與黃瓜雌性性狀相關的分子標記及其應用的製作方法

2023-04-23 05:50:21

專利名稱：與黃瓜雌性性狀相關的分子標記及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子標記育種技術領域，具體涉及一種與黃瓜雌性性狀相關 的分子標記、該分子標記的獲得方法及該標記在黃瓜雌性選育中的應用。
背景技術：
黃瓜是世界上栽培面積最大的蔬菜作物之一。黃瓜植株性別表達類型豐 富，雌性系黃瓜是指植株只長雌花而不長雄花或長極少量雄花的品系，往往 表現出早熟、瓜密、豐產等優點。利用雌性系制一代雜種無需去雄，節約了 勞動力，降低了制種成本，所製成的一代雜種純度很高。用雌性系作母本配 制的一代雜種也多表現早熟、雌花多、採瓜期集中、豐產等優點。因此，雌 性系的選育與應用便成為黃瓜育種中一個重要的研究內容。
目前，我國至少有80%以上的黃瓜品種實現了雜種一代優勢利用，並且相 應地育成了一批雌性、強雌性雜種一代品種。但我國黃瓜生產上FJ戈制種仍主 要採用化學(AgN03)去雄、人工去雄法來進行，因此雌性系的選育工作進 展較慢，迫切需要在黃瓜性別決定基因的遺傳規律、雌性基因的分子標記輔 助選擇等工作上有所突破，從而加速強雌材料的選育與利用。
隨著乙烯的生物合成、信號轉導途徑研究的深入，從分子水平上深入研 究黃瓜性別決定機製成為可能。研究發現，ACC合酶是乙烯生物合成過程中 的關鍵酶，因而ACC合酶在高等植物性別表達過程中起著重要作用。乙烯不 敏感轉錄調節基因(ethylene insensitive 3， EIN3)是定位在細胞核上的乙烯信號 轉導下遊元件，其編碼的EIN3蛋白定位在核內，與乙烯反應相關基因的啟動 子特殊序列結合，並激活這些基因的表達。EIN3基因不是通過乙烯直接誘導， 而是通過乙烯在蛋白質水平上進行調節。因此，從乙烯合成酶關鍵基因和乙 烯信號轉導基因為切入點，篩選用於植物性別分化研究和分子標記輔助選擇 育種的分子標記無疑是很有意義的。
單核苷酸多態性(SNPs)是指染色體基因組水平上由單個核苷酸變異引起
的DNA序列多態性,是繼限制性酶切片斷長度多態性(RFLP， restriction fragment length polymorphism)、可變數量重複序歹ll (VNTR， variable number of tandem repeat)禾M散衛星多態性(microsatellite polymorphism)之後的新一代 多態性遺傳標記，已漸漸成為與分子標記有關各領域研究的焦點。作為第三 代遺傳標記，具有分布廣、密度高、多態性豐富等特點，且由於具有能直接 反映植物基因DNA水平上的差異、其測定過程不受植物發育階段的影響等優 點，近十年來已被越來越多地用於植物性別分化研究和分子標記輔助選擇育 種中。

發明內容
本發明的目的之一在於克服現有黃瓜雌性系選育方法落後、效率低的不 足，提供一種用於黃瓜雌性系選育的雌性性狀相關分子標記。
與黃瓜雌性性狀相關的分子標記，是EIN3基因在153bp和501bp處發生
兩個單核苷酸的變異(SNP)。其中純雌株帶有015鄉和T5。,bp特異性鹼基或兩 者之一，兩性花株帶有A,53bp或A訓bp。
本發明目的之二在於提供與黃瓜雌性性狀相關的分子標記的獲得方法。 該方法包括以下步驟
1、 按常規方法進行材料培養和黃瓜性別的鑑定；
2、 採用改進的CTAB法提取黃瓜幼嫩葉片基因組DNA，即在提取過程 中分別用1%CTAB、 5MKAc禾口 1MNaCl處理。
3、 根據EIN3與EIL基因mRNA的保守序列設計引物進行PCR擴增， 引物為上遊引物5，一ttggagaggaggatgtggag—3，，下遊引物5'—ataata gcaagccaggtagc—3'。
PCR擴增的反應程序為94。C預變性5min， 94°〇變 性lmin、 60。C退火lmin、 72。C延伸2min，共40個循環後於72。C延伸7min。
4、 PCR產物的克隆測序以及測序結果的比對分析，結果表明WI1983G 和WI1983H的EIN3基因序列基本相同，只是在153bp和501bp處發生兩個
單核苷酸的變異(SNPS)，分別為G!53bp和A^bp、 T訓bp和A501bpO
5、 設計引物在親本及F2群體中進行驗證，它包括兩組引物，其中引物組
I上遊引物具有序列表中SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列，引物組I下遊引 物具有序列表中SEQ ID N0.4所述的核苷酸序列，引物組II上遊引物具有序 列表中SEQ IDN0.5所述的核苷酸序列，引物組II下遊引物具有序列表中SEQ IDN0.6所述的核苷酸序列。
6、群體驗證結果表明通過引物組I擴增後性狀為全雌性的植株擴增產 物為382bp左右，而兩性花株在相應位置沒有出現擴增產物；通過引物組II 擴增後性狀為全雌性的植株擴增產物為605bp左右，而兩性花株在相應位置 沒有出現擴增產物。
本發明目的之三在於提供該分子標記在黃瓜雌性選育中的應用
1、 提取黃瓜幼嫩葉片基因組DNA，設計引物進行PCR擴增，再進行 PCR產物的克隆測序及測序結果的比對分析，若EIN3基因上帶有G,，p和
T5(Hbp分子標記或兩者之一，則可判定該植株為純雌株。
2、 設計用於群體驗證的引物，其中引物組I上遊引物具有序列表中SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列，弓l物組I下遊引物具有序列表中SEQ ID NO.4 所述的核苷酸序列，引物組II上遊引物具有序列表中SEQ ID NO.5所述的核 苷酸序列，引物組II下遊引物具有序列表中SEQIDN0.6所述的核苷酸序列。
若通過引物組I可特異性擴增得到一條382bp大小的條帶或通過引物組 II可特異性擴增得到一條605bp大小的條帶，即可判定該黃瓜植株為純雌株。 本發明的技術方案能產生以下技術效果
通過引物組I和引物組II擴增後只有性狀為全雌性的植株才可擴增得到 特異性產物。說明兩個SNPs伴隨著性狀差異而分離，與控制黃瓜雌性性別表 達密切相關。與主要性別決定基因連鎖的分子標記的獲得，可作為黃瓜雌性 選擇的特異性標記，有利於黃瓜作物性別決定基因標記輔助選擇育種，大大 縮短育種時間。


圖1 F2代部分群體DNA電泳檢測圖
1: Mark 2: 12 3: 4 4: 22 5: 17 6: 102 7: 113 8: 49
9: 55 10: 37 11: 72 12: 33 13: 43 14: 111 15: 149
16: 133 17: 122 18: 138 19: 2 20: 6 21: 51 22: 81
23: 9424: 10725: 118 26: Mark
圖2 PCR擴增產物電泳檢測圖
M: Mark1: WI1983G2: WI1983H 3:
圖3質粒DNA電泳檢測
M: Mark1: WI1983G2: WI1983H 3:
圖4質粒DNA的PCR檢測
M: Mark 1: WI1983G/A2: WI1983H/A 3: F,/A 4: WI1983G/B
5: WI1983H/B6: F'/B
圖5重組質粒DNA的酶切檢測
M: Mark 1: WI1983G 2: 'WI1983H 3: F,
圖6親本、F,代及部分F2代群體PCR產物電泳檢測圖(引物組I)
M:Mark 1:WI1983G 2:WI1983H 3:F,4:15 5:25 6:37
7:46 8:54 9:60 10:70 11:83 12:8513:99 14:115
15:13916:152 17:153
圖7部分F2代群體PCR產物電泳檢測圖(引物組I )
M:Mark 1:9 2:32 3:119 4:134 5:133 6:8 7:18 8:71 9:11 10:3 11:36
圖8親本、F,代及部分F2代群體PCR產物電泳檢測圖(引物組n) M:Mark 1:WI1983G 2:WI1983H 3:F, 4:4 5:37 6:46 7:51 8:949:99 10:100 11:112 12:115 13:126 14:129 15:131 16:133 17:134
圖9部分F2代群體pcR產物電泳檢測圖(引物組n)
M:Mark 1:18 2:35 3:44 4:88 5:77 6:153 7:24 8:39 9:32 10:119 11:2具體實施例方式
實施例l:與黃瓜雌性性狀相關的分子標記的獲得
一、 材料與試劑
純雌株系WI1983G和兩性花株系WI1983H為一對近等基因材料，由威 斯康星大學園藝系美國農業部農業研究中心J.E.Staub教授贈送，其中 WI1983G雌性系來源於WI3122和WI3121雜交後代系統選育的高代自交系。 兩性花株系WI1983H來源於以抗枯萎、兩性花WI2189作為供體與WI1983G 經5代回交3代自交的自交系。F,代為WI1983G與WI1983H的雜交後第一 代。F2代為F,代自交後代，共156株。
10xbuffer、 MgCl2、 dNTP、 TaqE均購自大連寶生物公司；引物由上海生 工合成，均為PAGE級純化。
二、 方法1、 材料的培養和黃瓜性別的鑑定
採用營養缽育苗， 一個月後移栽於防蟲網隔離的大棚內，於先一天下午 進行雄、雌花人工套袋，第二天上午人工雜交或自交。以WI1983G為母本， WI1983H為父本，獲得其雜交組合，獲得它們的F2群體材料。
黃瓜性別的鑑定按以下方法進行:純雌株，在主蔓及側蔓上沒有雄花，所 有的節位均為雌花；雌雄同株，在低節位具有一段較長的雄花節，然後一段 雌雄混合的節位，末端不出現連續的雌花節；雌雄同株型的強雌株(強雌株)， 第1 7節多數為雄花，8 1 l節以上為連續的雌花節，雌花率較高(平均61。^ 63 Q%，而普通的雌雄同株一般為21% 35%)，末端表現連續的雌花節；兩性花 株，全部表現兩性花，果實為大小不等的橢圓形。
2、 基因組DNA的提取
由於黃瓜是含糖量較高的園藝作物，為避免糖類物質的影響，本試驗 採用傳統的CTAB法提取基因組DNA，在提取過程中，還分別用1%CTAB、 5MKAc和1MNaCl處理。具體操作過程如下
2.1稱取3.0g黃瓜幼嫩健康葉片，用雙蒸水洗淨後加液氮於研缽中研磨成粉末。轉入50mL離心管，加入10mL預熱(6(TC )的DNA提取緩衝液(2。/。W/V CTAB， 1.4mmol/LNaCl， 20 mmol/L EDTA， 100 mmol/L Tris-HCl， pH8.0， 0.2% V/V卩-巰基乙醇，1%PVP)中，充分混勻，6(TC水浴60 70min，其間
搖勻幾次；
2.2加入1/3體積的5mol/LKAc (pH4.8)，充分輕柔混勻後，冰浴30 min; 2.3加入等體積氯仿:異戊醇(24: 1)輕柔且充分混勻。靜置10min， 1,5000 rpm離心30 min;
2.4取上清，加入1/10體積的10。/。CTAB溶液，輕柔混勻，6CTC水浴10min 至CTAB徹底溶解；
2.5加入等體積氯仿:異戊醇(24 : 1)混勻，靜置10 min， 1，5000rpm離心 30 min;
2.6取上清，加入0.7體積的冷異丙醇，輕柔搖動離心管充分混勻，置於
-20"301^11或者過夜；
2.7 1，5000rpm離心10min;
2.8小心棄去上清，加入3mL洗滌緩衝液(76。/。V/V乙醇，10mmol/L乙酸 銨)。室溫下靜置30min，間或輕柔搖動； 2.9 1,5000rpm離心5 min; 2.10重複步驟2.8 2.9;
2.11將沉澱轉移至1.5 mLEppendorf管中，加入400 ^tL TE，(過夜放置) 使之溶解；
2.12加入RNAase (100 pg/mL溶液)，37。C水浴2 4h;
2.13加入100 jiL5M的NaCl。混勻後室溫下靜置15 min;
2.14加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)混勻，靜置10min， l,OOOOrpm離
心10 min;
2.15取上清，加入2倍體積95。/。冷乙醇沉澱DNA，輕柔且充分混勻，於-2(TC
放置30min或過夜；
2.16 l，OOOOrpm離心5 min;
2.17棄上清，按步驟(2.15) (2.16)洗滌沉澱一至兩次，然後於空氣中乾燥；
2.18加入200 500jaLddH20，過夜放置使沉澱溶解；
2.19 1,0000rpm離心5 min，取上清測定DNA濃度。餘下保存於-40。C冰箱 中備用。'
3、 DNA樣品的檢測
取5pl DNA原液，上樣於0.8%瓊脂糖凝膠中，以lxTBE為電泳緩衝 液，120V穩壓電泳進樣後，100V穩壓電泳至指示劑距底端約lcm處結束。
提取DNA原液稀釋20倍後，在分光光度計上測定DNA濃度及 OD260/OD28。 OD26o/OD，不足1.8或超過2.0的均進行重新純化。將純化後 的DNA分別稀釋至5-30ng L備用。
4、 獲得外顯子序列的引物設計
根據Genebank所報導的擬南芥、菸草和甜瓜￡/沼與基因mRNA的 保守序列，採用Primer Premier 5.0和Oligo 6軟體設計引物，擴增外顯子序列。 引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成
上遊弓I物5，一ttg gag agg agg atg tgg ag—3 ，
下幼,弓I物5 ，一ata ata gca age cag gta gc—3 ，
5、 PCR擴增
5.1 PCR反應體系
成分 用量
ddH20 12.2nL
10xbuffer(+Mg2+) 2.0pL
dNTP (2.5mM/each) 1.6pL
Forward primer( 15 ng/(iL) 1 .OpL
Reverse primer( 15 ng/^L) 1.0|aL
模板DNA(30隱50 ng/(aL) 2.0(iL
TaqE (5U/pL) 0.2(aL
Total volume 20 混勻後，在反應液上覆蓋一薄層液體石蠟油。
5.2 PCR反應程序
擴增程序為94"C預變性5min， 94。C變性lmin、 60。C退火lmin、 72。C 延伸2min，共40個循環後於72'C延伸7min，反應結束後4。C保存擴增產物。
6、 PCR產物的克隆測序
6.1 PCR產物的純化回收
採用北京天為公司的DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物。
6.2 PCR產物與載體的連接
Taq DNA聚合酶會在3'端加上多餘的非模板依據鹼基，而且對A優先 聚合，所以PCR產物末端的多餘鹼基大部分為A。利用T-Vector上3，端T 與PCR產物末端A互補並進行連接，採用Promega公司的pGEM-T easy vector系統，反應體系(10|iL)如下
用移液器吹打連接反應液使之混勻後，室溫孵育lh。 6.3感受態細胞的製備
參照《分子克隆》第三版，採用CaCl2法製備。 6.4感受態細胞的轉化
參照《分子克隆》第三版進行。 6.5重組質粒的提取
參照《分子克隆》第三版，採用鹼式裂解法進行質粒提取。 6.6重組質粒的篩選與鑑定
PCR鑑定取培養的菌液lpL按外顯子的PCR混合體系和反應條件在 PCR儀中進行反應。
酶切鑑定pGEM T-easy Vector兩頭均有一個￡coRl酶切位點，故可利
T4 DNA連接酶的2x快速連接緩衝液 pGEM -T Easy載體(50ng) PCR產物
T4DNA連接酶(3 Weiss單位/faL) 補加去離子水至終體積
5|xL
2|aL l|aL
用五coRl進行酶切鑑定。反應體系共20pL，即2.0pL純化質粒DNA (如少 量可加大到5(iL)、 2.0|iL buffer、 l.O(iL五coiU、 15^iLddH20，在反應液上加 一滴礦物油，37。C下反應4h或過夜，1.5。/。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。 6.7陽性克隆測序
將經過酶切和PCR檢測為陽性克隆的質粒送上海生工生物工程技術服務 有限公司測序。
7、序列分析、引物的設計及驗證
根據測序結果利用Primier Premier 5.0軟體重新設計引物，並在親本及 F2群體中進行驗證，用於群體驗證的上遊引物3'端前6個鹼基序列為3，ttgaag， 由10 20個鹼基組成的DNA片段。反應體系及程序同4.1和4.2，優選的引 物序列組合由引物組I和引物組II組成，其中引物組I上遊引物具有序列表 中SEQIDN0.3所述的核苷酸序列，引物組I下遊引物具有序列表中SEQID N0.4所述的核苷酸序列，引物組II上遊引物具有序列表中SEQIDN0.5所述 的核苷酸序列，引物組II下遊引物具有序列表中SEQ ID NO，6所述的核苷酸 序列。
三、結果與分析
1、 基因組DNA的提取
結果顯示提取的DNA分子量均在23kb左右(附圖1)， OD26。/OD280 為1.8-2.0之間，RNA去除效果好，純度較高，符合實驗要求。
2、 PCR產物的電泳結果
禾U用合成的引物對不同性別黃瓜基因組DNA進行PCR擴增,得到與預期 片段大小一致的725bp的目的片段(附圖2)。
3、 重組質粒的轉化、篩選與鑑定
利用Amp抗性篩選與(x-互補現象篩選相結合的辦法對重組質粒進行篩 選。將篩選到的重組質粒轉入50 pg/mL Amp LB液體培養基中37"振蕩培養 12小時。通過鹼式裂解法提取質粒(附圖3)。質粒DNA分別經過PCR檢測 (附圖4)和EcoRI酶切檢測(附圖5)，箭頭所指示的是目的片段大小和位
置。將雙重鑑定後的陽性克隆送到上海生工生物工程技術服務有限公司進行 測序，結果表明序列的兩端均有引物的結合位點，進一步證實了克隆片段的 正確性。
4、 序列分析
由SEQNO.l序列可知，WI1983G和WI1983H的EIN3基因序列基本相同， 只是分別在153bp和501bp處發生兩個單核苷酸的變異(SNPs)，分別為G,53bp
禾口Ai53bp、 T501bp禾卩A50lbp。
5、 對親本、F,代及F2代群體進行PCR驗證
通過引物組I擴增後的結果表明(附圖6和附圖7)，性狀為全雌性的植株 (WI1983G、 F，、 15、 25、 54、 70、 85、 139、 153和9、 32、 134、 8、 18、 3)擴 增產物為382bp左右，而兩性花株(WI1983H、 37、 46、 60、 83、 99、 115、 152和119、 133、 71、 11、 36)在相應位置沒有出現擴增產物。在整個F2群體 中驗證的準確率達96%以上。
通過引物組II擴增後的結果表明(附圖8和附圖9)，性狀為全雌性的植株 (WI1983G、 F, 、 4、 51、 94、 100、 112、 126、 ]29、 134和18、 35、 153、 24、 32、 25)擴增產物為605 bp左右，而兩性花株(WI1983H、 37、 46、 99、 115、 131、 133和44、 88、 77、 39、 119)在相應位置沒有出現擴增產物。在整個F2 群體中驗證的準確率也達96%以上。
上述結果表明，引物組I和引物組II可以作為全雌性黃瓜選育的分子標記。SEQUENCE LISTING
〈110〉 易克
湖南農業大學
<120〉與黃瓜雌性性狀相關的分子標記及其應用
〈130〉
<160〉 6
〈170〉 Patentln version 3.3
<210〉 1
〈211〉 725
<212〉 ■
<213〉 Cucumis sativus
〈400〉 1
ttgg卿gga
60
ggatgtggag ggacaagatg cgtctcaaac gtxttaaaga gcaaagcaag
gttaaggaag ggatcg3tat tgtgaagcaa cgacaatctc aagaccsggc taggsggaag 120
犯gatgtcga gggcacatga tgggatcttg aagtatatgt tgaagattat ggaagtctgt 180
aatgctcaag gttttgtata cggaataatt cctgagaagg gaaaaccagt aaccggggca 240
tcggataatc tgcgagagtg gtggaaagac aaagtcagat ttgatagaaa cggaccagct 300
gccatagcca agtaccaggc agacaatgca attcctggac gaaatgatgg ctgtaattca 360
atcggtccaa ccxctcacac cttgcaggaa cttcaggata ccaccttagg ttctctttta 420
tcagctctga tgcagcactg tgaccctcct caaagaagat ttccattgga gaaaggagtt 480
cctccgccat 540
gaccaaggtc 600
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tggagtcgag g犯tggtggc caagaagcct catgacttga
ctcagcttgg agaaagcttg
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agac犯tcca agtgtttgca ggacaagatg 720
attat 725
2
<211〉 725
〈212> DNA
〈213〉 Cucumis sativus
200710035159.7
<400〉 2
ttgg卿gga
60
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gtcttaaaga aagaccaggc tgaagatta^ gaa肌ccagt ttgatagaaa gaaatgatgg ccaccttagg ttccattgga ctcagcttgg agaaagcttg cc肪gstccg
caagcttgtt ctggcttgct
gcaaagc犯g t鄉agg卿 gg犯gtctgt aaccggggca cggaccagct ctgtaattca ttctctttta ga肪ggagtt attgccgaag g犯agtaggt caagcttgtt
660
卿caatcca agtgtttgca ggaca卿tg actgccaagg卿gtgctac ctggcUgct 720
attat 725
<210〉 3
18
<212〉 ■ <213〉人工序列
〈400〉 3
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〈210〉 4
〈211〉 18
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列
〈400> 4
caccattcct cgactcca 18
5
<211〉 18
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
5
catgatggga tcttgaag 18
<210〉 6
〈211〉 20
〈212〉 腿 <213〉人工序列
〈400〉 6
ataatagcaa gccaggtagc 20
權利要求
1、與黃瓜雌性性狀相關的分子標記，其特徵在於該分子標記是黃瓜EIN3基因在153bp和501bp處發生的兩個單核苷酸變異，見序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，這兩個單核苷酸變異分別為G153bp和A153bp、T501bp和A501bp。
2、 利用權利要求1所述的兩個單核苷酸的變異設計的兩組引物，其特徵在於上遊引物3'端前6個鹼基序列為3'ttg aag，為10 20個鹼基組成的DNA片段。
3、 根據權利要求2所述的引物，其特徵在於它包括兩組引物，其中引物組 I上遊引物具有序列表中SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列，引物組I下遊引物具有序列表中SEQ ID N0.4所述的核苷酸序列，引物組II上遊引物具有序 列表中SEQ IDN0.5所述的核苷酸序列，引物組II下遊引物具有序列表中SEQ IDN0.6所述的核苷酸序列。
4、 一種獲得黃瓜雌性性狀分子標記的方法，其特徵在於包括以下步驟1) 材料培養和黃瓜性別的鑑定；2) 黃瓜幼嫩葉片基因組DNA的提取；3) 根據EIN3或EIL基因mRNA的保守序列設計引物進行PCR擴增；4) PCR產物的克隆測序及測序結果的比對分析；5) 根據序列比對結果設計兩組引物引物，在親本及F2群體中進行驗證。
5、 根據權利要求4所述的獲得黃瓜雌性性狀分子標記的方法，其特徵在於基 因組DNA提取過程中分別用lQ/oCTAB、 5MKAc禾Q 1MNaCl處理。
6、 根據權利要求4所述的獲得黃瓜雌性性狀分子標記的方法，其特徵在於PCR 擴增的反應程序為:94。C預變性5min， 94。C變性lmin、 60。C退火lmin、 72°C 延伸2min，共40個循環後於72"C延伸7min。
7、 根據權利要求4所述的獲得黃瓜雌性性狀分子標記的方法，其特徵在於用 於群體驗證的上遊引物3，端前6個鹼基序列為3'ttgaag，為10 20個鹼基組 成的DNA片段。
8、 根據權利要求4所述的獲得黃瓜雌性性狀分子標記的方法，其特徵在於用 於群體驗證的兩組引物分別為由序列表中SEQIDNO,3、 SEQIDNO,4構成 的引物組I和由序列表中SEQ ID NO. 5 、 SEQ ID NO. 6構成的引物組II 。
9、 黃瓜EIN3基因的分子標記在選擇育種上的的應用，其特徵在於E工N3基因上帶有G^bp和T5cnbp分子標記或兩者之一的植株均為純雌株。
10、 黃瓜EIN3基因的分子標記在選擇育種上的應用，其特徵在於通過引物 組I可特異性擴增得到一條382bp大小的條帶；或通過引物組II可特異性擴 增得到一條605bp大小的條帶，即可判定該黃瓜植株為純雌株。
全文摘要
本發明公開了一種與黃瓜雌性性狀相關的分子標記，該分子標記是黃瓜EIN3基因在153bp和501bp處發生的兩個單核苷酸變異(SNP)位點，其中純雌株EIN3基因上帶有G153bp和T501bp分子標記或兩者之一。獲得該分子標記的方法為提取黃瓜幼嫩葉片的基因組DNA，設計引物進行PCR擴增，然後進行PCR產物的克隆測序及測序結果的比對分析，最後重新設計引物在親本及F2群體中進行驗證。該分子標記可作為黃瓜雌性選擇的特異性標記，用於黃瓜性別決定基因標記輔助選擇育種，能大大縮短育種時間。
文檔編號C12N15/11GK101113469SQ200710035159
公開日2008年1月30日 申請日期2007年6月15日 優先權日2007年6月15日
發明者盧向陽, 徐向麗, 克 易, 剛 陳 申請人:易 克;湖南農業大學