沙門氏菌特徵顯色液體培養基、其製備方法及沙門氏菌快速檢測方法

2023-04-23 09:46:36

專利名稱：沙門氏菌特徵顯色液體培養基、其製備方法及沙門氏菌快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種沙門氏菌特徵顯色液體培養基及其製備方法，尤其涉及一種以酶解顯色原理為基礎的沙門氏菌特徵顯色液體培養基及其製備方法。同時，本發明還涉及一種沙門氏菌快速檢測方法，尤其涉及一種利用沙門氏菌的特徵酶對沙門氏菌進行快速檢測的方法，屬於食源性致病菌安全監測領域。
背景技術：
沙門氏菌為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，這種細菌在外界環境中的生存能力較強，在水、牛乳及肉類食品中能生存幾個月，其繁殖的最適溫度為37°C，其中最常見的引起食物中毒的沙門氏菌有鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等。沙門氏菌屬一般不分解乳糖、蔗糖和水楊苷；分解葡萄糖產酸產氣(傷寒沙門氏菌除外)，多數形成H2S，不產生靛基質，不液化明膠，不分解尿素，不產生乙醯甲基甲醇，多數能利用枸櫞酸鹽，能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在氰化鉀培養基上不生長，無苯丙氨酸脫氨酶。沙門氏菌對熱的抵抗力不強，60°C加熱15min即死亡。沙門氏菌是一種嚴重威脅人類及動物生命健康的人畜共患病原菌，可引起人和動物急性胃腸炎、傷寒、敗血症以及腸外灶性感染等，已被FAO列為A類病原微生物。歷年來， 沙門氏菌引起的食物中毒常列於細菌性食物中毒的榜首。我國疾病預防控制中心已將沙門氏菌列為食品中要求控制的細菌指標之一。準確及時的檢測手段是預防和控制病原微生物傳播的關鍵。目前沙門氏菌的檢測多採用傳統的微生物培養的方法，主要包括前增菌、選擇性增菌、平板分離、生化試驗和血清學鑑定等步驟，涉及的實驗較多、操作較煩瑣、檢測周期較長(一般需要4 7d)、準備和收尾工作繁重，已無法滿足現階段食品中致病菌快速檢測的現實需要。選擇性增菌使用的培養基主要有四硫磺酸鹽煌綠增菌液(TTB)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、氯化鎂孔雀綠增菌液(MM)等。當雜菌量較大時，這些培養基對腸桿菌科非沙門氏菌的選擇性抑制效果不太理想，給平板分離帶來嚴重幹擾。傳統的平板分離一般利用沙門氏菌產H2S、不發酵乳糖等特點，通過指示劑顏色變化和黑色素沉澱來判定可疑菌落，主要採用的培養基為亞硫酸鉍(BQ瓊脂、HE瓊脂和木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂等。使用這些培養基容易出現假陽性菌落，需要大量的後續鑑別工作，因此專一性和選擇性效果有待改善。由於沙門氏菌能產生特異性較強的辛酯酶，目前市場上已出現一些以酶解顯色原理為基礎的沙門氏菌平板顯色培養基，該類培養基專一性效果較好，可直接用於鑑定，但價格較貴，而且對雜菌的選擇性抑制能力較弱，當雜菌量較大時容易出現錯誤的判斷。沙門氏菌的MUCAPG-methylumbelliferyl-caprylate，4-甲基傘形酮辛酯)螢光法目前已應用於肉品、蛋品、汙水、藥品和臨床診斷上。這種方法是將增菌液在選擇性平板上劃線培養，在可疑的單菌落上滴加MUCAP試劑，能夠被辛酯酶水解釋放螢光物質4-甲基傘形酮，在366nm 紫外燈下產生藍色螢光判別為沙門氏菌陽性。但螢光強度較弱時，容易出現假陰性結果，而且螢光計的使用也給實驗帶來了不便。傳統的微生物培養的方法時至今日仍然是世界微生物學界所普遍接受的甄別微生物的權威方法。為了實現沙門氏菌的快速檢測，有必要對傳統方法進行改進。

發明內容
本發明針對現有技術中的不足，提供了一種將選擇性增菌與顯色鑑定合二為一的沙門氏菌特徵顯色液體培養基及其製備方法。為了解決上述技術問題，本發明通過下述技術方案得以解決一種沙門氏菌特徵顯色液體培養基，組分包括蒸餾水、胰蛋白腖、酵母粉、氯化鈉、 氯化鋰、去氧膽酸鈉、磷酸氫二鉀、組合促進劑、組合抑制劑、特徵性酶解底物、助溶劑、蒸餾水；每IOOmL蒸餾水需其他組分的含量為胰蛋白腖0. 8 1. 2g、酵母粉0. 4 0. Sg、氯化鈉0. 4 0. 8g、氯化鋰0. 3 0. 5g、去氧膽酸鈉0. 1 0. 3g、磷酸氫二鉀0. 1 0. 2g、組合促進劑0. 02 0. 04g、組合抑制劑0. 1 0. 2g、特徵性酶解底物0. 02 0. 04g、助溶劑4 6mL, pH7. 2 士 0· 2。其中，胰蛋白腖和酵母粉提供細菌生長和代謝產酶所需的碳源和氮源；氯化鈉提供均衡的滲透壓；氯化鋰主要用於抑制大腸桿菌、志賀氏菌和芽孢桿菌等；去氧膽酸鈉可用於抑制革蘭氏陽性菌，對沙門氏菌有一定促進作用；磷酸氫二鉀為培養體系提供緩衝，對非沙門氏菌有一定的抑制效果；特徵性酶解底物經沙門氏菌特徵酶作用後直接顯色。作為優選，組合促進劑包括丙酮酸鈉和煙醯胺。可促進沙門氏菌受損細胞的恢復， 有利於沙門氏菌的優勢生長和代謝產酶。作為優選，丙酮酸鈉與煙醯胺的重量比為1 1 1 3。作為優選，組合抑制劑包括檸檬酸鈉和阿卡波糖。主要用於抑制革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌。作為優選，檸檬酸鈉與阿卡波糖的重量比為2 1 1 3。抑制劑和促進劑的作用效果依賴於其濃度。例如，去氧膽酸鈉當濃度較低時能促進沙門氏菌的生長，但對革蘭氏陽性菌的抑制作用減弱。添加組合抑制劑可輔助抑制革蘭氏陽性菌，同時對志賀氏菌、芽孢桿菌等也有良好的抑制效果。因此，抑制雜菌和促進沙門氏菌的生長是各種培養基添加劑選擇性協同作用的結果。作為優選，特徵性酶解底物為辛酯類底物，含顯色基團，經沙門氏菌特徵酶作用後直接顯色.作為優選，辛酯類底物為吲哚辛酯。作為優選，助溶劑為二甲亞碸。不需乳化，直接促進特徵性酶解底物均勻分散於液
體培養基中。所述的沙門氏菌特徵顯色液體培養基的製備方法，包括以下步驟將胰蛋白腖、酵母粉、氯化鈉、氯化鋰、去氧膽酸鈉、磷酸氫二鉀、組合促進劑、組合抑制劑、蒸餾水按比例混合，加熱溶解，冷卻後調PH7. 2士0. 2，115°C滅菌15min，冷卻至室溫，作為母液，備用；將特徵性酶解底物按比例於助溶劑中充分溶解，過濾除菌，加入母液中，搖勻，成為液體培養基， 放冰箱保存。本發明的另一個目的在於提供一種通過沙門氏菌的特徵酶對底物進行酶解顯色為基礎的沙門氏菌快速檢測方法，減少假陽性和假陰性出現的機率，提高檢測效率和檢測結果的準確性。包含前增菌培養和顯色鑑定兩步。沙門氏菌能產生特異性較強的特徵酶， 即辛酯酶，特徵酶可以對底物進行酶解顯色。沙門氏菌快速檢測方法，使用沙門氏菌特徵顯色液體培養基，包括以下步驟(a)前增菌培養將25g樣品置於225mL緩衝蛋白腖水中，混合均勻後37°C靜止培養8 10h，得增菌液；(b)顯色鑑定取ImL增菌液加入9mL沙門氏菌特徵顯色液體培養基中，混合均勻後37°C靜止培養1 2d，若沙門氏菌特徵顯色液體培養基呈紫色，說明該樣品存在沙門氏菌。將選擇性增菌與顯色鑑定合二為一，選擇性增菌有利於沙門氏菌的生長和產酶， 減少檢測的幹擾因素；顯色鑑定利用酶的專一性，採用特徵底物，通過酶解顯色直接判斷結^ ο按照本發明的技術方案，本發明針對沙門氏菌特徵酶的酶解特性，開發出沙門氏菌特徵顯色液體培養基，將選擇性增菌與顯色鑑定合二為一，並以此為基礎建立了沙門氏菌快速檢測方法，該方法不需特殊儀器設備，僅憑肉眼判斷結果，可操作性強，適合於大通量樣品的檢測。本發明操作方便、特異性強、準確度高，檢測周期由傳統檢測方法的4 7d 縮短為2 3d，減少了大量人力、物力消耗，檢測效率大大提高，可廣泛應用於食品衛生、環境監測等領域。本發明提供的沙門氏菌特徵顯色液體培養基配製簡單，易於產業化生產。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明作進一步詳細描述。實施例1沙門氏菌特徵顯色液體培養基，配方為胰蛋白腖0. Sg、酵母粉0. 4g、氯化鈉 0. 4g、氯化鋰0. 3g、去氧膽酸鈉0. lg、磷酸氫二鉀0. lg、組合促進劑0. 02g、組合抑制劑 0. lg、特徵性酶解底物0. 02g、助溶劑4mL、蒸餾水100mL。沙門氏菌特徵顯色液體培養基的製備方法將上述胰蛋白腖、酵母粉、氯化鈉、氯化鋰、去氧膽酸鈉、磷酸氫二鉀、組合促進劑、組合抑制劑、蒸餾水按比例混合，加熱溶解，冷卻後調pH7.2，115°C滅菌15min，冷卻至室溫，作為母液，備用；將特徵性酶解底物按比例於助溶劑中充分溶解，過濾除菌，加入母液中，搖勻，成為液體培養基，4°C冷藏保存。當滅菌溫度升高到121°C，滅菌時間超過15min時，組合促進劑和組合抑制劑容易發生部分改性，影響作用效果。因此，母液的滅菌溫度不高於115°C，滅菌時間不超過 15min。其中，組合促進劑為丙酮酸鈉和煙醯胺，重量比，丙酮酸鈉煙醯胺=1 1 ；組合抑制劑為檸檬酸鈉和阿卡波糖，重量比，檸檬酸鈉阿卡波糖=1 1，特徵性酶解底物為吲哚辛酯，助溶劑為二甲亞碸。吲哚辛酯在溫度較高時不穩定，直接加入母液進行滅菌會發生自行降解，影響結果的判斷。所以，底物溶解後採用過濾除菌的方式除菌，然後加入冷卻至室溫的母液中。辛酯類底物為脂溶性物質，在水溶液中呈油滴狀，不利於辛酯酶的作用。二甲亞碸是一種滲透性保護劑，對細胞幾乎無毒性，可與水以任意比例混合，並能溶解一般的有機溶劑」。所以，用二甲亞碸溶解辛酯類底物，使其完全溶於特徵顯色液體培
養基中。沙門氏菌特徵顯色液體培養基可以選擇性抑制非沙門氏菌，促進沙門氏菌的復甦和產酶，同時選擇性增菌和顯色鑑定合二為一，縮短檢測時間，顯色鑑定用特徵性酶解底物，通過沙門氏菌產辛酯酶水解顯色，判定沙門氏菌的存在。實施例2沙門氏菌特徵顯色液體培養基，配方為胰蛋白腖1. 0g、酵母粉0. 6g、氯化鈉 0. 6g、氯化鋰0. 4g、去氧膽酸鈉0. 2g、磷酸氫二鉀0. 15g、組合促進劑0. 03g、組合抑制劑 0. 15g、特徵性酶解底物0. 03g、助溶劑5mL、蒸餾水100mL。其中，組合促進劑為丙酮酸鈉和煙醯胺，重量比，丙酮酸鈉煙醯胺=1 2 ；組合抑制劑為檸檬酸鈉和阿卡波糖，重量比，檸檬酸鈉阿卡波糖=1 3，特徵性酶解底物為吲哚辛酯，助溶劑為二甲亞碸。沙門氏菌特徵顯色液體培養基的製備方法將上述胰蛋白腖、酵母粉、氯化鈉、氯化鋰、去氧膽酸鈉、磷酸氫二鉀、組合促進劑、組合抑制劑、蒸餾水按比例混合，加熱溶解，冷卻後調pH7. 4，115°C滅菌15min，冷卻至室溫，作為母液，備用；將特徵性酶解底物按比例於助溶劑中充分溶解，過濾除菌，加入母液中，搖勻，成為液體培養基，4°C冷藏保存。實施例3沙門氏菌特徵顯色液體培養基，配方為胰蛋白腖1. 2g、酵母粉0. Sg、氯化鈉 0. Sg、氯化鋰0. 5g、去氧膽酸鈉0. 3g、磷酸氫二鉀0. 2g、組合促進劑0. 04g、組合抑制劑 0. 2g、特徵性酶解底物0. 04g、助溶劑6mL、蒸餾水100mL。其中，組合促進劑為丙酮酸鈉和煙醯胺，重量比，丙酮酸鈉煙醯胺=1 3 ；組合抑制劑為檸檬酸鈉和阿卡波糖，重量比，檸檬酸鈉阿卡波糖=2 1，特徵性酶解底物為吲哚辛酯，助溶劑為二甲亞碸。沙門氏菌特徵顯色液體培養基的製備方法將上述胰蛋白腖、酵母粉、氯化鈉、氯化鋰、去氧膽酸鈉、磷酸氫二鉀、組合促進劑、組合抑制劑、蒸餾水按比例混合，加熱溶解，冷卻後調pH7.0，115°C滅菌15min，冷卻至室溫，作為母液，備用；將特徵性酶解底物按比例於助溶劑中充分溶解，過濾除菌，加入母液中，搖勻，成為液體培養基，4°C冷藏保存。實施例4一種沙門氏菌快速檢測方法，以沙門氏菌特徵顯色液體培養基為核心。沙門氏菌快速檢測方法具體包含前增菌培養和顯色鑑定兩步，整個檢測過程需 2 3d。前增菌培養主要在於促進沙門氏菌的復甦和增殖，以利於後期的產酶。顯色鑑定是利用沙門氏菌特徵酶(辛酯酶)的酶解特性，將無色辛酯類底物加入沙門氏菌特徵顯色液體培養基中，經辛酯酶水解釋放顯色基團，以此判斷沙門氏菌的存在。前增菌培養具體步驟為將25g樣品置於225mL緩衝蛋白腖水中，混合均勻後 37°C靜止培養他，得增菌液。緩衝蛋白腖水為沙門氏菌檢測常用的前增菌培養基，緩衝蛋白腖水無選擇性，過長的前增菌時間(18 Mh)不利於選擇性增菌過程中雜菌的控制，有效培養時間控制在 8 10h。緩衝蛋白腖水包括蛋白腖、氯化鈉、磷酸鹽緩衝液，其中蛋白腖提供碳源和氮源以滿足細菌生長的需求，氯化鈉可維持均衡的滲透壓，磷酸鹽緩衝液提供PH緩衝以利於沙門氏菌的生長。顯色鑑定具體步驟為取ImL增菌液加入9mL沙門氏菌特徵顯色液體培養基中，混合均勻後37°C靜止培養ld，若培養基呈紫色，說明該樣品為沙門氏菌陽性，即存在沙門氏菌；若培養基不變色，說明該樣品為沙門氏菌陰性。顯色時間與沙門氏菌汙染程度有關。利用沙門氏菌特徵顯色液體培養基，使得選擇性增菌和顯色鑑定合二為一，可提高檢測的專一性和特異性，省去後續大量的鑑定步驟，大大縮短檢測周期。選擇性增菌可抑制雜菌生長，有利於沙門氏菌的優勢生長和產酶，減少檢測的幹擾因素。選擇性增菌可抑制沙雷氏菌的生長，消除它對沙門氏菌酶解顯色判定的幹擾。實施例5沙門氏菌快速檢測方法，包括前增菌培養和顯色鑑定。前增菌培養具體步驟為將25g樣品置於225mL緩衝蛋白腖水中，混合均勻後 37°C靜止培養9h，得增菌液。顯色鑑定具體步驟為取ImL增菌液加入9mL沙門氏菌特徵顯色液體培養基中，混合均勻後37°C靜止培養1. 5d，若培養基呈紫色，說明該樣品為沙門氏菌陽性；若培養基不變色，說明該樣品為沙門氏菌陰性。實施例6一種沙門氏菌快速檢測方法，以沙門氏菌特徵顯色液體培養基為核心。前增菌培養具體步驟為將25g樣品置於225mL緩衝蛋白腖水中，混合均勻後 37°C靜止培養10h，得增菌液。顯色鑑定具體步驟為取ImL增菌液加入9mL沙門氏菌特徵顯色液體培養基中，混合均勻後37°C靜止培養2d，若培養基呈紫色，說明該樣品為沙門氏菌陽性；若培養基不變色，說明該樣品為沙門氏菌陰性。實施例7本發明的特異性試驗將大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、普通變形桿菌、沙雷氏菌分別接入緩衝蛋白腖水中，進行前增菌培養， 得到增菌液。將增菌液接入沙門氏菌特徵顯色液體培養基中，培養1 2d，分別進行平板計數和顯色觀察，結果見表1。結論本發明對沙門氏菌的檢測有明顯特異性，除普通變形桿菌外，其它雜菌幾乎均被抑制，有利於沙門氏菌的生長和產酶。沙門氏菌屬(包括各亞屬)均產生辛酯酶，這一性能是腸桿菌科除沙雷氏菌屬外其它各屬細菌所不具備的。在選擇性增菌過程中沙雷氏菌被抑制，不會干擾沙門氏菌的檢測。沙門氏菌辛酯酶作用於辛酯類底物產生特徵顏色為紫色。表1沙門氏菌快速檢測方法的特異性試驗結果
權利要求
1.沙門氏菌特徵顯色液體培養基，其特徵在於，組分包括蒸餾水、胰蛋白腖、酵母粉、 氯化鈉、氯化鋰、去氧膽酸鈉、磷酸氫二鉀、組合促進劑、組合抑制劑、特徵性酶解底物、助溶劑、蒸餾水；每100 mL蒸餾水需其他組分的含量為胰蛋白腖0.8 1.2 g、酵母粉0.4 0. 8 g、 氯化鈉0.4 0.8 g、氯化鋰0.3 0.5 g、去氧膽酸鈉0.1 0.3 g、磷酸氫二鉀0. 1 0.2 g、組合促進劑0.02 0. 04 g、組合抑制劑0.1 0.2 g、特徵性酶解底物0.02 0. 04 g、 助溶劑 4 6 mL，pH 7. 2 士0. 2。
2.根據權利要求1所述的沙門氏菌特徵顯色液體培養基，其特徵在於，組合促進劑包括丙酮酸鈉和煙醯胺。
3.根據權利要求2所述的沙門氏菌特徵顯色液體培養基，其特徵在於，丙酮酸鈉與煙醯胺的重量比為1:廣1:3。
4.根據權利要求1所述的沙門氏菌特徵顯色液體培養基，其特徵在於，組合抑制劑包括檸檬酸鈉和阿卡波糖。
5.根據權利要求4所述的沙門氏菌特徵顯色液體培養基，其特徵在於，檸檬酸鈉與阿卡波糖的重量比為2:廣1:3。
6.根據權利要求1所述的沙門氏菌特徵顯色液體培養基，其特徵在於，特徵性酶解底物為辛酯類底物。
7.根據權利要求6所述的沙門氏菌特徵顯色液體培養基，其特徵在於，辛酯類底物為吲哚辛酯。
8.根據權利要求1所述的沙門氏菌特徵顯色液體培養基，其特徵在於，助溶劑為二甲亞碸。
9.根據權利要求1所述的沙門氏菌特徵顯色液體培養基的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟將胰蛋白腖、酵母粉、氯化鈉、氯化鋰、去氧膽酸鈉、磷酸氫二鉀、組合促進劑、 組合抑制劑、蒸餾水按比例混合，加熱溶解，冷卻後調PH 7. 2士0.2，115 °C滅菌15 min，冷卻至室溫，作為母液，備用；將特徵性酶解底物按比例於助溶劑中充分溶解，過濾除菌，加入母液中，搖勻，成為液體培養基，保存備用。
10.一種沙門氏菌快速檢測方法，其特徵在於，使用權利要求1所述的沙門氏菌特徵顯色液體培養基，包括以下步驟(a)前增菌培養將25 g樣品置於225 mL緩衝蛋白腖水中，混合均勻後37 ！靜止培養8 10 h，得增菌液；(b)顯色鑑定取1 mL增菌液加入9 mL沙門氏菌特徵顯色液體培養基中，混合均勻後靜止培養M 48h，若沙門氏菌特徵顯色液體培養基呈紫色，說明該樣品存在沙門氏菌。
全文摘要
本發明涉及食品微生物安全監測領域，公開了沙門氏菌特徵顯色液體培養基、其製備方法及沙門氏菌快速檢測方法。沙門氏菌特徵顯色液體培養基的主要成分是胰蛋白腖、酵母粉、氯化鈉、氯化鋰、去氧膽酸鈉、磷酸氫二鉀、組合抑制劑、組合促進劑、特徵性酶解底物、助溶劑。本發明涉及的快速檢測方法包含前增菌培養和顯色鑑定兩步，特點是沙門氏菌特徵酶水解對應底物使培養基呈紫色，以此快速判斷沙門氏菌的存在；加入促進劑，有利於沙門氏菌受損細胞的恢復和促進生長；加入抑制劑，選擇性抑制其它雜菌的生長，以減少它們對檢測的幹擾。本發明具有以下優點操作簡便，檢測周期短，特異性強，準確度高，適合於食品中沙門氏菌的大通量檢測。
文檔編號C12Q1/04GK102433373SQ20111041745
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月14日 優先權日2011年12月14日
發明者周育, 張巧豔, 徐俊鋒 申請人:浙江省農業科學院