一種可再生的生物素結合蛋白分子層及其製備方法
2023-04-23 00:32:11
專利名稱：一種可再生的生物素結合蛋白分子層及其製備方法
技術領域：
本發明屬於親和分子層及其製備方法技術領域，具體涉及可再生生物素結合蛋白分 子層及其製備方法。
背景技術：
據《現代預防醫學》(2001, 28.4: 485-486)介紹，具有親和分子層表面的栽體介 質如親和樹脂、生物膜和生物晶片等，因其可以特異結合帶特定結構的蛋白、多肽、DM 序列等，已被廣泛應用於蛋白質組學、細胞生物學、微生物學等領域，成為生物學的重 要分析方法和手段之一。在眾多的親和分子層中，具有生物素結合蛋白結構的親和分子 層是較為常用的一種，它能特異性地結合帶有生物素標籤的蛋白、多肽、DNA、 RNA等。 但現有商品化的生物素結合蛋白分子層產品都是一次性使用的，其分子層是通過共價鍵 結合的方式固定到載體介質上的，由於缺乏可靠、穩定且簡易的再生方法，它們都不能 再生而重複使用。至今未見關於製備可再生的生物素結合蛋白分子層方法的報導。
發明內容
本發明提出一種可再生的生物素結合蛋白分子層及其製備方法，以克服現有生物素 結合蛋白分子層不可重複使用的缺點，適用於各種載體介質。
本發明的可再生生物素結合蛋白分子層的製備方法，其特徵在於包括如下步驟
(1) 將載體介質表面的具有氮川三乙酸結構的分子層置於含有0. 00001-4M金屬離 子的水溶液中浸泡不少於10秒鐘，得到螯合了金屬離子的分子層；
(2) 將上述螯合了金屬離子的分子層置於0. 00001-5raM帶不少於6個組氨酸標籤 的生物素結合蛋白水溶液中浸泡不少於IO秒鐘，即得到可再生的生物素結合蛋白分子 層。
本發明由上述方法製備的可再生生物素結合蛋白分子層，特徵在於其為載體介質 表面具有氮川三乙酸結構的分子層通過金屬離子捕獲的帶組氨酸標籤的生物素結合蛋 白表面的分子層。
所述金屬離子選自鎳離子、鈷離子、銅離子或鋅離子中的至少一種。 所述生物素結合蛋白選自卵白素(Avidin)、鏈黴親和素(Str印tavidin)或中性 親和素(Neutravidin )中的至少一種。
所述載體介質包括生物晶片、親和樹脂、生物膜、金納米顆粒或磁性納米顆粒。 本發明製備得到的可再生生物素結合蛋白分子層具有很好的穩定性，能夠穩定地結 合帶有生物素標籤的分子，因此它能夠實現與現有的商品化的生物素結合蛋白分子層產 品相同的功能。本發明製備得到的可再生生物素結合蛋白分子層與現有商品化的生物素 結合蛋白分子層的不同點在於現有商品化的生物素結合蛋白分子層是通過共價鍵結合 的方式固定到載體介質上的，只能一次性使用，而本發明的可再生生物素結合蛋白分子 層是通過金屬離子配位鍵結合的方式固定到載體介質上的，因而具有可再生、可重複利
3用的優點。
本發明利用了氮川三乙酸分子可通過金屬離子捕獲帶組氨酸標籤分子的特點，通過 將具有氮川三乙酸結構的分子層在金屬離子和帶組氨酸標籤的生物素結合蛋白溶液中 先後浸泡，便可製備出具有生物素結合蛋白表面的分子層。由於此生物素結合蛋白分子 層可以通過金屬離子螯合劑洗脫下來，因此這種分子層具有可再生、可重複利用的性質。 至今未見有關於製備可再生生物素結合蛋白分子層方法的報導。
圖l為實施例l中表面為可再生鏈黴親和素分子層的可再生親和晶片的製備以及使 用該晶片結合生物素化DNA和對此進行再生處理的表面等離子共振信號曲線；
圖2為一個晶片上IO次重複實施例1中表面為可再生鏈黴親和素分子層的可再生 親和晶片的製備以及使用該晶片結合生物素化DNA和對此進行再生處理所得到的表面 等離子共振信號曲線的疊加圖。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明方法作進一步具體說明。 實施例1:
(1)將表面具有氮川三乙酸結構的分子層的晶片置於表面等離子共振相互作用分 析儀中，然後以10p 1/min的流速注入含有0. 0005M鎳離子的水溶液1分鐘並使其流 過晶片表面，得到螯合了鎳離子的分子層；
(2 )緊接著以10 n 1/min的流速注入0. OOlmM帶6個組氨酸標籤的鏈黴親和素水 溶液1分鐘並使其流過晶片表面，即得到表面為可再生鏈黴親和素分子層的可再生親和晶片。
本實施例由上述方法製備得到的可再生生物素結合蛋白分子層，是基於各種載體介 質如生物晶片、親和樹脂、生物膜、金納米顆粒、磁性納米顆粒等表面的具有氮川三乙 酸結構的分子層，通過金屬離子捕獲帶組氨酸標籤的生物素結合蛋白，從而得到具有生 物素結合蛋白表面的分子層。這種分子層具有很好的穩定性，能夠穩定地結合帶有生物 素標籤的分子，因此它能夠實現與現有商品化的生物素結合蛋白分子層產品相同的功 能;但現有商品化的生物素結合蛋白分子層是通過共價鍵結合的方式固定到載體介質上 的，只能一次性使用；而本發明的可再生生物素結合蛋白分子層是通過金屬離子配位鍵 結合的方式固定到載體介質上的，因而具有可再生、可重複利用的優點。
圖1為實施例1中表面為可再生鏈黴親和素分子層的可再生親和晶片的製備以及使 用該晶片結合生物素化DNA和對此進行再生處理的表面等離子共振信號曲線。從圖1 可以證明本實施例中上述製備得到的是可再生鏈黴親和素分子層。
圖1的曲線可分為3個部分，首先是先後進樣鎳離子和帶6個組氨酸標籤的鏈黴親 和素，可以看出，鏈黴親和素結合上去後，曲線極為平穩，說明鏈黴親和素分子層結合 牢固不解離；然後進樣5mg/L的生物素化DNA，可以看出，生物素化DNA結合到鏈黴親 和素分子層後，曲線相當平穩，說明鏈黴親和素分子層和生物素化DNA均結合牢固，這 也就說明該鏈黴親和素分子層不僅可用，而且具有良好的穩定性；最後先後進樣O. 35M乙二胺四乙酸和50rnM氫氧化鈉溶液，將鏈黴親和素分子層及其結合的生物素化DM洗 脫下來，曲線降至基線水平，說明鏈黴親和素分子層可以被徹底地進行再生。
圖2為一個晶片上10次重複實施例1中表面為可再生鏈黴親和素分子層的可再生 親和晶片的製備以及使用該晶片結合生物素化DNA和對此進行再生處理所得到的表面 等離子共振信號曲線的疊加圖。從圖2可以看出， 一個循環過後，通過再次先後進樣鎳 離子和帶6個組氨酸標籤的鏈黴親和素，便可重新製備出鏈黴親和素分子層；然後通過 再次進樣5mg/L的生物素化DNA,便能將生物素化DNA結合到鏈黴親和素分子層上，而 且結合依舊穩定，這說明鏈黴親和素分子層不僅實現了再生，而且再生後具有與再生前 相當的性能；最後通過先後進樣0. 35M乙二胺四乙酸和50raM氫氧化鈉溶液，又可以再 次對鏈黴親和素分子層進行徹底的再生清除。如此經過10次的鏈黴親和素分子層的制 備-使用-再生，該分子層不僅具有相同的結合生物素化DNA的能力，而且還保持著可再 生使用的性能。由圖2證明了本實施例製備的可再生鏈黴親和素分子層具有很好的穩定 性，並可多次再生後多次重複使用。
本發明方法適用於具有氮川三乙酸結構的分子層，該方法操作簡易、反應條件溫和。 本發明方法除了可以用來製備本實施例中的可再生親和晶片，亦可適用於製備各種載體 介質如親和樹脂、生物膜、金納米顆粒、磁性納米顆粒表面的具有氮川三乙酸結構的分 子層。
實施例2:
(1) 將具有氮川三乙酸結構的分子層的親和樹脂置於含有0. 00001M鈷離子的水 溶液中浸泡10分鐘，得到螯合了鈷離子的親和樹脂；
(2) 將螯合了鈷離子的親和樹脂取出，用去離子水清洗後，直接置於O.OOOOlmM 帶12個組氨酸標籤的卵白素水溶液中浸泡30分鐘，即得到表面為可再生卵白素分子層 的可再生親和樹脂。
該親和樹脂可以特異地結合帶有生物素標籤的分子，適用於生物樣品的分離與純 化。而使用後的親和樹脂通過先後用乙二胺四乙酸和氫氧化鈉溶液衝洗，便能使卯白素 分子層得到徹底的再生清除；然後通過再次先後浸泡鈷離子水溶液和帶12個組氨酸標 籤的卵白素水溶液，便可重新製備出卵白素分子層,從而使該親和樹脂的功能得到恢復， 能夠再次特異地結合帶有生物素標籤的分子。
實施例3:
(1 )將具有氮川三乙酸結構的分子層的生物膜置於含有4M銅離子的水溶液中浸泡 IO秒鐘，得到螯合了銅離子的生物膜；
(2)將螯合了銅離子的生物膜取出，用去離子水清洗後，直接置於5mM帶15個組 氨酸標籤的鏈黴親和素水溶液中浸泡IO秒鐘，即得到表面為可再生鏈黴親和素分子層 的可再生親和生物膜。
該親和生物膜可以特異地結合帶有生物素標籤的分子，適用於生物樣品的分離與純 化。而使用後的親和生物膜通過先後用乙二胺四乙酸和氫氧化鈉溶液衝洗，便能使鏈黴 親和素分子層得到徹底的再生清除；然後通過再次先後浸泡銅離子水溶液和帶15個組氨酸標籤的鏈黴親和素水溶液，便可重新製備出鏈黴親和素分子層，從而使該親和生物 膜的功能得到恢復，能夠再次特異地結合帶有生物素標籤的分子。 實施例4:
(1) 將具有氮川三乙酸結構的分子層的金納米顆粒置於含有0. 075M鎳離子和 0. 15M鋅離子的水溶液中浸泡2分鐘，得到螯合了鎳離子和鋅離子的金納米顆粒；
(2) 將螯合了鎳離子和鋅離子的金納米顆粒取出，用去離子水清洗後，直接置於 0. 0008mM帶IO個組氨酸標籤的中性親和素和0. 002mM帶8個組氨酸標籤的鏈黴親和素 水溶液中浸泡7分鐘，即得到表面為可再生中性親和素和鏈黴親和素分子層的可再生親 和金納米顆粒。
該親和金納米顆粒可以特異地結合帶有生物素標籤的分子，適用於生物樣品的分離 與純化。而使用後的親和金納米顆粒通過先後用乙二胺四乙酸和氫氧化鈉溶液衝洗，便 能使中性親和素和鏈黴親和素分子層得到徹底的再生清除；然後通過再次先後浸泡含鎳 離子和鋅離子的水溶液以及帶10個組氨酸標籤的中性親和素和帶8個組氨酸標籤的鏈 黴親和素水溶液，便可重新製備出中性親和素和鏈黴親和素分子層，從而使該親和金納 米顆粒的功能得到恢復，能夠再次特異地結合帶有生物素標籤的分子。
實施例5:
(1) 將具有氮川三乙酸結構的分子層的磁性納米顆粒置於含有0. 008M鎳離子、 0. 02M鈷離子和0.15M鋅離子的水溶液中浸泡7分鐘，得到螯合了鎳離子、鈷離子和鋅 離子的磁性納米顆粒；
(2) 將螯合了鎳離子、鈷離子和鋅離子的磁性納米顆粒取出，用去離子水清洗後， 直接置於0. 04mM帶14個組氨酸標籤的中性親和素水溶液中浸泡3分鐘，即得到表面為 可再生中性親和素分子層的可再生親和磁性納米顆粒。
該親和磁性納米顆粒可以特異地結合帶有生物素標籤的分子，適用於生物樣品的分 離與純化。而使用後的親和磁性納米顆粒通過先後用乙二胺四乙酸和氪氧化鈉溶液衝 洗，便能使中性親和素分子層得到徹底的再生清除；然後通過再次先後浸泡含鎳離子、 鈷離子和鋅離子的水溶液以及帶14個組氨酸標籤的中性親和素水溶液，便可重新製備 出中性親和素分子層，從而使該親和磁性納米顆粒的功能得到恢復，能夠再次特異地結 合帶有生物素標籤的分子。
權利要求
1.一種可再生生物素結合蛋白分子層，特徵在於其為載體介質表面的具有氮川三乙酸結構的分子層通過金屬離子捕獲的帶組氨酸標籤的生物素結合蛋白表面的分子層。
2. 權利要求1所述可再生生物素結合蛋白分子層的製備方法，其特徵在於先將載 體介質表面的具有氮川三乙酸結構的分子層置於含有0. 00001-4M金屬離子的水溶液中 浸泡不少於10秒鐘，得到螯合了金屬離子的分子層；再將上述螯合了金屬離子的分子 層置於0. 00001-5mM帶不少於6個組氨酸標籤的生物素結合蛋白水溶液中浸泡不少於 10秒鐘，即得到可再生的生物素結合蛋白分子層。
3. 如權利要求1所述的可再生生物素結合蛋白分子層或如權利要求2所述的製備 方法，特徵在於所述金屬離子選自鎳離子、鈷離子、銅離子或鋅離子中的至少一種。
4. 如權利要求1所述的可再生生物素結合蛋白分子層或如權利要求2所述的製備 方法，特徵在於所述生物素結合蛋白選自卵白素、鏈黴親和素或中性親和素中的至少 一種。
5. 如權利要求1所述的可再生生物素結合蛋白分子層或如權利要求2所述的製備 方法，特徵在於所述載體介質包括生物晶片、親和樹脂、生物膜、金納米顆粒或磁性 納米顆粒。
全文摘要
本發明公開了一種可再生的生物素結合蛋白分子層及其製備方法，特徵是先將載體介質表面的具有氮川三乙酸結構的分子層置於含有0.00001-4M金屬離子的水溶液中浸泡不少於10秒鐘，得到螯合了金屬離子的分子層；再將上述螯合了金屬離子的分子層置於0.00001-5mM帶不少於6個組氨酸標籤的生物素結合蛋白水溶液中浸泡不少於10秒鐘；所得到的可再生生物素結合蛋白分子層具有很好的穩定性和重複性，能夠滿足實驗的要求，且操作簡易、反應條件溫和，適用於各種載體介質；克服了現有生物素結合蛋白分子層不可再生的缺點，為現有生物素結合蛋白分子層產品提供了可重複利用的途徑。
文檔編號G01N33/68GK101644711SQ20091014480
公開日2010年2月10日 申請日期2009年9月4日 優先權日2009年9月4日
發明者周宏敏, 浩 姜, 歐惠超, 江海峰, 羅昭鋒 申請人:中國科學技術大學