一種促進水稻生長和防治水稻紋枯病的假單孢菌菌株的製作方法
2023-04-23 02:01:41
專利名稱：一種促進水稻生長和防治水稻紋枯病的假單孢菌菌株的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種假單孢菌屬的菌株，特別是涉及一種利用微生物篩選技術，從水稻葉圍分離獲得的對水稻苗期有較強的促生作用，以及對水稻紋枯病有較好防治效果的假單孢菌菌株。
背景技術：
水稻紋枯病(Rice sheath blight)是我國稻區，特別是華南及長江流域高溫、高溼地區的重要病害，一方面，由於目前推廣的水稻品種缺乏高抗紋枯病基因，利用抗病品種尚未獲得較滿意的防病效果，加之，隨著矮杆品種和雜交水稻的大面積推廣及受水田管理等措施的影響，水稻紋枯病發生面積正逐年擴大，因此導致我國水稻產量的年損失在10％以上；另一方面，目前在水稻生產上主要是使用井岡黴素來防治紋枯病，由於長期單一使用，造成其藥效下降及產生抗藥性，而Monceren等防治紋枯病的化學農藥又存在有毒性及殘留量的問題，且汙染環境，所以探索新的防治途徑是非常必要的。
對水稻紋枯病的生物防治研究目前國外已取得比較大的進展，我國先後在南京、北京、浙江、重慶等地篩選到對水稻紋枯病菌有一定拮抗作用的菌株。陳志誼等調查了水稻部分生理、生化指標和水稻紋枯病的抗性關係，並篩選到對水稻紋枯病菌有較強作用的枯草芽孢桿菌B-916(Bacillus subtilis)；另有報導芽孢桿菌屬A30、R2以及青黴屬(Penicillium spp.)的Z88、木黴屬(Trichoderma spp.)的農抗120放線菌(actinomycetes)等菌株對水稻紋枯病菌有一定的拮抗、防治作用，其中B-916、農抗120在田間試驗中取得了較好的防治效果。但在利用微生物進行農作物病蟲害的防治中，對致黃假單孢菌的研究和利用還沒有見相關報導。
發明內容
本發明的目的旨在克服現有技術的不足，提供一種以四川稻區水稻紋枯病病原菌AG-1作為指示菌株，從水稻葉圍分離獲得的對水稻苗期有較強的促生作用，以及對水稻紋枯病有較好防治效果的假單孢菌菌株。
本發明的具體技術方案如下本發明屬於假單孢菌屬的菌種，該菌株為致黃假單孢菌(Pseudomonas aureofaciens B34)(以下簡稱為B34菌株)，是從我國四川省生態地區的水稻植株的葉圍上分離、篩選出的，其已於2003年5月2日在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NOM203033。
本發明所述的B34菌株具有下述性質A、形態特徵在蛋白腖查氏培養基、牛肉浸汁瓊脂培養基30℃培養2～4天後，用光學顯微鏡和電子顯微鏡進行觀察，B34直杆狀，不呈螺旋狀，細胞單個，寬度為0.7～0.8微米，長度為1.2～2微米，以極生鞭毛運動，不產生鞘或突起物，沒有菌柄，不產生芽孢。菌體革蘭氏染色呈陰性，抗酸染色陰性。
B、細胞壁化學組分分析菌株不含有二氨基庚二酸(diaminopimelic acid)，無特徵性糖。
C、培養特徵a、培養基牛肉浸汁瓊脂菌落微黃，表面光滑，邊緣整齊。
b、桑塔斯瓊脂菌落乳脂色，表面小突起，邊緣平滑。
c、營養瓊脂菌落乳脂色，小脊狀，邊緣粗糙。
d、蛋白腖查氏瓊脂菌落微黃，有突起，邊緣葉片狀。
D、B34菌株的生理、生化特徵B34菌株在6.5％氯化鈉培養基上不生長，接觸酶、氧化酶、硝酸鹽還原反應、精氨酸雙水解酶反應呈陽性；能利用蔗糖作為碳源產果聚糖，能水解卵磷脂、七葉靈及乙醯胺；甲基反應、V-P反應、吲哚反應、H2S反應、賴氨酸脫羧酶反應、鳥氨酸脫羧酶反應、苯丙氨酸脫羧酶反應呈陰性；不能液化明膠，不能利用甘露醇，不能水解澱粉、尿素，脂酶實驗呈陰性。不能利用蜜二糖、L-鼠李糖、肌醇產酸，能利用葡萄糖、果糖、半乳糖、L-阿拉伯糖、核糖產酸。
E、菌種鑑定結果通過形態特徵、細胞壁化學成分，以及革蘭氏染色、抗酸性實驗等結果表明B34菌株形態為杆狀、細胞單個、以極生鞭毛運動，不形成鞘或突起物，沒有菌柄，不產生芽孢，革蘭氏為陰性，抗酸染色為陰性，專性好氧，從細胞壁成分看屬於假單孢菌屬(Pseudomonas)，從培養特徵和生理生化實驗定種原則分析，由於B34菌株的寬度為0.7～0.8微米×1.2～2微米，菌株表面有微黃色調，基內菌體無色素，且生理生化特徵與致黃色假單孢菌很相似，所以菌株定名為致黃假單孢菌(Pseudomonasaureofaciens)。
本發明對水稻苗期有較強的促生作用，且對水稻紋枯病有較好的防治效果，其用量少，見效快，抑菌率達到71.5％以上，有效地解決了水稻病蟲害對現有生物農藥所產生的抗藥性問題。
圖1為B34菌株的菌落形態(20 000×)圖2為B34菌株對水稻紋枯病病原菌的致畸效應(包括A、B和C)圖中標記A為扭曲的菌絲(900×) B為空殼菌絲(500×) C為正常菌絲(1800×)
具體實施例方式實施例1B34菌株的篩選方法將從四川溫江各試驗田採集的水稻根、莖、葉等組織按每份2.5克稱取，用無菌水漂洗3次，再將切成2釐米長的根、莖、葉及菌核，挑取適量置於裝有無菌水的250毫升錐形瓶中，在25℃下以120轉/分的轉速振蕩培養12小時，然後分別吸取1毫升菌液，用濃度梯度法塗布於PDA平板上(馬鈴薯200克、蔗糖10～20克、瓊脂17～20克、水1000毫升)，置於26～28℃恆溫培養箱中培養。待48小時後挑取培養特徵相異的單個菌落，經反覆純化後待測。先用點接法初選，然後把有抑菌圈的菌株採用平板對峙培養法。
用點接法共檢測分離到150個細菌菌株對水稻紋枯病菌菌絲生長有抑制作用。通過對峙法測定篩選到來源於水稻根部編號為B34的菌株，其生長速度最快，經過4次重複測定其抑菌帶寬度達到10.3毫米。
實施例2拮抗菌對水稻紋枯病菌離體防效試驗選拔節期水稻的稻一完全葉，剪去葉尖和葉基，取中部8cm長的葉段。將葉段在發酵菌液(濃度約為108個/毫升)中浸5分鐘，再將處理後的葉段置於濾紙上並放入有無菌水的培養皿中，重複12皿(3葉段/皿)。同時在葉段一端接種直徑為4毫米的同菌齡的紋枯病菌菌絲塊，置於培養箱中光照培養，3天後調查發病葉片數和病斑長度。
B34菌株對水稻紋枯病的離體防效遠高於清水處理，且防效高於井岡黴素。其中，B34菌株的離體防效達到81.00％，井岡黴素的離體防效為73.56％。在田間小區試驗中，B34菌株的防效最高達到48.74％，而井岡黴素的田間防效為27.38％，真菌木黴的田間防效為24.17％。B34菌株還表現出水稻千粒重有較好的促進作用，千粒重為26.31克，而未處理的水稻的千粒重為23.80克，兩者差異顯著。
實施例3拮抗菌抗生性研究A、拮抗菌對紋枯病菌的抑菌率測定將同齡菌絲塊置於經過微孔濾膜過濾的細菌發酵液中浸5分鐘，然後置於PDA平板上28℃培養，清水對照，計算抑菌率。結果抑菌率達到71.5％。
B、拮抗菌對紋枯病菌絲的致畸作用測定將拮抗菌用對峙法接種，挑取對峙邊緣的紋枯病菌絲體和正常菌絲體於普通光學鏡下觀察，並經過電鏡掃描檢測。
通過光學顯微鏡及電子顯微鏡的觀察，可以檢測到正常的紋枯病菌絲大小，其原生質均勻、菌絲呈圓形、健壯、菌絲節間較長。而經B34菌株作用的菌絲體呈嚴重的扭曲、原生質溢出、所剩菌絲體成空殼。
C、拮抗菌對紋枯病菌核萌發的影響將無菌載玻片浸入融化的無菌PDA培養基中，使之表面附上一層培養基瓊脂，取出放在培養皿內，每皿2片，皿內加5毫升無菌水保溼。從預先培養紋枯病菌的平板上篩選大小、形成時間一致的菌核，置於濃度為108個/毫升的發酵菌液中處理10秒，然後放在載玻片的瓊脂上，每片3粒，粒距為1.5釐米，每次處理8片(24粒)，於30℃培養箱中培養，24小時後鏡檢菌核的萌發情況。結果表明，經過菌液處理後菌核萌發指數降低了69.0％。
D、拮抗菌株對菌核形成的影響將同齡直徑為5毫米的紋枯病菌絲塊置於發酵濾液經過微孔濾膜反覆過濾的收集液體與PDA混合的培養基上，置於30℃培養，檢測菌核形成的時間。結果菌核形成時間延長了24小時。
實施例4拮抗菌在水稻植株上的定殖實驗A、抗Amp菌的誘導將B34菌株接種到含有少量氨苄青黴素的YSP液體培養基中，誘導震蕩培養，待3天後，稀釋並塗布含有氨苄青黴素的PDA平板，培養，48小時後挑取單菌落，在逐步加高抗生素的平板上誘導篩選。在PDA平板上轉數代後，挑取拮抗性和外部菌落形態與原菌落無差異的菌株備用。將菌株在YSP液體培養基中以120轉/分培養48小時，待用。
B、定殖曲線的測定將水稻兩優681按常規方法浸種、催芽播於實驗水泥池中，供兩個小區，每小區重複4次，隨機排列。待分櫱盛期噴施菌液。分別在噴施菌液2小時、1天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、17天、20天，從每個重複中隨機剪取葉片20葉，剪成1釐米小段於150毫升無菌水中震蕩培養4小時。然後用常規方法稀釋，塗布於含有最終選擇濃度的PDA平板上28℃培養48小時，記載菌落數。當取到13天時，在其中兩個重複小區噴施營養液(主要成分為土豆浸出液)。取材時間和方法同上處理。依據記載菌落濃度變化，繪製定殖曲線，其中濃度取其常用對數值表示。
結果表明拮抗菌在引入1天後，B34的數量急劇降，隨著進入菌株的適應期，經過拮抗細菌的增殖期後，其數量逐漸下降，進入消退期。待20天後，拮抗菌B34的數量降致105個/毫升，並在水稻葉圍上定植、生長。
C、菌液浸種小區生防試驗將各拮抗細菌於YSP培養基中28℃振蕩培養48小時後，稀釋成濃度約為108個/毫升的菌液，在28℃下浸種48小時，種子催芽2天，播於育秧田中，地膜覆蓋。以井岡黴素、對水稻紋枯病菌有拮抗效果的黃綠木黴的孢子懸液及清水作為對照，木黴孢子濃度為109個/毫升，井岡黴素的濃度為40微克/毫升。待25天後，移栽於水泥池中，單株插栽，株、行距為23.3釐米×26.6釐米，小區隨機排列，小區之間以保護行隔離，試驗田按常規管理。分櫱盛期接種紋枯病菌。距收穫期20天隨機抽取50株調查水稻植株的株高、分櫱數及病情指數。
實施例5拮抗菌株對水稻促生作用每次處理取II優838水稻品種15克，分別用在不同菌株振蕩培養72小時後的菌液中浸12小時，菌液處理後的種子播於培養盤裡，置於生化培養箱中培養，溫度為30～34℃，光、暗時間長度分別為12小時，光照強度3500LUX，重複7次。培養至一葉一心期，分別測定出苗率、葉片、根乾重，按常規方法進行，所用檢驗方法均為多重比較法。
結果表明，水稻苗的地上部分乾重，與用清水浸種的水稻苗的地上部分乾重的差異不顯著(P＞0.01)。而根的乾重，經B34菌株處理的高於清水對照。說明所篩選的拮抗菌株對根的促生作用很明顯，地下部分根系重量比對照增加達到42.8％，而且根系發達程度增加，根毛增多。
實施例6菌株的鑑定A、形態特徵蛋白腖培養基、牛肉浸汁瓊脂上30℃培養2～4天後用電子顯微鏡及光學顯微鏡進行常規的菌體形態觀察並照相。
B、培養特徵在蛋白腖查氏瓊脂、桑塔斯(Santon’s)、牛肉浸汁瓊脂、營養瓊脂4種培養基上30℃培養2～4天後觀察其菌落形狀及菌體顏色。
C、化學分類細胞壁化學組分分析按Hasegawa改進的快速薄板層析法(TCL)進行全細胞水解液的胺基酸和糖型分析。
D、生理生化實驗參照《Bergeys Manual of Systematic Bacteriology》VO1.II的內容對菌株進行生理生化鑑定。
權利要求
1.一種促進水稻生長和防治水稻紋枯病的假單孢菌菌株，其特徵在於致黃假單孢菌(Pseudomonas aureofaciens)B34 CCTCC NOM203033。
2.根據權利要求1所述的一種促進水稻生長和防治水稻紋枯病的假單孢菌菌株，其特徵在於所述的B34菌株具有下述性質A、形態特徵在蛋白腖查氏培養基、牛肉浸汁瓊脂培養基30℃培養2～4天後，用光學顯微鏡和電子顯微鏡進行觀察，B34直杆狀，不呈螺旋狀，細胞單個，寬度為0.7～0.8微米，長度為1.2～2微米，以極生鞭毛運動，不產生鞘或突起物，沒有菌柄，不產生芽孢。菌體革蘭氏染色呈陰性，抗酸染色陰性。B、細胞壁化學組分分析菌株不含有二氨基庚二酸(diaminopimelic acid)，無特徵性糖。C、培養特徵a、培養基牛肉浸汁瓊脂菌落微黃，表面光滑，邊緣整齊。b、桑塔斯瓊脂菌落乳脂色，表面小突起，邊緣平滑。c、營養瓊脂菌落乳脂色，小脊狀，邊緣粗糙。d、蛋白腖查氏瓊脂菌落微黃，有突起，邊緣葉片狀。D、B34菌株的生理、生化特徵B34菌株在6.5％氯化鈉培養基上不生長，接觸酶、氧化酶、硝酸鹽還原反應、精氨酸雙水解酶反應呈陽性；能利用蔗糖作為碳源產果聚糖，能水解卵磷脂、七葉靈及乙醯胺；甲基反應、V-P反應、吲哚反應、H2S反應、賴氨酸脫羧酶反應、鳥氨酸脫羧酶反應、苯丙氨酸脫羧酶反應呈陰性；不能液化明膠，不能利用甘露醇，不能水解澱粉、尿素，脂酶實驗呈陰性。不能利用蜜二糖、L-鼠李糖、肌醇產酸，能利用葡萄糖、果糖、半乳糖、L-阿拉伯糖、核糖產酸。E、菌種鑑定結果通過形態特徵、細胞壁化學成分，以及革蘭氏染色、抗酸性實驗等結果表明B34菌株形態為杆狀、細胞單個、以極生鞭毛運動，不形成鞘或突起物，沒有菌柄，不產生芽孢，革蘭氏為陰性，抗酸染色為陰性，專性好氧，從細胞壁成分看屬於假單孢菌屬(Pseudomonas)，從培養特徵和生理生化實驗定種原則分析，由於B34菌株的寬度為0.7～0.8微米×1.2～2微米，菌株表面有微黃色調，基內菌體無色素，且生理生化特徵與致黃色假單孢菌很相似，所以菌株定名為致黃假單孢菌(Pseudomonasaureofaciens)。
全文摘要
本發明公開了一種以四川稻區水稻紋枯病病原菌AG－1作為指示菌株，從水稻葉圍分離獲得的對水稻苗期有較強的促生作用，以及對水稻紋枯病有較好防治效果的假單孢菌菌株，該菌株為致黃假單孢菌(Pseudomonas aureofaciens B34)，是從我國四川省生態地區的水稻植株的葉圍上分離、篩選出的，其已於2003年5月2日在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NOM 203033，本發明用量少，見效快，抑菌率達到71.5％以上，有效地解決了水稻病蟲害對現有生物農藥所產生的抗藥性問題。
文檔編號A01N63/00GK1519309SQ03117909
公開日2004年8月11日 申請日期2003年5月22日 優先權日2003年5月22日
發明者鄭愛萍, 李平 申請人:鄭愛萍