缺失型α珠蛋白基因的多重PCR檢測的製作方法

2023-05-24 21:12:11 2

專利名稱：缺失型α珠蛋白基因的多重PCR檢測的製作方法
技術領域：
本發明涉及到一種用於醫學檢測人α-珠蛋白基因的多重PCR檢測方法。
背景技術：
α-珠蛋白基因位於第16號染色體短臂末端α-珠蛋白基因簇中。該基因簇包括二個重複的α基因(α2和α1)、一個胚胎期α類基因(ξ2)、三個假基因(ψξ1、ψα2、ψα1)和一個功能未明的基因(θ1)，其序列順序為5』-ξ2-ψξ1-ψα2-ψα1-α2-α1-θ1-3』，全長50kb(Buckle VJ，1988；Lauer J，1980；Michelson AM，1983；Hatton CS，1990)。其中ξ基因編碼ξ珠蛋白鏈，在胎兒早期表達。在胎兒後期至出生後，ξ逐漸被α2，α1所代替。
α2和α1基因處於兩個高度同源的重複單元中，這些單元包括了三個同源的片段(X、Y和Z盒)，其間被三個非同源區(I、II和III)所分隔(圖2A)(Higgs DR，1989)。當減數分裂時，同源染色體間的錯配和不等交換，導致兩α間丟失3.7kb而產生α2-α1融合基因，記作-α3.7(Higgs DR，1989)。由於互換在右側α1基因上進行，α3.7又稱右側缺失(Higgs DR，1984)。當互換發生兩個X片段之間，結果產生缺失左側α2基因4.2kb的染色體，稱為左側缺失，記作-α4.2(Embury SH，1980)。
另外，在東南亞人群中發現有兩個α珠蛋白基因完全缺失的情況，其缺失基因序列達20kb，記作--SEA(Nicholls RD，1985)。由於主要發生在東南亞人群中，又叫東南亞缺失。--SEA是我國南方最常見的缺失類型，其缺失範圍從α-珠蛋白基因簇的基因5』端到高變區(3』HVR)5』端上遊1kb間，含ψα2、ψα1、α2、α1和θ1基因在內的約20kb的大DNA片段。東南亞型(--SEA)，右側缺失(-α3.7)和左側缺失(-α4.2)在我國最常見。
早在1987年，Chehab等(Chehab FF，1987)即將PCR技術運用於對Bart’s水腫胎兒的產前診斷。由於此法是憑陰性擴增結果診斷--SEA突變，故產生假陽性結果的風險甚大。而Chang等(Chang JG，1991)提出的Gap-PCR技術則可克服這種缺陷。
運用PCR技術對--SEA進行基因檢測已很成熟，對於-α3.7和-α4.2兩種缺失型的檢測已日漸成熟。現能夠用三個PCR反應及瓊脂糖凝膠電泳方法快速準確地檢測α-珠蛋白基因的三種缺失型。如能用一管多重PCR完成三項檢測，對於使用者無疑方便了許多。但由於α-珠蛋白基因G-C含量高達70％以上，其擴增片段長，加之基因簇內同源序列多，增加了實驗難度。Shaji RV等人應用多重PCR技術同時檢測-α3.7、-α4.2和--SEA三種缺失，但其擴增的片段太大，且PCR運行時間長，效率也不高(Shaji RV，2000)。Samuel等也發表了他們運用多重PCR技術同時篩查-α3.7、-α4.2、--SEA、--MED、-(α)20.5、以及--FIL六種缺失的研究論文(Samuel，2000)，這一多重PCR體系中包含多種引物，最多能擴增出7條特異擴增帶。

發明內容
針對中國人中最常見的三種缺失型α-地中海貧血的檢測問題，本發明提供了一種快速、穩定、重複性好的單管多重PCR檢測方法。
本發明的技術方案包括對人基因組DNA待測樣品的PCR擴增和對PCR擴增產物進行電泳分析。其特徵在於採用7個(4對)引物P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7組成四重PCR(表1)，分別檢測正常等位基因和缺失等位基因。該PCR體系的引物設計方案包括該PCR體系的引物設計方案為引物P1、P2可從-α3.7缺失的基因中擴增2.0Kb的產物，引物P3、P4則可從-α4.2缺失的基因中擴增1.6Kb的產物，引物P5、P6則可從東南亞缺失的基因中擴增1.3Kb的產物。此外在三種缺失型的共同缺失區域內使用了引物P7，使引物P1、P7可從正常等位基因(αα或αTα)擴增1.8Kb的產物，而不能從三種缺失型的任何一種擴增出產物。因此，引物A、B可同時作為所有這三種缺失型的內對照。
表1檢測α-珠蛋白基因三種缺失型PCR引物序列

本發明的檢測方法其具體檢測過程依次包括下列步驟(1)PCR擴增在滅菌的0.2或0.5mlEppendoef管中，在25μl的反應體系中，分別加入等濃度的7個PCR引物P15』-CCCTCGCCAAGTCCACCCC-3』
P25』-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3』P35』-TTTACCCATGTGGTGCCTCC-3』P45』-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCCC-3』P55』-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3』P65』-CCCACGTTGTGTTCATGGCTG-3』P75』-GACCAGGAAGGGCCGGTGC-3』的混合貯存液7μl。
等濃度的四種脫氧核苷酸dATP，dUTP，dCTP和dGTP的混合貯存液6μl。
反應緩衝液為10μl，其組分為20mmol/L Tris-HCl pH8.9，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2。
石蠟30μl。
加入人基因組DNA1μl，PCR反應用酶1μl，短暫離心後進行PCR循環。PCR循環參數為95℃5min；97℃45s，60℃75s，72℃150s，35個循環；72℃5min。
(2)電泳鑑定PCR產物取PCR產物10μl，加2μl電泳加樣緩衝液，混勻。加入1.0％的瓊脂糖凝膠加樣孔中(其中含有0.6μg/mlEB染料)，6-8V/cm gel電泳約40min。在UVP或紫外燈下觀察結果。結果判定見表2。
表2缺失型α-地中海貧血基因檢測結果判斷

根據本發明所建立的缺失型α-地中海貧血檢測方法，不僅可同時檢測中國人常見的缺失型α-地中海貧血，而且有很好的重複性和穩定性。


圖1檢測α-珠蛋白基因三種缺失型PCR引物設計示意圖有字黑框代表a-珠蛋白基因簇中的5個連鎖的功能基因或假基因，即ψa2、ψa1、a2、a1、θ1。黑色條帶為每種缺失型相應於a-珠蛋白基因簇的缺失區域。
具體實施例方式
實施實例一檢測缺失型α-地中海貧血過程依次包括下列步驟(1)PCR擴增在滅菌的0.2或0.5mlEppendoef管中，在25μl的反應體系中，分別加入等濃度的7個PCR引物P15』-CCCTCGCCAAGTCCACCCC-3』P25』-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3』P35』-TTTACCCATGTGGTGCCTCC-3』P45』-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCCC-3』P55』-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3』P65』-CCCACGTTGTGTTCATGGCTG-3』P75』-GACCAGGAAGGGCCGGTGC-3的混合貯存液7μl。
等濃度的四種脫氧核苷酸dATP，dUTP，dCTP和dGTP的混合貯存液6μl。
反應緩衝液為10μl，其組分為20mmol/L Tris-HCl pH8.9，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2。
石蠟30μl。
加入人基因組DNA1μl，PCR反應用酶1μl，短暫離心後進行PCR循環。PCR循環參數為95℃5min；97℃45s，60℃75s，72℃150s，35個循環；72℃5min。
(2)電泳鑑定PCR產物取PCR產物10μl，加2μl電泳加樣緩衝液，混勻。加入1.0％的瓊脂糖凝膠加樣孔中(其中含有0.6μg/mlEB染料)，6-8V/cm gel電泳約40min。在UVP或紫外燈下觀察結果。結果判定見表2。
實施實例二同時對多人DNA樣品進行缺失型α-地中海貧血篩查的檢測過程依次包括下列步驟(1)PCR擴增在滅菌的0.2或0.5mlEppendoef管中，在25μl的反應體系中，分別加入等濃度的7個PCR引物P15』-CCCTCGCCAAGTCCACCCC-3』P25』-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3』P35』-TTTACCCATGTGGTGCCTCC-3』P45』-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCCC-3』P55』-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3』P65』-CCCACGTTGTGTTCATGGCTG-3』P75』-GACCAGGAAGGGCCGGTGC-3的混合貯存液7μl。
等濃度的四種脫氧核苷酸dATP，dUTP，dCTP和dGTP的混合貯存液6μl。
反應緩衝液為10μl，其組分為20mmol/L Tris-HCl pH8.9，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2。
石蠟30μl。
加入多人(2-6人)基因組DNA混合物1μl(每人DNA量不得低於0.1μg)，PCR反應用酶1μl，短暫離心後進行PCR循環。PCR循環參數為95℃5min；97℃45s，60℃75s，72℃150s，35個循環；72℃5min。
(2)電泳鑑定PCR產物取PCR產物10μl，加2μl電泳加樣緩衝液，混勻。加入1.0％的瓊脂糖凝膠加樣孔中(其中含有0.6μg/mlEB染料)，6-8V/cm gel電泳約40min。在UVP或紫外燈下觀察結果。如只出現一條1.8kb條帶，則所檢測的樣品均為正常人。如除出現一條1.8kb條帶外，還出現1.3kb或/和1.6kb或/和2.0kb，則所測樣品中有缺失型α-地中海貧血患者。應按實施實例一的方法進行確診。
權利要求
1.缺失型人α珠蛋白基因的多重PCR檢測方法，包括對人基因DNA待測樣品的PCR擴增和對經PCR擴增產物進行電泳分析，其特徵在於採用7個(4對)引物P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7組成四重PCR，該PCR體系的引物設計方案為引物P1、P2可從-α3.7缺失的基因中擴增2.0Kb的產物，引物P3、P4則可從-α4.2缺失的基因中擴增1.6Kb的產物，引物P5、P6則可從東南亞缺失的基因中擴增1.3Kb的產物。此外在三種缺失型的共同缺失區域內使用了引物P7，使引物P1、P7可從正常等位基因(αα或α′α)擴增1.8Kb的產物，而不能從三種缺失型的任何一種擴增出產物。
2.根據權利要求1所述的缺失型人α珠蛋白基因的多重PCR檢測方法，其特徵在於其所採用的7條優選引物序列為P15』-CCCTCGCCAAGTCCACCCC-3』P25』-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3』P35』-TTTACCCATGTGGTGCCTCC-3』P45』-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCCC-3』P55』-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3』P65』-CCCACGTTGTGTTCATGGCTG-3』P75』-GACCAGGAAGGGCCGGTGC-3』
3.根據權利要求1或2所述的缺失型人α珠蛋白基因的多重PCR檢測方法，其特徵在於其檢測過程依次包括下列步驟(1)PCR擴增在滅菌的0.2或0.5ml Eppendoef管中，分別加入等體積等濃度的7個PCR引物P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7貯存液，引物濃度範圍為0.1-1.4μg/μl。等濃度的四種脫氧核苷酸dATP，dUTP，dCTP，dGTP。每種dNTP的濃度範圍為50-400μmol/L。反應緩衝液為20mmol/L Tris-HCl pH8.9，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2。加入人基因組DNA，PCR反應用酶，混勻。短暫離心後進行PCR循環。(2)電泳鑑定PCR產物通過電泳後凝膠上出現的螢光條帶的數目和不同的組合來分析判斷結果如出現引物P1、P2的擴增產物2.0Kb條帶，則有-α3.7基因片段；如出現引物P3、P4的擴增產物1.6Kb條帶，則有-α4.2基因片段；如出現引物P5、P6的擴增產物1.3Kb條帶，則有--SEA基因片段。如出現引物P1、P7的擴增產物1.8Kb條帶，則為正常等位基因。
4.根據權利要求3所述的缺失型人α珠蛋白基因的多重PCR檢測方法，其特徵在於其檢測過程依次包括下列步驟(1)PCR擴增在滅菌的0.2或0.5ml Eppendoef管中，在25μl的反應體系中，分別加入等濃度的7個PCR引物P15』-CCCTCGCCAAGTCCACCCC-3』P25』-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3』P35』-TTTACCCATGTGGTGCCTCC-3』P45』-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCCC-3』P55』-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3』P65』-CCCACGTTGTGTTCATGGCTG-3』P75』-GACCAGGAAGGGCCGGTGC-3』的混合貯存液7μl。等濃度的四種脫氧核苷酸dATP，dUTP，dCTP和dGTP的混合貯存液6μl。反應緩衝液為10μl，其組分為20mmol/L Tris-HCl pH8.9，50mmol/L KCl，1.5mmol/LMgCl2。石蠟30μl。加入人基因組DNA 1μl，PCR反應用酶1μl，短暫離心後進行PCR循環。PCR循環參數為95℃5min；97℃45s，60℃75s，72℃150s，35個循環；72℃5min。(2)電泳鑑定PCR產物取PCR產物10μl，加2μl電泳加樣緩衝液，混勻。加入1.0％的瓊脂糖凝膠加樣孔中(其中含有0.6μg/mlEB染料)，6-8V/cm gel電泳約40min。在UVP或紫外燈下觀察結果。
全文摘要
本發明提供一種缺失型人α－珠蛋白基因的PCR檢測方法，本發明採用7個(4對)引物P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7組成四重PCR反應，針對正常等位基因和中國人常見的缺失等位基因(－
文檔編號C12Q1/68GK1626671SQ20031011255
公開日2005年6月15日 申請日期2003年12月10日 優先權日2003年12月10日
發明者李澤松, 耿永堯, 張文 申請人:深圳益生堂生物企業有限公司