用於檢測j亞群禽白血病病毒的斑點雜交方法

2023-04-23 02:17:01

專利名稱：用於檢測j亞群禽白血病病毒的斑點雜交方法
技術領域：
本發明涉及一種用於檢測J亞群禽白血病病毒的斑點雜交方法。
背景技術：
J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒(ALV-J)引起的一種腫瘤性疾病。臨床 感染主要表現為髓細胞瘤、免疫耐受、高死亡率和生長遲緩。目前，以J亞群禽白血病為主 的腫瘤性疾病在雞群中蔓延，特別是血管瘤型J亞群禽白血病的爆發給我國養禽業帶來巨 大的經濟損失。1、J亞群禽白血病在我國雞群發病特點(1)早期感染普遍、發病日齡明顯提前。目前在青年雞群或開產前的雞群中J亞群 白血病已成為常見病。(2)感染率及發病率居高不下。近10年來，在肉種雞、蛋種雞中感染率均在10%
左右ο(3)宿主範圍擴展。J亞群禽白血病最初在肉雞中發病，目前在蛋雞群中高發，我 國特有雞種麻雞、柴雞及蘆花雞中也檢出了 ALV-J，J亞群白血病宿主範圍正在明顯擴大。(4)致病性增強。蛋雞及地方雞中發現的腫瘤要比肉種雞中的病變更為嚴重，在患 病肉雞病變器官從未見過的髓細胞瘤，卻在蛋雞中比較常見，如頸部髓細胞瘤、腰薦髓細胞 瘤、腸髓細胞瘤等。(5)腫瘤趨於多樣化。目前，我國感染雞群中出現了諸多以前罕見的腫瘤，如血管 瘤、成紅細胞瘤、肝細胞癌、腺癌、纖維瘤、纖維肉瘤和輸卵管癌等。2、禽腫瘤性疾病混合感染加大了診斷難度目前以ALV-J為主的禽腫瘤性疾病在蛋雞群中廣泛流行，與馬立克氏病、網狀內 皮增生症等腫瘤性疾病混合感染頻發，國內報導從感染ALV-J腫瘤中檢測出馬立克氏病病 毒和網狀內皮增生症病毒、從馬立克疫苗中發現禽白血病病毒的汙染。近年來，國內外均在 雞群中發現ALV群內的混合感染，這大大增加了疾病的診斷難度，給養禽業帶來巨大的經 濟損失。3、J亞群禽白血病的診斷方法研究現狀目前對J亞群禽白血病的診斷，可通過臨床剖檢和組織病理學檢查初步診斷，進 一步確診需要通過間接免疫螢光或ELISA、PCR方法實現。間接免疫螢光方法需要對病毒分離鑑定，利用特異性單克隆抗體進行，具有周期 長、成本高易於出現非特異性抗原反應幹擾等缺點；目前，我們使用的ELISA試劑盒產於國 夕卜，需要同時檢測抗原和抗體進行綜合性診斷，而且檢測成本高，價格昂貴，同時由於ALV-J gp85基因高度變動，使國外檢測試劑盒對國內毒株的檢測結果不確實；PCR技術容易受到 很多因素幹擾，並可能出現假陽性和假陰性結果。鑑於以上診斷手段具有易受非特異性幹擾、不能全面確診的缺點，對於大規模爆 發J亞群禽白血病的情況，我們急需一種快速準確而又經濟實用的診斷方法。
4, ALV-J env基因具有重要的生物學功能env基因是ALV-J病毒特異性生物學功能基因，包括gp85和gp37兩個結構基因。 gp85基因編碼表面蛋白(SU)，gp37基因編碼跨膜蛋白(TM)，是病毒表面兩個重要的抗原。 env基因對於病毒分型及感染轉錄具有重要的生物學意義。基於此，通過比較國內外各J亞群禽白血病病毒代表毒株env基因同源性，從gp37 基因設計出高度保守長度約248bp目的基因片段，用以作為製備核酸探針的基序。迄今為止，我國報導的禽血病為A、B、J亞群，C、D亞群僅出現在國外，在我國未見 報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種用於檢測J亞群禽白血病病毒的斑點雜交方法，為J亞 群禽白血病及其他禽腫瘤性疾病的鑑別診斷提供一種新的精準有效檢測手段，以降低養禽 業因ALV-J感染而造成的經濟損失。本發明的主要內容通過DNAstar分析軟體比較確定ALV-J各代表毒株env (囊膜 蛋白基因)保守基因序列；製備標記ALV-J核酸探針；明確核酸探針與提取接毒細胞DNA斑 點雜交的最佳反應條件。核酸探針與接毒細胞反應最適溫度以及探針反應濃度是斑點雜交反應的關鍵。與現有技術相比，本發明的優點是1、本發明是基於ALV-J囊膜蛋白env保守基因而製備的ALV-J核酸探針，這在國 內尚屬首次，該探針特異性強，檢測效果精準。2、本發明製備的檢測J亞群禽白血病斑點雜交方法可以對ALV其他亞群、禽馬立 克氏病、網狀內皮組織增生症進行鑑別診斷，若感染ALV-J白血病，可以檢測到ALV-J反應 陽性，而ALV其他亞群、馬立克氏病和網狀內皮增生症反應陰性。3、本發明可以提高診斷的精準度，減少檢測的成本，大幅度降低因J亞群禽白血 病造成的直接和間接經濟損失，這是現有J亞群禽白血病診斷手段所不能達到的效果。


圖1為本發明檢測J亞群禽白血病病毒的斑點雜交流程圖。圖1中，1是提取接毒細胞DNA樣品，2固定DNA，3是預雜交，4是製備核酸探針，5 是標記核酸探針，6是加入標記核酸探針，7是雜交，8是漂洗，9是斑點雜交檢測陽性結果。圖2為ALV-J斑點雜交檢測結果。圖2中，1是檢測ALV-A毒株DNA結果；2是檢測ALV-B毒株DNA結果；3是檢測馬 立克氏病病毒DNA結果；4是檢測ALV-J寧夏毒株DNA結果；5是檢測網狀內皮組織增生症 病毒DNA結果；6是正常細胞DNA陰性對照；7是酶切DNA片段陽性對照。說明迄今為止，我國報導的禽血病為A、B、J亞群，C、D亞群僅出現在國外，在我 國未見報導。據此，ALV的陽性對照選擇A、B亞群。
具體實施例方式下面結合附圖對檢測ALV-J的斑點雜交方法作進一步的詳細說明。
1、通過DNAstar分析軟體比較同源性確定ALV-J各代表毒株erw (囊膜蛋白基因) 保守基因序列caagccatgaaggaacatacagagaagatacgggtggaagatgatcccataggggattggtttacgcgcacgtttggtgatctaggaaggtggctcgcgaaaggtgttaagacgctactgtttgccttgcttgtcatagcctgtctattagctatcattccatgtgtaatcaagtgctttcaggattgtctatcgagaacaatgaatcagtttatggatgaacgcataagatatcatagaattaggga2、利用隨機引物法進行地高辛標記探針步驟如下向離心管中加IygDNA模板、高壓滅菌的雙蒸水至最終體積為16 μ 1 ；沸水水浴 IOmin變性DNA，迅速放入冰水中冷卻2min ；力卩4μ 1地高辛引物混合至離心管中並簡單離 心；在37°C溫箱內孵化20h以上；65°C加熱IOmin終止反應，即標記探針。3、經過反覆試驗，確定ALV-J核酸探針與ALV接毒細胞DNA的最佳雜交反應程序， 基本步驟如下裁一張適當大小帶正電尼龍膜，劃好格子(0.7mmX0.7mm)；提取接毒細胞DNA Ιμ 點於膜上(流程圖1)，稍微涼幹；將尼龍膜放於變性液(0. 5mol/LNa0H, 1. 5mol/ L NaCl)變性 lOmin，再放於中和液(0. 5mol/L Tris-cl，3. Omol/LNaCl)中和 5min ；用 2 X SSC (0. 03mol/L檸檬酸鈉，0. 3mol/L NaCl)衝洗lmin，處理後的尼龍膜可放在2_8°C較 長時間保存；將尼龍膜放於80°C烤箱幹烤2h，固定DNA(流程圖2)；將尼龍膜加入裝有地高 辛預雜交液(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I)的無菌三角 瓶中，42°C，30min，其間經常搖晃(流程圖3)；加冷卻的標記探針(濃度50-80ng/μ 1)於 預熱雜交液，混合後不產生泡沫，即製備成探針雜交液(探針稀釋濃度20-30ng/ml左右)； 將尼龍膜放於含有探針的雜交液中(流程圖7)，溫度範圍42-54°C，培養過夜(IOh) 』雜 交結束後，取尼龍膜放於洗液I (2X SSC，0. 1% SDS)中衝洗2次，每次5min，常溫15_25°C 持續攪動；然後放於提前預熱到65-68°C洗液II (0. 5XSSC,0. 1 % SDS)中衝洗2次，每 次15min ；室溫下，將尼龍膜放培養皿衝洗液中((0. lmol/L馬來酸、0. 5mol/L NaCl,0. 3% Tween 20))內浸泡l_5min ；放入100ml新配置封閉液中(0. lmol/L馬來酸溶液1 10稀 釋)浸泡，37°C搖晃30-60min ；接著放入抗體稀釋液(Anti-Digoxigenin-AP用Blocking solutionl 5000稀釋)中浸泡30min ；然後在衝洗液中室溫洗膜2次，每次15min ；在20ml 檢測液中(0. lmol/L Tris-cl ；0. lmol/L NaCl)平衡2-5min (流程圖8)；避光，觀察檢測結 果呈陽性(流程圖9)，建立了 ALV-J斑點雜交檢測方法。從圖2中的檢測結果可以看到1、2、3結果陰性，4、5結果陽性，即可確定檢測結果。圖2中結果說明了本發明檢測J亞群禽白血病的斑點雜交效果明顯。本發明應用於禽白血病J亞群的病毒快速檢測，通過該斑點雜交方法有效地提高 了診斷速度，並且能對禽白血病各亞群、馬立克氏病、網狀內皮組織增生症進行鑑別診斷， 降低了養禽業因ALV-J感染而造成的經濟損失，為禽腫瘤性病毒診斷方法提供了一種新的 思路和方法。
權利要求
一種用於檢測J亞群禽白血病病毒的斑點雜交方法，其特徵在於通過此較國內外各J亞群禽白血病病毒代表毒株env基因同源性，從gp37基因設計出高度保守長度約248bp目的基因片段，用以作為製備核酸探針的基序，位置在Hprs 103原型毒株基因序列第6736 6983bp之間，合成該目的基因，進行大量克隆；製備標記核酸探針，其探針的標記濃度在50 80ng/μl；運用斑點雜交的技術，取適當大小帶正電尼龍膜，提取接毒細胞DNA，在尼龍膜上點樣固定DNA，進行預雜交和雜交反應，反應溫度範圍在42 54℃，反應探針濃度在20 30ng/ml，依次在洗液I和洗液II中浸泡、衝洗液衝洗、封閉液和抗體稀釋液中浸泡、衝洗液衝洗、檢測緩衝液中平衡PH值，避光，顯色觀察。
全文摘要
本發明涉及一種用於檢測J亞群禽白血病病毒的斑點雜交方法。所述的核酸探針是基於J亞群禽白血病病毒囊膜env特異性基因序列，長度為248bp，位置在hprs-103原型毒株的第6736bp-6983bp之間，通過合成該目的基因，大量克隆；標記製備ALV-J的核酸探針；提取接毒細胞DNA，用斑點雜交的方法進行檢測，在尼龍膜固定DNA，預雜交和雜交，洗膜，顯色檢測斑點雜交反應陽性。通過摸索ALV-J核酸探針與DNA反應最佳反應溫度為50℃，探針反應濃度25ng/ml，確定用於檢測ALV-J的斑點雜交方法，斑點雜交的結果表明該核酸探針能有效地檢測出ALV-J，對禽白血病各亞群、馬立克氏病、網狀內皮增生症有效地進行鑑別診斷，並且該核酸探針的檢測快捷準確，因此本發明為J亞群禽白血病的診斷提供了新的思路和方法。
文檔編號C12Q1/70GK101967523SQ201010218049
公開日2011年2月9日 申請日期2010年6月27日 優先權日2010年6月27日
發明者劉功振, 張利, 成子強, 王曉偉 申請人:山東農業大學