轉分化的組織移植物的製作方法

2023-04-23 07:38:47 1

骨移植物被用於促進脊柱融合中的骨癒合，在頜面外科手術中或在創傷性骨缺損不癒合的情況下增加骨。從髂嵴採取的松質骨仍然被認為是用於脊柱融合的標準，但是與高併發症率相關1。同種異體移植骨是一種常用的替代方案，但可能缺乏成骨性並增加手術部位感染的風險2。合成的β-磷酸三鈣骨移植物可以單獨使用或與自體幹細胞組合使用，但已報導了植入失敗3。通過自體細胞和天然或合成生物材料的組合製造的組織工程化骨可能構成潛在的替代方案。然而，這些移植物迄今尚未進行到臨床實踐，因為在缺損部位足夠的血管形成的問題仍然未解決4。

另一個主要的臨床問題是骨質疏鬆或創傷性椎骨骨折的治療：目前，新近的骨折在經皮椎體後凸成形術或椎體成形術程序中通過灌注骨水泥治療5。這些程序的併發症包括水泥外滲、相鄰椎骨骨折和感染6。使用骨水泥的另一個問題是有限的生物相容性：對不同PMMA水泥的體外研究證明了它們引發細胞損傷和炎症的潛力7。PMMA骨水泥在聚合後沒有形狀改變的可能性，使得它們不適合用於治療處於生長期的兒童和青年。可吸收的磷酸鈣水泥可以用於這個患者組，但顯示45％的洩漏率，具有不清楚的長期臨床後果8。由於其對抗彎曲、吸引和剪切力的低抗性，存在水泥失效和矯正丟失的較高風險9。迄今為止還不存在將優良的生物相容性與合適的機械穩定性結合的合適的生物治療。

由於不良的固有癒合能力，關節軟骨的全厚度缺損仍然是未解決的臨床問題。外科治療選擇包括骨髓刺激技術，如鑽孔10或微骨折11。兩種技術均建立軟骨損傷和骨髓之間的連通，從而允許來自下面的骨髓腔的間充質幹細胞遷移至缺損12。來自關節的非負重區域的骨軟骨柱的移植13代表另一種治療選擇。由於沒有獲得透明軟骨，並且纖維軟骨修復組織不能耐受隨時間的機械應力14，這些手術程序都未導致恢復原狀。

已在體外分離和擴增的自體軟骨細胞的移植(ACI)代表了針對軟骨修復的生物學方法15。ACI包括一系列程序：從受影響關節的非負重區域關節鏡獲取軟骨組織。將軟骨活檢切成小塊並酶促消化以分離關節軟骨細胞，然後將其在體外擴增數周。在第二外科手術中，缺損被仔細地清創並被骨膜瓣(periostal flap)或生物膜覆蓋，在其下面注射軟骨細胞。在修改的該治療中，將軟骨細胞接種到膠原基質上，然後植入16。

兩種方法都有困難：如果使用骨膜瓣封閉缺損15，需要修正手術的骨膜肥大在高達15.4％的病例中發生。在25％的經歷基質輔助的軟骨細胞移植的患者中也觀察到了暫時性移植物肥大16。通常為牛或豬來源的生物膜的使用可能導致過敏反應，並因此在對動物來源的材料具有已知超敏反應的患者中是禁忌的17。因為產品未針對可傳播的傳染病進行常規篩選，所以它們可能對健康護理提供者18和接受者造成健康風險。

在WO 2005/018549 A2中和在2009年，Evans等人23描述了使用用於表達BMP-2的重組腺病毒載體產生活化肌肉或脂肪移植物。此方法具有病毒感染的風險23，具有高風險特徵並且可能導致移植排斥。此外，腺病毒激活的脂肪癒合不快，在癒合骨一致性上有高變異性23。此外，腺病毒活化的脂肪顯示用於組織修復的希望，但與肌肉組織相比癒合不快。這些差異可能是方法特異性的，最終脂肪組織對腺病毒感染的易感性較低。Orlicky和Schaak報導了前脂肪細胞系3T3-L1被腺病毒載體無效率地轉染25。在綜述24中，與體內細胞活化方法相比，離體方法被認為是累贅的、非常昂貴的和較不吸引人的。

WO 03/015803A1涉及提供間充質細胞以治療關節中的關節缺損和骨關節病並進一步產生移植物。提供合適的移植物的問題在該文獻中未被解決。

Wang等人26描述了分化從兔分離並且接種到無細胞軟骨基質中的脂肪來源的幹細胞。

Sandor等人27和WO 2006/009452 A2描述了來源於分離的自體脂肪幹細胞的人工構建體。分離細胞並離體擴增並接種到粒狀β-磷酸三鈣支架中。

Salibian等人28涉及整形外科手術中的幹細胞。

Inok Kim等人29和Jung等人30涉及纖維蛋白膠中的MSC。

Eun Hee等人31綜述了分離的脂肪來源的幹細胞的使用。

Stromps等人32描述了分離的脂肪來源的幹細胞的成軟骨分化。

Sujeong等人33涉及脂肪組織來源的幹細胞的神經分化。從耳葉分離細胞並培養。

Halvorsen等人19描述了將基於分離的脂肪來源幹細胞的細胞培養物用於骨細胞形成。通過膠原酶從組織中除去細胞並在體外培養。然而，這些細胞在體外的擴增不是高效的，並且在用於骨修復的糊劑中使用這樣的細胞的所描述的預測失敗。

因此，需要提供患者良好耐受的移植物，並提供滿足修復組織所需的強度和耐久性以及在血管化受體組織的情況下足夠的血管生成性質的要求的足夠的組織替換。

為了滿足這些需要，本發明提供了通過將供體結締組織(優選脂肪組織)直接轉分化至另一種結締組織類型來產生生物工程化結締組織移植物的方法，包括在體外a)以至少1小時(優選至少2天)或體內和/或b)通過一種或多種結締組織特異性生長或分化因子培養供體結締組織。還提供了產生適合用於矯正結締組織缺損(tissue defect)的結締組織移植物的方法，其包括確定組織缺損的大小和形狀，通過以任何順序的下述操作處理從患者獲得的供體結締組織(優選脂肪組織)：塑型供體組織以適合組織缺損的大小和形狀，並使脂肪組織與一種或多種結締組織特異性生長或分化因子接觸，從而起始組織移植物向另一種結締組織的分化。本發明的方法使用全組織而無需從組織分離和培養幹細胞。供給至轉分化步驟的本發明的組織包含處於其原始細胞外基質和細胞組構(cellular organization)中的細胞，其在本文中還被稱為全(供體)組織。因此，與經由分離的細胞的間接分化形成對比，本發明的方法被稱為「直接」轉分化，即「組織至組織」。分離的細胞和從其生長的產物(無論是在培養基中還是在人工支架中)都不被認為是根據本發明的組織。根據本發明，結締組織、供體組織(來自供體患者)被轉化為另一種結締組織(移植物組織，其不同於供體組織類型)。供體組織優選為脂肪。本發明的移植物可用於治療受試者中的結締組織缺損，例如，通過將移植物插入缺損中或將移植物施加到缺損上。特別地，本發明在本文所述的任何方法實施方案中提供了將脂肪組織(作為供體組織)轉分化至另一種非脂肪組織(移植物組織)的方法。還提供了用於在方法中使用的結締組織特異性生長或分化因子以及將所述結締組織特異性生長或分化因子用於製備用於在這樣的方法如治療方法中使用的組合物。

還提供了用於製備本發明的適合用於此組織缺損矯正治療的移植物的離體或體內方法，以及適合用於製備和分化供體(優選脂肪)組織成合適的移植物的試劑盒。本發明的其它方面和優選實施方案描述於權利要求中。所有這些方法和實施方案是相互關聯的並且可以彼此組合，例如試劑盒可以用於本發明的方法中，反之亦然，試劑盒可以被調整以適合用於執行任何一種本發明的方法；離體方法可以用作治療方法的一部分；在離體步驟中產生的移植物可以治療性使用或提供為用於這樣的治療用途的組合物。對於任何特定方面描述的所有優選實施方案還應被視為描述任何其它發明方面，如將立即設想這樣的實施方案的一般性的本領域技術人員所清楚的。此外，每個優選實施方案還可以與每個其它優選實施方案組合；特別優選的是遵循本文所述的所有優選的建議，除非明確排除。

本發明提供了產生適合用於矯正結締組織缺損的結締組織移植物(其可以在使用或不使用支架的情況下應用)，從患者獲得經塑型以適合患者中的組織缺損的大小和形狀的供體(優選脂肪)組織，使供體(優選脂肪)組織與一種或多種結締組織特異性生長或分化因子接觸(本文中的「孵育」)，從而起始組織移植物的分化。「接觸」是用各自的生長或分化因子處理組織(或所述組織內的細胞)，由此所述組織適應於由這些因素引起的新條件，進而導致轉分化。

先前的離體方法聚焦於分離的細胞的細胞培養物或病毒轉染。然而，體外細胞分離、單層擴增和在植入之前再分化是累贅的，並且可導致單層培養物中的去分化。本發明的代替分離的細胞的全組織的轉分化減少了這些缺點並且僅需要最小的體外或離體處理，其可以在GMP順應性的、全自動的組織處理裝置中進行。例如。在優選的實施方案中，細胞培養基需要以諸如每周1-4次的常規間隔替換或更新。

任何類型的脂肪組織可以用於供體組織，包括但不限於來自諸如胸部、腹部和臀部、髖部和腰部的區域的皮下蓄積庫(depot)；或異位或內臟脂肪。雖然在本發明的所有實施方案中脂肪是優選的供體組織類型，但是可以使用其它結締組織以及供體，例如，軟骨、肌肉、腱、韌帶或神經供體組織，用於本發明的所有實施方案替代脂肪。

可以使用本領域中標準的用於獲得用於移植的組織的方法從患者中提取組織。例如，可以使用標準或微創外科手術技術外科手術地提取這樣的組織。微創手術可涉及通過身體中期望的使用位置處的天然或手術創建的小直徑的開口提取脂肪組織，以使得外科手術介入是可能的而對患者施加的應激顯著較小，例如，不使用全身麻醉。

在某些實施方案中，以適合用於植入特定組織缺損的大小和形狀從患者中取出組織。在其它實施方案中，從患者中取出組織，然後將其離體改變為所需的大小和形狀。

供體(優選脂肪)組織可包含基質細胞。其還可以包含脂肪細胞，例如白色和/或棕色脂肪細胞。通常幹細胞存在於分化至特異於感興趣的結締組織(即組織缺損的組織)的細胞的脂肪組織中。這樣的細胞可以是間充質幹細胞或基質幹細胞。還令人驚訝的是，存在於本發明的脂肪組織中的脂肪細胞不需要被去除，而是可以保留並被包埋在最終的分化的組織移植物中。脂肪細胞的數目可以是組織移植物的所有細胞的至少20％，至少30％或至少40％，至少50％，至少60％，至少70％或更多。

優選地，刺激脂肪細胞以減少或消耗其脂肪蓄積庫。這可以通過化學品或(細胞因子或激素)受體刺激或機械刺激進行。受體刺激包括使包含脂肪細胞的供體組織與瘦素接觸。機械刺激包括揉捏或分散包含脂肪細胞的供體組織。在將組織分化至骨組織的情況下，並且還在軟骨組織的情況下，脂肪蓄積庫的減少或消耗是特別優選的。脂肪含量可以減少到小於50％(w/w)，優選小於30％或小於20％，例如在50％-10％的範圍內的脂肪量。脂肪組織具有～0.9g/ml的密度。脂肪減少或消耗可導緻密度為至少0.93g/ml、優選至少0.95g/ml、甚至更優選至少0.97g/ml的組織。處理可以是將要達到例如0.93g/ml至1.10g/ml的密度。

可以任意選擇使大小和形狀適合於組織缺損的步驟和接觸供體組織並從而起始供體組織的分化的步驟的順序，例如醫生可以首先調整形狀，然後分化細胞，或者可以首先分化細胞，然後使移植物成形以適合組織缺損。當然，成形也可以在分化之前和之後進行，例如，在分化之前提供粗略形狀，然後在分化後微調形狀。同樣，確定缺損的大小可以在分化之前或之後。優選的是在分化之前，以選擇足夠大小的供體組織，其當然也可以隨後在插入缺損後微調至缺損的大小。

分化導致產生增加數量的移植結締組織(包括骨、軟骨、肌肉(生肌組織)、腱(生腱組織(tenogenic tissue))、韌帶或神經細胞(神經源性組織))的細胞，和優選還產生特異於移植結締組織的細胞外基質。然而，供體組織(特別是脂肪組織)的細胞外基質還可以至少部分地保留在最終的移植物組織中。通過選擇本領域技術人員已知的合適的結締組織特異性生長或分化因子和/或適合用於所述分化的孵育時間，本領域技術人員可以將分化引導至特定類型的移植物組織。特別地，移植結締組織類型可以是骨或軟骨。

「起始組織移植物的分化」是指不一定完全分化供體結締組織(優選脂肪組織)的所有應答性細胞(例如幹細胞)，但通常足以起始分化反應，以使得細胞即使在(離體)孵育之後(特別是在插入組織缺損後)也將繼續分化。優選(離體)分化發生至少直到移植物達到缺損組織的至少5％、優選至少50％的拉伸強度。在骨移植物的情況下，移植物組織具有比骨更低的拉伸強度，以允許容易地處理移植物組織，從而保持移植物組織的柔性。在骨的情況下，優選的拉伸強度為缺損組織的約5％至15％。特別地，但不限於，在軟骨、肌肉、腱、韌帶或神經移植物靶的情況下，優選地，移植物達到缺損組織的至少25％，優選至少50％的拉伸強度。或者或另外，優選差異發生至少直到移植物達到至少20％，優選至少40％，例如至少20％的密度。20％至60％的缺損組織。本文給出的拉伸強度和密度是指如從原始供體組織到靶移植物組織比較的拉伸強度或密度的變化。百分比將參數(拉伸強度或密度)的變化定義為以所述百分比值至靶組織方向的逐漸變化。移植參數可以通過A+(B-A)*P計算，其中A是供體組織的參數，B是缺損的靶組織的參數，P是給定的百分比值。在用於骨缺損的骨移植物的情況下，優選分化發生至少直到移植物達到缺損組織的至少20％，優選至少40％，例如20％至60％的礦化含量。礦化含量可以通過組織學和確定2D切片中礦化區域的含量來確定。

對於椎骨骨折的治療，優選(離體)分化發生至少直到移植物達到缺損組織的至少10％，優選至少20％，例如10％至30％的礦化含量。通常，在通過小通道配合移植物組織的情況下(例如在椎骨骨折的情況下)，優選的是，移植物組織具有足夠的彈性以用於通過通道例如以摺疊狀態輸送並且上述較低的礦化是優選的。

本發明的方法還可以包括將分化的移植物組織置於患者的組織缺損中。優選地，患者和/或供體是人或非人動物。非人動物包括哺乳動物，例如包括馬，牛，狗，貓，豬，羊，鳥類如鴕鳥或鸚鵡，爬行動物如鱷魚。優選地，具有組織缺損的患者和提供供體組織的患者是相同的患者(自體組織)。

在一個實施方案中，將移植物離體孵育足以允許供體組織中的至少一部分細胞分化或起始分化為用於組織移植物的所需細胞類型的一段時間。接觸步驟(孵育)的示例時間為1小時(h)至10周(w)，優選1小時至6周。優選的時間是至少1小時，至少2小時，至少3小時，至少5小時，至少8小時，至少12小時，至少18小時，至少24小時(1天；1d)，至少30小時，至少36小時，至少2d，至少3d，至少4d，至少5d，至少6d，至少7d，至少8d，至少9d，至少10d，至少11d，至少12d，至少14d。可選擇地或與這些最小時期中的任一個組合地，接觸步驟(孵育)為至多10w，至多8w、6w，至多5w，至多4w，至多3w，至多2w，至多10d，至多8d，至多6d，至多4d，至多3d，至多2d，至多1d，至多18h。優選的範圍是2d至4w。

在替代離體分化或與其組合的實施方案中，本發明的移植物在體內分化。因此，沒有離體分化的供體移植物或部分離體分化的移植物被放置或植入到組織缺損中，並被刺激以分化為缺損組織的組織類型。這可以通過對植入的移植物施用(例如通過局部注射)結締組織特異性生長或分化因子(特異於缺損組織)來完成。可以根據組織類型和移植物大小來選擇施用的劑量和間隔。結締組織特異性生長或分化因子可以與下文對於離體方法所進一步描述的相同，其是本發明的優選實施方案。

根據本發明，供體組織的細胞優選不經分離和擴增，而是僅經轉分化。

在優選的實施方案中，移植的結締組織是軟骨(成軟骨分化組織)。分化可以包括將脂肪組織的細胞分化至軟骨細胞和/或成軟骨細胞，優選以及它們的特異性細胞外基質。例如，移植物組織可以包含軟骨細胞外基質的標記物，例如如圖2a-c所示的。分化因子隨後是軟骨細胞分化因子。這樣的因子或因子的混合物優選包含TGF-β。TGF-β可以包括TGFβ-1、TGFβ-2或TGFβ-3中的任一種或其混合物，例如TGFβ-1和TGFβ-2。此外，優選的是胰島素樣生長因子(IGF)。其它成軟骨生長和分化因子包括BMP-2，BMP-4，BMP-6，BMP-7，BMP-9，地塞米松，α-FGF，FGF-2，IGF-1，IGF-2，其全都可以任選地附加使用(例如附加於TGF-β)或作為替代物使用。在軟骨靶移植物組織的情況下，優選在不存在血清的情況下培養組織。軟骨組織質量可以通過在轉分化期間或之後加入BMP-14(GDF-5)來進一步改善。

在進一步的優選實施方案中，移植的結締組織是骨(成骨分化組織)。分化可以包括脂肪組織的細胞分化至骨細胞和/或成骨細胞，優選以及其特異性細胞外基質，例如礦化。分化因子隨後是成骨分化因子。這樣的因子或因子的混合物優選包含β-甘油磷酸酯。其它成骨生長和分化因子包括地塞米松，bFGF，BMP-2，PGF，成骨蛋白，GDF-5，CTFG，其全都可以任選地附加使用(例如附加於β-甘油磷酸酯)或作為替代物使用。特別優選的是如下文進一步詳細描述的作為添加劑的血清。特別優選的是β-甘油磷酸酯、地塞米松和抗壞血酸的組合，優選進一步與血清組合。

在進一步優選的實施方案中，移植結締組織是腱(生腱分化組織)。分化可以包括將供體組織(優選脂肪組織)的細胞分化至腱細胞。分化因子隨後是生腱分化因子。這樣的因子或因子的混合物優選包括在具有或不具有BMP-2、PGE2、BMP-12、BMP-14、TGFβ3和富含血小板的血漿釋放物、優選以及血清中的任何一種或多種的情況下的機械體外拉伸。示例性生腱分化培養基包含補充有1％FCS和BMP-12(優選約10ng/ml BMP-12)的DMEM-F12。

在進一步優選的實施方案中，移植結締組織是肌肉(肌原性分化組織)。分化可以包括將供體組織(優選脂肪組織)的細胞分化至肌細胞。分化因子隨後是生肌分化因子。這樣的因子或因子的混合物優選包括5-氮雜胞苷、兩性黴素B、bFGF和優選以及血清中的任何一種或多種。

在進一步優選的實施方案中，移植結締組織是神經(神經源性分化組織)。分化可以包括將供體組織(優選脂肪組織)的細胞分化至神經細胞。分化因子隨後是神經源性分化因子。這樣的因子或因子的混合物優選包括FGF-2、視黃酸、2-巰基乙醇、氫化可的松、cAMP、aFGF、Shh、腦源性神經營養因子(brain derived neurotropic factor)、神經生長因子、玻連蛋白、AsA、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、毛喉素和佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(優選其20nM)以及優選血清中的任何一種或多種。

在進一步優選的實施方案中，移植結締組織是韌帶。分化可以包括將供體組織(優選脂肪組織)的細胞分化至韌帶細胞。分化因子隨後是成纖維細胞分化因子。這樣的因子或因子的混合物優選包括TGF-β1、IGF-1、PDGF、BMP-12、bFGF和胰島素以及優選血清中的任何一種或多種。

對於軟骨分化，生長和分化因子可以包括地塞米松、抗壞血酸-2-磷酸鹽、胰島素、亞硒酸、轉鐵蛋白、丙酮酸鈉和轉化生長因子β(TGF-β)、BMP-14和/或胰島素樣生長因子(例如IGF-1)中的一種或多種。特別優選的是TGF-β和/或IGF-1。可以用所有這些組分實現特別有效的分化。

還可以包括的另外的營養物包括Dulbecco改良的Eagle培養基和Ham營養混合物F12、任何蛋白質性胺基酸(proteinogenic amino acid)，例如L-穀氨醯胺。

對於成骨(骨)分化，考慮到軟骨發育是骨發育的前兆，軟骨生長和分化因子可以與另外的骨生長和分化因子一起使用。

成骨分化因子是例如描述於參考文獻21中的，並且可以包括1-1000nM的地塞米松(Dex)、0.01-4mM L-抗壞血酸-2-磷酸酯(AsAP)或0.25mM抗壞血酸和1-10mMβ-甘油磷酸酯(βGP)。其可以包括DMEM基礎培養基加上100nM Dex、0.05mM AsAP和10mMβGP。

優選地，骨分化和生長因子包括選自以下的一種或多種：抗壞血酸，任何蛋白質性胺基酸，例如L-穀氨醯胺，地塞米松，β-甘油磷酸酯和瘦素。特別優選的是β-甘油磷酸酯和/或瘦素。可以用所有這些組分實現特別有效的分化。

還優選在骨分化期間使用如在Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)和/或血清中的營養物。DMEM提供了可在本發明的任何方法中用於在分化期間和之後培養任何預分化的脂肪組織的基本營養物，包括胺基酸。

優選地，在分化步驟期間將血清，特別是來自轉分化的組織移植物的接受者的自體血清添加至供體(優選脂肪)組織，優選在離體培養物中進行。血清可以是哺乳動物血清，例如牛血清，特別優選的是胎小牛血清或胎牛血清，但在人患者的情況下優選人血清。血清可以以1％至80％(v/v)，優選2％至60％，3％至50％，4％至40％，5％至30％，特別優選6％至20％的濃度提供。血清通常僅用於維持某些細胞存活或增殖-甚至是軟骨細胞，然而其在存在或血清存在下去分化至其它細胞和/或減少其膠原和糖胺聚糖合成。血清優選不用於軟骨移植物。轉分化通常不依賴於血清。根據本發明的方法，可以在骨、肌肉、腱、韌帶或神經產生期間使用血清。可以使用其它步驟來促進向這些組織的細胞的分化。

優選地，IGF(特別是IGF-1)用於骨分化。

優選地，結締組織特異性生長和/或分化因子外在地提供至組織，例如，組織與這些因子接觸，並且因子不在供體或移植物組織的細胞中重組表達。

令人驚訝的是，發現可以促進骨分化，而不需要骨形態發生蛋白，例如BMP-2。因此，在本發明的優選實施方案中，BMP或編碼BMP的核酸不加入到用於軟骨和/或骨分化的脂肪組織中。在其它實施方案中，可以使用BMP，例如BMP-5或BMP-7。BMP是BMP1，BMP2，BMP3，BMP4，BMP5，BMP6，BMP7，BMP8a，BMP8b，BMP10，BMP15。

優選地，核酸(例如轉基因)不用作生長或分化因子。本發明的分化或生長因子是蛋白質或肽。另外或可選地，可以使用具有至多10kDa，優選至多5kDa，特別優選至多2kDa的大小的小有機分子。

優選地，結締組織特異性生長或分化因子包括抗壞血酸或抗壞血酸酯，優選抗壞血酸-2-磷酸酯，或其任何藥學上可接受的鹽。抗壞血酸及其酯(例如L-抗壞血酸2-磷酸酯)刺激膠原累積、細胞增殖以及通過皮膚成纖維細胞形成三維結構。因此，在本發明的任何方法及其任何實施方案(包括軟骨或骨分化)中，抗壞血酸及其衍生物是作為結締組織特異性生長或分化因子的優選組分或作為這樣的因子的混合物中的添加劑。

優選地，分化(孵育)在30至40℃的溫度下進行。還優選地，分化(孵育)在包含0.01％至10％(w/v)CO2的氣氛下進行。還優選地，分化(孵育)在包含70％-98％溼度的氣氛下進行。優選地，但不是必須地，使用這些參數的組合。

在本發明的方法中，供體和移植物組織的細胞(至少組織內經轉分化的細胞)保持存活。

在特定方面，本發明提供了用於將供體(優選脂肪)組織製備成適合用於結締組織修復的分化的移植物的離體方法，其包括使供體(優選脂肪)組織與一種或多種結締組織特異性生長或分化因子接觸，從而起始組織移植物的分化，其中所述接觸在30至40℃的溫度、0.01％至10％(w/v)CO2和70％至98％的溼度下持續1小時至4周的時間，優選其中所述方法進一步通過如上或如下所述的其它步驟來限定。特別地，結締組織特異性生長或分化因子由大小為至多10kDa的蛋白質、肽和小分子組成，例如不使用在脂肪組織的細胞中的重組表達。

如果需要，可將供體或移植物組織切成所需大小的切片以促進微創插入。所需的大小長度可以為0.3mm至10mm。優選地，移植物組織或轉分化之前或期間的本發明的供體具有0.001mm3至1000cm3的大小，優選0.01mm3至100cm3的大小，或0.1mm3至10cm3的大小，1mm3至1cm3或10mm3至100mm3的大小。

將分化的組織移植物插入組織缺損中或組織缺損上，並且進一步優選地其中插入通過組織密封劑(優選纖維蛋白膠)固定。

將任何一種上述分化步驟即孵育作為本發明的另一方面提供於包括所述孵育步驟的用於將脂肪組織轉化為結締組織的組織移植物的離體或體內方法中。

優選地，本發明的任何一種方法進一步包括使組織與組織密封劑接觸，優選在用所述結締組織特異性生長或分化因子處理後和/或在將組織移植物的大小和形狀調節至適合患者的結締組織缺損的任選步驟之後。調整形狀和大小意味著組織移植物將裝配到缺損空間中或其上，以允許缺損癒合，即移植物附著至相鄰結締組織。使用組織密封劑的處理允許移植物牢固地附著至周圍的結締組織並且增強結締組織的細胞的生長。組織密封劑還可以塗覆到組織缺損中。在任何方式下，組織密封劑用於將移植物與周圍的結締組織連接。

通常，組織缺損的治療可以包括將本發明的移植物植入例如由於損傷或由於手術天然缺失的一定體積的缺失組織(組織缺損)中。移植物還可以用於治療表面組織缺損(在其上固定移植物，並且從其發生增強效應至下面的缺損)，例如通過活化或分化的幹細胞從移植物組織遷移到缺損中。

特別優選地，移植物組織包含血管。來自供體移植物組織的血管得到維持並且不需要再生長。移植物中的這樣的血管可以在移植後與組織缺損附近的血管連接，並且允許移植物與具有原始缺損的周圍或鄰近組織的良好結合。

缺損可以在可能需要例如矯形外科手術、頜面外科手術、牙科或整形和重建手術的許多組織中。

使用本發明的組織移植物的缺損和療法實例包括(通過移植物或缺損組織分類)：

軟骨移植物組織可用於治療軟骨缺損。待治療的軟骨類型的缺損包括局灶性軟骨損傷，例如剝脫性骨軟骨炎或創傷性軟骨損傷，例如在膝關節或距骨中；骨關節炎，特別是由於骨關節炎引起的軟骨磨損；椎間盤再生；半月板再生；髓核突出和隨後的微椎間盤切除術引起的椎間盤損傷。轉分化組織移植物可用作生物髓核替代物。它可以用於通過植入成軟骨轉分化移植物作為髓核替代物來治療退行性椎間盤疾病。軟骨移植物組織可以進一步用於治療創傷性或退行性半月板撕裂。在撕裂的半月板的部分切除後，轉分化的移植物可以縫合到半月板缺損中。

韌帶移植物組織可以用於治療韌帶缺損，包括治療膝關節中的創傷性十字韌帶撕裂；治療外側踝韌帶的創傷性撕裂。

腱移植物組織可用於治療腱缺損，包括治療創傷性或退化性肩袖撕裂；治療跟腱撕裂。

骨移植物組織可用於治療骨缺損，包括骨外科手術，例如在脊柱畸形或退行性椎間盤疾病的情況下的脊柱融合術中：成骨轉分化移植物可用於移除椎間盤和製備椎間隙後的籠和椎間隙填充。移植物還可以單獨使用或與BMP組合使用，以通過移植附著到脊柱上來實現脊柱融合。移植物可用於治療骨折後的不癒合，或者移植物可以移植到損傷區域以促進骨癒合。它可以用於治療骨質疏鬆缺損或用於骨增加，包括預防性治療，例如在椎體後凸成形術或椎體成形術中作為椎體骨折的治療或用於預防性骨增加。成骨轉分化移植物可以插入椎體並促成生物骨折癒合。其可用於治療通常需要骨移植的骨缺損，例如動脈瘤和幼年骨囊腫，或用於骨增強，例如在插入牙種植體之前。例如，其可以用於牙科中的竇提升。待根據本發明治療的具有缺損的骨可以是根據骨類型的常見分類的長骨、短骨、扁平骨、籽骨或不規則骨。

可以提供通過本發明的方法製備的移植物用於任何治療性組織缺損治療。

在另一方面還提供了試劑盒，其適合用於實施本發明的方法，特別是將脂肪組織的細胞分化至具有分化細胞的合適的結締組織移植物的方法，並任選進一步適合用於將移植物附著至組織缺損。試劑盒可以包含結締組織特異性生長或分化因子(優選如上所述的)和組織密封劑，優選纖維蛋白膠。可以包括如上所述的任何其它組分。還可以提供孵育容器，例如燒瓶或盤。還提供的可以是調節合適的氣氛的組件，例如CO2燒瓶。

所述試劑盒可以進一步包含軟骨或骨組織標籤或標記物，其適合用於監測分化的進展並且評估轉化到結締組織移植物中的脂肪組織的給定分化階段是否足以插入到缺損中。分化的階段可以如上所述。

本發明的進一步特徵在於以下附圖和實施例，而不限於本發明的這些實施方案。

附圖：

圖1：與顯示不規則、不均勻的表面形成的相應對照(b)相比，成軟骨轉分化脂肪移植物(a)的平滑表面轉化。

圖2：成軟骨轉分化脂肪移植物(a)和相應的對照(d)的阿爾新藍糖胺聚糖染色；脂肪移植物(b)和對照(e)的俾斯麥棕染色；脂肪移植物(c)和對照(f)的番紅O染色。

圖3：成軟骨轉分化脂肪移植物的糖胺聚糖含量。

圖4：通過陽性von Kossa染色(a)和茜素紅染色(b)指示的成骨轉分化脂肪移植物的礦化。相應的對照(d，e)沒有顯示礦化的跡象。與未分化的對照(f)相比，偶氮卡紅(Azan)染色顯示轉分化脂肪移植物(c)中的膠原組織增加。

圖5：成骨轉分化移植物的5μm切片中礦化的定量

圖6：使用HET-CAM血管生成測定評價成骨轉分化移植物的血管生成和組織整合。在體內5天後，移植物顯示良好的組織整合併連接至接受者的容器系統(a，b)。許多血管在移植物內可見(c；箭頭)。如通過陽性von Kossa染色所顯示的，成骨分化得到維持(d)。

圖7：在成軟骨轉分化脂肪組織移植物的植入後14天的膝關節的透明軟骨。移植物很好地整合到接受者組織中。

圖8：分離的神經源性分化間充質幹細胞顯示典型的神經元和軸突形成(圖8a，箭頭)。在對照組中未觀察到軸突和神經元形成(圖8b)。神經源性轉分化脂肪移植物顯示陽性尼氏體染色(圖8c，箭頭)，其在對照組(8d)中未觀察到。

圖9：a)對照脂肪組織，其顯示典型的脂肪組織表型。b)6周後神經源性轉分化脂肪墊：脂泡已被指示陽性甲酚紫染色的神經源性組織代替。c)可以觀察到周圍神經組織的區帶分化，包括神經束膜(黑色箭頭)和神經外膜(灰色箭頭)以及伴隨的血管(黃色箭頭)。d)神經束膜內的尼氏體在神經源性轉分化樣品中可見(箭頭)。

圖10：a)在分化起始後兩周，朝向腱細胞表型(tenocytic phenotype)的分離的間充質幹細胞的分化。b)對照組的未改變的表型。c)顯示圓形取向的腱細胞分化細胞島存在於轉分化脂肪墊中，但不存在於對照組織中(d)。

圖11：生肌分化：a)朝向定向肌細胞的早期分化；b)對照組中無分化。c)脂泡部分地被顯示縱向取向和陽性Goldner染色的肌肉組織替代；d)對照樣品中不存在肌肉組織形成。

實施例：

實施例1：脂肪組織轉分化至透明軟骨移植物

脂肪移植物製備：

在脊柱減壓手術期間獲得的小脂肪活檢被放置在無菌容器中用於運輸到組織培養實驗室。將樣品在無菌鹽水溶液中洗滌以除去汙染性紅細胞。在通過汙染檢查後，將樣品分成兩部分。將A部分(轉分化樣品)在旨在用於間充質幹細胞分化的市售成軟骨分化培養基(Promocell，Heidelberg/Germany)中孵育。為了獲得間充質幹細胞分化，通常將細胞置於含有地塞米松、抗壞血酸-2-磷酸酯、胰島素、亞硒酸、轉鐵蛋白、丙酮酸鈉和轉化生長因子β(TGF-β)的確定培養基15中的聚集體或沉澱培養物中。將B部分(對照)在補充有10％胎小牛血清和2mM L-穀氨醯胺的Dulbecco改良的Eagle培養基與Ham營養混合物F12的1:1混合物中孵育。為了防止細菌汙染，向該兩種培養基中加入50μg/ml慶大黴素。在37℃、5％CO2和90％溼度下進行孵育2-3周。每周更換培養基兩次。

組織學評價：

在孵育期結束時，將樣品在4％甲醛中固定，在磷酸緩衝鹽水中洗滌，並在升高的濃度的乙醇中排乾。將組織包埋在塑化石蠟中，製備5μm切片。通過阿爾新藍、俾斯麥棕和番紅O染色評價成軟骨分化。

糖胺聚糖合成的評價：

在2周的轉分化後，將樣品在溶解於含有1mM EDTA的50mM Tris中的1mg/ml蛋白酶K中消化過夜。使用二甲基-亞甲基藍測定法測量糖胺聚糖含量，並在525nm處讀取吸光度。使用鯊魚硫酸軟骨素產生標準曲線。

形態學結果：

在體外3周的轉分化後，脂肪組織顯示具有平滑表面重塑的緊湊的球形形態(圖1)。

組織學結果：

成軟骨分化的組織學染色在轉分化脂肪組織中是陽性的：糖胺聚糖合成可以通過阿爾新藍染色檢測。通過陽性番紅O染色進一步顯現蛋白聚糖，並且陽性俾斯麥棕染色表明存在軟骨組織典型的細胞外基質(圖2)。

糖胺聚糖合成的評價：

在轉分化過程起始的兩個星期後，轉分化脂肪移植物含有16.56μg糖胺聚糖/mg組織，而對照僅顯示1.92μg/mg的平均糖胺聚糖含量(p<0.0001；圖3)。

實施例2：脂肪組織轉分化至骨移植物

脂肪移植物製備：

在脊柱減壓手術期間獲得的小脂肪活檢被放置在無菌容器中用於運輸到組織培養實驗室。將樣品在無菌鹽水溶液中洗滌以除去汙染性紅細胞。在通過汙染檢查後，將樣品分成兩部分。使A部分(轉分化樣品)經受反覆的機械刺激，隨後在成骨分化培養基中孵育。成骨分化培養基由補充有10％胎小牛血清、0.05mg/ml抗壞血酸、2mM L-穀氨醯胺、1μM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸鈉和1μg/ml瘦素的Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)組成。將B部分(對照)在補充有10％胎小牛血清和2mM L-穀氨醯胺的Dulbecco改良的Eagle培養基與Ham營養混合物F12的1:1混合物中孵育。為了防止細菌汙染，向該兩種培養基中加入50μg/ml慶大黴素。在37℃、5％CO2和95％溼度下進行孵育3周。每周更換培養基兩次。

組織學評價：

在孵育期結束時，將樣品在4％甲醛中固定，在磷酸緩衝鹽水中洗滌，並在升高的濃度的乙醇中排乾。將組織包埋在塑化石蠟中，製備5μm切片。樣品用偶氮卡紅、von Kossa和茜素紅染色。

組織學結果：

如由陽性von Kossa和茜素紅染色所示的，轉分化脂肪移植物顯示出膠原含量的增加和礦化的跡象(圖4)。

礦化的定量：

通過測定成骨轉分化3周後茜素紅染色的光密度(OD)，從5μm切片定量礦化程度。

茜素紅染色結果：

成骨轉分化移植物的平均OD為0.25/5μm切片。相應對照切片的OD為0.12(p<0.005；圖5)

血管生成和組織整合的評價：

使用HET-CAM(Hen Egg Test-Chorionallantoic Membrane)測定法評價血管生成和組織整合。將成骨轉分化移植物異位植入到受精的、無特異性病原體的雞蛋的暴露的絨毛膜尿囊膜上。植入後5天，切除CAM的移植物負載區域並經加工用於組織學分析。

HET-CAM測試結果：

在體內5天後，植入物被良好整合併連接至接受者的血管系統(圖6a，b)。在移植物內可見許多小血管(圖6c；箭頭)。儘管剝奪了分化因子，但是成骨分化得到維持(圖6d)。

實施例3：軟骨損傷的治療

移植物收穫和製備：

在局部麻醉下收穫皮下脂肪活檢。這可以在計劃的外科手術之前大約14天在門診環境中完成。將脂肪組織無菌地置於含有組織培養基的無菌容器中，並且例如如上所述進行處理，即移植物在37℃、5％CO2和90％溼度下進行成軟骨轉分化2周。在計劃的手術當天，將移植物送至手術室。體外轉分化的軟骨移植植入物顯示在圖7中。

缺損製備：

執行小關節切開術，並對缺損仔細清創。通過使用模板(例如無菌錫箔)，製造缺損的精確模具。

移植物製備和植入：

通過使用模板，使移植物適合於缺損的大小。然後使用纖維蛋白膠將移植物植入缺損中。在5分鐘的硬化時間後，用手術刀除去過量的膠，並且使關節彎曲和完全伸展10次。在關節運動期間檢查移植物的穩定性和位置。隨後，閉合傷口。

手術後程序：

患者經歷關節的部分負重(10kg)治療14天，之後進行取決於腫脹的漸進負重。移植物在約8周後完全負重。

實施例4：椎骨骨折的治療：

移植物收穫和準備：

在局部麻醉下收穫皮下脂肪活檢。這可以在計劃的外科手術之前約1-2周在門診環境中完成。將脂肪無菌地切成具有2mm2長度的邊緣的切片，置於含有組織培養基的無菌容器中，並且例如如上所述進行處理，即移植物在37℃、5％CO2和90％溼度下進行成骨轉分化1-2周。在計劃的手術當天，將移植物送至手術室。

手術程序：

患者以俯臥位置被放置在射線可透射的臺上。在螢光鏡檢查下確定切口的位置之後，製作穿刺切口。將接入器械插入並向前移動，直到達到蒂部接觸。確認恰當的軌跡後，使器械前進到椎體內。可以通過導絲或套針獲得椎體的接近。如果需要，可以恢復椎體高度，從而執行椎體後凸成形術程序。

移植物製備和植入：

移植物在無菌施用裝置中遞送。將施用裝置連接至接入裝置。移植物和纖維蛋白在螢光鏡引導下同時注射到椎體中。在已將所需量的移植物插入椎體後，取出接入器械並閉合傷口。

手術後程序：

鬆動(mobilisation)可以在手術的當天開始。推薦支撐直到沒有疼痛，應開具足夠的止痛藥。聚焦於腰椎穩定的鍛鍊計劃應在疼痛情況允許的情況下儘快開始。

實施例5：神經源性轉分化的起始

概念驗證：

通過膠原酶消化從脂肪組織活檢中分離間充質幹細胞。細胞在單層培養中擴增。在獲得足夠量的細胞後，將細胞以3×104個細胞的密度接種到48孔板的兩個孔中。通過加入市售的神經源性分化培養基在一個孔中起始神經源性分化。將剩餘的細胞在對照培養基中培養，所述對照培養基由補充有10％胎小牛血清和2mM L-穀氨醯胺的Dulbecco改良的Eagle培養基與Ham營養混合物F12的1:1混合物組成。為了防止細菌汙染，向該兩種培養基中加入50μg/ml慶大黴素。在37℃、5％CO2和90％溼度下進行孵育。每周更換培養基兩次。3天後，觀察到對神經元樣細胞典型的樹突和軸突的形成(圖8a)。在對照培養基中培養的細胞保持其對間充質幹細胞典型的多邊形形狀(圖8b)。

脂肪移植物製備：

將小脂肪活檢置於無菌容器中用於運輸到組織培養實驗室。將樣品在無菌鹽水溶液中洗滌以除去汙染性紅細胞。在通過汙染檢查後，將樣品分成兩部分。將A部分(轉分化樣品)在旨在用於間充質幹細胞分化的市售神經源性分化培養基(Promocell，Heidelberg/Germany)中孵育。將B部分(對照)在補充有10％胎小牛血清和2mM L-穀氨醯胺的Dulbecco改良的Eagle培養基與Ham營養混合物F12的1:1混合物中孵育。為了防止細菌汙染，向該兩種培養基中加入50μg/ml慶大黴素。在37℃、5％CO2和90％溼度下進行孵育6周。每周更換培養基兩次。

組織學評價：

在孵育期結束時，將樣品在4％甲醛中固定，在磷酸緩衝鹽水中洗滌，並在升高的濃度的乙醇中排乾。將組織包埋在塑化石蠟中，製備5μm切片。通過使用甲酚紫的尼氏體組織化學染色評估神經源性分化。

結果：

在對照組織中沒有觀察到形態學變化(圖9a)。神經源性轉分化移植物顯示出陽性甲酚紫染色，由細胞質內黑-紫色尼氏體的存在指示的(圖8c，箭頭)。在神經源性轉分化樣品中，脂泡逐漸被表現出對於神經細胞典型的陽性甲酚紫染色的含有具有大的核周體的圓形細胞的神經源性組織替代(圖9b)。在轉分化樣品中可以觀察到周圍神經組織的區帶分化，其包含圍繞神經細胞的清晰可辨的神經束膜和神經外膜以及伴隨的血管(圖9c)。在對照樣品中未觀察到尼氏體的形成(圖8d)。

實施例6：生腱分化的誘導

概念的初步驗證：

作為生腱分化培養基的初始評價，通過膠原酶消化從脂肪組織活檢中分離間充質幹細胞。細胞在單層培養中擴增。在獲得足夠量的細胞後，將細胞以5×104個細胞的密度接種到48孔板的兩個孔中。通過加入由補充有1％FCS和10ng/ml BMP-12的DMEM-F12組成的生腱分化培養基在一個孔中起始生腱分化。將剩餘的細胞在對照培養基中培養，所述對照培養基由補充有10％胎小牛血清和2mM L-穀氨醯胺的Dulbecco改良的Eagle培養基與Ham營養混合物F12的1:1混合物組成。為了防止細菌汙染，向該兩種培養基中加入50μg/ml慶大黴素。在37℃、5％CO2和90％溼度下進行孵育。每周更換培養基兩次。在兩周後在分化組中可以看到朝向紡錘形腱細胞的分化(圖10a)。在對照組中未觀察到形態學變化(圖10b)。

脂肪移植物製備：

將小脂肪活檢置於無菌容器中用於運輸到組織培養實驗室。將樣品在無菌鹽水溶液中洗滌以除去汙染性紅細胞。在通過汙染檢查後，將樣品分成兩部分。將A部分(轉分化樣品)在生腱分化培養基中孵育。將B部分(對照)在補充有10％胎小牛血清和2mM L-穀氨醯胺的Dulbecco改良的Eagle培養基與Ham營養混合物F12的1:1混合物中孵育。為了防止細菌汙染，向該兩種培養基中加入50μg/ml慶大黴素。在37℃、5％CO2和90％溼度下進行孵育6周。每周更換培養基兩次。

組織學評價：

在孵育期結束時，將樣品在4％甲醛中固定，在磷酸緩衝鹽水中洗滌，並在升高的濃度的乙醇中排乾。將組織包埋在塑化石蠟中，製備5μm切片。使用H/E染色評價生腱分化。

結果：

在轉分化脂肪墊中存在顯示圓形取向的腱細胞分化組織的島(圖10c)，但其不存在於對照組(d)中。

實施例7：生肌分化的誘導

概念的初步驗證：

作為概念的初步驗證，通過膠原酶消化從脂肪組織活檢中分離間充質幹細胞。細胞在單層培養中擴增。在獲得足夠量的細胞後，將細胞以5×104個細胞的密度接種到48孔板的兩個孔中。通過加入市售的生肌分化培養基在一個孔中起始生肌分化。將剩餘的細胞在對照培養基中培養，所述對照培養基由補充有10％胎小牛血清和2mM L-穀氨醯胺的Dulbecco改良的Eagle培養基與Ham營養混合物F12的1:1混合物組成。為了防止細菌汙染，向該兩種培養基中加入50μg/ml慶大黴素。在37℃、5％CO2和90％溼度下進行孵育。每周更換培養基兩次。兩周後在分化組中可以看到朝向定向肌細胞的分化(圖11a)，但在對照組中未觀察到(圖11b)。

脂肪移植物製備：

將小脂肪活檢置於無菌容器中用於運輸到組織培養實驗室。將樣品在無菌鹽水溶液中洗滌以除去汙染性紅細胞。在通過汙染檢查後，將樣品分成兩部分。將A部分(轉分化樣品)在生肌分化培養基中孵育。將B部分(對照)在補充有10％胎小牛血清和2mM L-穀氨醯胺的Dulbecco改良的Eagle培養基與Ham營養混合物F12的1:1混合物中孵育。為了防止細菌汙染，向該兩種培養基中加入50μg/ml慶大黴素。在37℃、5％CO2和90％溼度下進行孵育6周。每周更換培養基兩次。

組織學評價：

在孵育期結束時，將樣品在4％甲醛中固定，在磷酸緩衝鹽水中洗滌，並在升高的濃度的乙醇中排乾。將組織包埋在塑化石蠟中，製備5μm切片。使用Masson Goldner染色評價生肌分化。

結果：

在分化6周後，脂泡被顯示縱向取向和陽性Goldner染色的肌肉組織部分地替代(圖11c)。在對照樣品中不存在肌肉組織形成(圖11d)。

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