丙酮酸激酶2乙醯化抑制劑及其用途的製作方法
2023-04-23 10:49:21 1
專利名稱：丙酮酸激酶2乙醯化抑制劑及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬分子生物學和醫學領域，涉及一種丙酮酸激酶2 (PKM2)乙醯化抑制劑及其用途，還涉及檢測PKM2K305乙醯化的抗體和檢測方法。
背景技術：
腫瘤屬於代謝性疾病源自於Otto Warburg在上個世紀30年代提出腫瘤細胞代謝概念，即迅速生長的組織中細胞代謝調節(如胚胎或腫瘤)不同於正常成熟細胞，通過糖酵解或Warburg效應，癌細胞比其他細胞以更高的效率吸收葡萄糖並產生能量和快速生長(Warburg, 1956)。研究顯示，正常細胞只有在缺氧的情況下進行糖酵解，而腫瘤細胞即使在不缺氧的情況下也優先進行糖酵解，消耗更多的葡萄糖和產生更多的乳酸，這就是著名的Warburg效應，Warburg先生也因此獲得了諾貝爾醫學獎。隨後醫學界開展了廣泛的相關研究，越來越多的證據表明細胞代謝在腫瘤的發生和發展中起著非常重要的作用，但是關於 它的分子機制還不清楚，許多方面還值得深入探討(Mazurek et al. ,2005);更加引人注目的是，在不同種類的原發和轉移的腫瘤中FDG PET影像都表現為葡萄糖吸收的增高和代謝的改變，加上細胞信號通路研究的突破和實驗手段的創新，尤其是蛋白組學研究手段的大量應用，腫瘤代謝調控的研究重新成為國際研究的熱點。有研究發現，許多代謝酶受到乙醯化的調控；後續的功能研究也表明，代謝酶的乙醯化調控在腫瘤發生發展中可能起著重要作用(Choudhary et al. , 2009 ；Zhao et al.,2010)。研究還發現，丙酮酸激酶是糖酵解過程中的關鍵酶之一，在胚胎組織只表達胚胎型丙酮酸激酶(PKM2)，成年後表達成年型的丙酮酸激酶(PKMl)，但在腫瘤組織又只表達PKM2，而不是PKMl (Mazurek et al.，2005)。最新研究表明，PKM2為一種磷酸化酪氨酸結合蛋白，腫瘤細胞增殖必須通過磷酸化酪氨酸結合來調控PKM2活性(Christofk et al.,2008a ；Christofk et al.，2008b);另外，Myc調控的異構核糖核酸蛋白(HnRNP)可調節PKM的兩種剪接體PKMl和PKM2的比例(David et al.，2009)。上述研究表明，PKM2在腫瘤細胞代謝中的重要作用。在所有腫瘤中都表達PKM2 —直是困惑生物學家的熱點和難點，特別是關於PKM2的翻譯後修飾及其蛋白穩定性國際上未見報導。本發明人的前期研究發現，前列腺癌組織樣品中PKM2受到乙醯化的調控；隨後進行的功能研究發現乙醯化可能調節代謝酶的活性及其降解；基於PKM2不僅在糖酵解中處於丙酮酸產生的上遊，且PKM2存在所有的癌症細胞中而不存在於大多數正常的細胞中，同時對腫瘤細胞的發展又是至關重要的，因此，研究者認為，PKM2是潛在的有前景的癌症治療的靶標。
發明內容
本發明的目的是提供一種丙酮酸激酶2乙醯化抑制劑。本發明的進一步目的是提供所述丙酮酸激酶2乙醯化抑制劑的用途。本發明中，所述的丙酮酸激酶2乙醯化抑制劑，為抑制PKM2 K305乙醯化的抑制齊U，其特徵在於，所述的抑制劑其含有PKM2K305乙醯化及其乙醯化酶和去乙醯化酶。本發明所述的PKM2K305，位於 PKM2 的外顯子 8 中(Homo sapiens 270 KIENHEGVRRFDEILEASDGIMVARGDLGIEIPAEKVFLAQKMM 313)，具有如 SEQ ID No. I 的序列；本發明中，所述的去乙醯化酶包括Sirtl、Sirt2、HDAC5、HDAC6、HDAC7，所述的去乙醯化酶，導致PKM2K305的去乙醯化(如圖2所示)；本發明中，所述的乙醯化酶選自核受體輔激活因子PCAF，核受體輔活化子P300，組蛋白乙醯基轉移酶複合體GCN5或糖結合蛋白(=carbohydrate-binding protein, CBP)所述的乙醯化酶，導致PKM2K305的乙醯化(如圖I所示)；本發明中，抑制乙醯化酶降低PKM2K305的乙醯化(如圖3所示)。
本發明中，檢測了腫瘤組織中的PKM2K305乙醯化表達，檢測結果表明，腫瘤組織中的K305乙醯化明顯高於癌旁組織。在本發明的一個實施例中，前列腺癌及癌旁組織的乙醯化位點特異K305的乙醯化水平顯示，PKM2K305的乙醯化水平在前列腺癌組織中明顯高於癌旁組織；結合多年研究結果，通過分子伴侶介導的自噬和抑制PKM2的酶活導致代謝中間產物的積累，從而促進腫瘤的生長；其中，關聯研究結果顯示，在15例前列腺癌組織和癌旁組織中PKM2 K305的乙醯化水平存在顯著性差異(P < O. 05)，在腫瘤組織中的PKM2K305乙醯化水平明顯高於癌旁組織(如圖5所示)，所述位點的乙醯化水平升高促進腫瘤細胞生長(如表I所示)。表I K305乙醯化/PKM2的比例數據·
X 土 SDpaired sample T test (n-15)
normal tissue0.751士0.371
K305ac/PKM2P=0.004
prostate cancer1.22±0.230本發明的試驗結果表明了所述的PKM2可為腫瘤的治療提供新的靶標，治療的腫瘤包括前列腺癌；同時，可拓展對腫瘤發生及其Warburg效應的理解。本發明提供了一種丙酮酸激酶2乙醯化抑制劑，尤其是一種PKM2K305乙醯化的抑制劑，該抑制劑可有效抑制K305的乙醯化；本發明進一步提供一種用於癌症治療的藥物組合物，尤其是針對降低PKM2K305的乙醯化的靶點藥物；所述的藥物組合物含有安全有效的PKM2乙醯化酶抑制劑和去乙醯化酶或乙醯化酶、以及藥學上可接受的載體或賦形劑；其中，所述的載體包括但並不限於鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合；所述的藥物組合物應與給藥方式相匹配。本發明中，所述的藥物組合物可被製成針劑形式，如採用常規方法用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液進行製備；所述的藥物組合物也可採用常規方法製成片劑和膠囊等；所述的藥物組合物，如針劑、溶液、片劑和膠囊在無菌條件下製造；其中，活性成分的給藥量是治療有效量，如每天0. I微克/千克體重-約10毫克/千克體重；此外，本發明中所述的多肽還可與其他治療劑一起使用。使用所述的藥物組合物時，是將安全有效量的PKM2乙醯化酶和去乙醯化酶或其拮抗劑、激動劑施用於哺乳動物，其中安全有效劑量通常至少約0. I微克/千克體重，且在大多數情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地安全有效劑量是約O. I微克/千克體重-約100毫克/千克體重；具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，熟練醫師在未超出其技能範圍的情況下可自行配製。本發明的另一目的是提供檢測PKM2 K305乙醯化的抗體和PKM2 K305乙醯化的檢測方法；所述的檢測PKM2 K305乙醯化的抗體，是檢測含有乙醯化位點特異K305的乙醯化抗體，製備K305乙醯化抗體的多肽為acetyl-PKM2 (K305)，(多肽IEIPAEKVFLAQ)，具有如SEQ ID No. 2的序列。檢測方法中還包括檢測乙醯化位點特異性的抗體-抗K305的乙醯化抗體(圖6所示)。本發明中，所述的PKM2 K305乙醯化的檢測方法，為檢測所述位點的乙醯化水平、以輔助判斷所述個體的腫瘤是否處於生長/復發期，包括以下步驟(I)製備乙醯化位點特異K305的乙醯化抗體；(2)抽提組織樣品的蛋白質/或製備腫瘤組織石蠟切片； (3)檢測腫瘤組織K305乙醯化水平。本發明的檢測方法中，製備K305乙醯化抗體的多肽為acetyl-PKM2 (K305)，(多肽IEIPAEKVFLAQ)，具有如 SEQ ID No. 2 的序列；所述檢測方法中，檢測腫瘤組織K305乙醯化水平的抗體濃度為I : 500;所述檢測方法中，涉及的蛋白提取、組織切片、抗體製作和免疫組化等技術均可採用本領域的常規操作方法；本領域的技術人員可按所述的常規操作方法，進行蛋白提取、組織切片、抗體製作和免疫組化。本發明所述的檢測方法，可用於對個體的腫瘤進行檢測，尤其是對個體的前列腺癌等進行檢測。在使用所述的PKM2K305乙醯化輔助監測個體的腫瘤是否處於生長/復發期時，還可同時使用降低其乙醯化的其他治療腫瘤的藥劑。一種檢測腫瘤PKM2K305乙醯化的方法，用於檢測腫瘤生長或復發，在腫瘤組織中的PKM2K305乙醯化水平明顯高於癌旁組織，如圖5所示。本發明提供了一種丙酮酸激酶2乙醯化抑制劑，尤其涉及一種PKM2K305乙醯化的抑制劑，該抑制劑可有效抑制K305的乙醯化。本發明還提供相應的檢測方法，所述的檢測方法可檢測腫瘤樣品中的PKM2K305乙醯化的水平，該檢測方法簡單易行、快速高效、成本低廉；利用本方法檢測PKM2K305乙醯化水平，並針對其進行抑制，能為腫瘤代謝診斷和治療提供簡捷的新途徑。
圖I表明PCAF導致PKM2K305的乙醯化。圖2表明Sirtl導致PKM2K305的去乙醯化。圖3表明PCAF敲除導致PKM2K305的乙醯化降低。圖4表明葡萄糖增加PKM2K305的乙醯化。圖5表明前列腺癌中的K305乙醯化水平明顯高於癌旁組織。圖6是K305乙醯化抗體的鑑定圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆；實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照製造廠商所建議的條件。實施例I免疫組化檢測一、實驗材料前列腺組織石蠟切片來自仁濟醫院泌尿外科；PKM2K305乙醯化抗體自備；PSA，PKM2分別從公司購買。二、樣本檢測 實驗共檢測15例前列腺癌及其癌旁組織，每例收集5例石蠟切片，分別進行HE染色，PKM2，PSA和PKM2K305的乙醯化的免疫組織分析，並挑選不同的視野用軟體對染色的強度進行分析，最後進行配對T檢驗。三、檢測結果表I K305乙醯化/PKM2的比例數據·
權利要求
1.一種丙酮酸激酶2乙醯化抑制劑，其特徵在於，含有PKM2K305乙醯化及其乙醯化酶和去乙醯化酶。
2.按權利要求I所述的抑制劑，其特徵在於，所述的PKM2K305，位於PKM2的外顯子8中，具有如SEQ ID No. I的序列。
3.按權利要求I所述的抑制劑，其特徵在於，所述的去乙醯化酶選自Sirtl、Sirt2、HDAC5、HDAC6 或 HDAC7。
4.按權利要求I所述的抑制劑，其特徵在於，所述的乙醯化酶選自PCAF、P300、GCN5或CBP。
5.PKM2K305乙醯化的抗體，其特徵在於，所述的抗體是含有乙醯化位點特異K305的乙醯化抗體，製備該K305乙醯化抗體的多肽為acetyl-PKM2(K305)，具有如SEQ ID No. 2的序列。
6.一種檢測PKM2 K305乙醯化的方法，其特徵在於，檢測所述位點的乙醯化水平，包括以下步驟 (1)製備乙醯化位點特異K305的乙醯化抗體； (2)抽提組織樣品的蛋白質/或製備腫瘤組織石蠟切片； (3)檢測腫瘤組織K305乙醯化水平。
7.按權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述的製備的乙醯化位點特異K305的乙醯化抗體的多肽為acetyl-PKM2 (K305)，具有如SEQ ID No. 2的序列。
8.按權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述的腫瘤組織K305乙醯化水平為抗體濃度為I 500。
9.權利要求I的丙酮酸激酶2乙醯化抑制劑在製備治療癌症藥物中的用途。
10.按權利要求9所述的用途，其特徵是，所述的癌症為前列腺癌。
全文摘要
本發明屬分子生物學和醫學領域，涉及丙酮酸激酶2乙醯化抑制劑及其用途。所述的丙酮酸激酶2乙醯化抑制劑，包括PKM2K305乙醯化的抑制劑，可有效抑制K305的乙醯化。本發明還提供相應的檢測PKM2K305乙醯化的抗體和方法，所述的檢測方法可檢測腫瘤樣品中的PKM2K305乙醯化的水平，且簡單易行、快速高效、成本低廉；利用本方法檢測PKM2K305乙醯化水平，並針對其進行抑制，為腫瘤代謝診斷和治療提供簡捷的新途徑。
文檔編號G01N33/574GK102805860SQ20111014557
公開日2012年12月5日 申請日期2011年5月30日 優先權日2011年5月30日
發明者雷群英, 呂雷, 李 東, 趙地, 管坤良, 熊躍, 林瑞婷, 劉穎 申請人:復旦大學