子。
23. 權利要求17至21中任一項的方法，其中所述哺乳動物精子是馬科 動物的精子，所述哺乳動物印子是馬科動物的卵子。
24. 權利要求1至16中任一項的方法，其中所述精子得自精子活力不 足的受試者。
25. 權利要求17至23中任一項的方法，其中所述精子得自精子活力不 足的受試者。
全文摘要
本發明披露了提高哺乳動物精子授精能力的方法，包括使所述精子與腺苷5′-三磷酸接觸，以及披露了使用所述方式處理過的精子進行授精的方法。
文檔編號G01N33/483GK101688859SQ200880013833
公開日2010年3月31日 申請日期2008年2月27日 優先權日2007年2月27日
發明者古列爾莫·伯納尼, 弗朗西斯科·蒂弗吉裡奧, 馬科·羅薩託 申請人:達斯卡科技公司