氫過氧化物裂合酶基因和植物對非生物脅迫的耐受性的製作方法

2023-05-24 07:43:41 2

專利名稱:氫過氧化物裂合酶基因和植物對非生物脅迫的耐受性的製作方法
氫過氧化物裂合酶基因和植物對非生物脅迫的耐受性
聯邦資助的研究與開發下作出發明的權利聲明
本發明是在國家科學基金會(National Science Foundation)授與的基金號 0543904的政府資助下完成的。政府對本發明擁有某些權利。
發明背景
在動物和植物界，羥脂途徑協調多種生物過程以響應發育和環境刺激。羥脂途徑的產物源自脂肪酸氧化，並被稱作羥脂。在植物中，這些化合物主要源自α-亞麻酸 (a-LeA :18:3)和亞油酸(LA :18:2)的氧化。
通過脂肪酶對複合膜脂的作用啟動羥脂的生物合成從而釋放未酯化脂肪酸。隨後，脂肪氧合酶(亞油酸氧氧化還原酶，L0X)將分子氧引入18:2與18:3的9或13位， 使之轉化成相應的9-或13-氫過氧脂肪酸[9/13-氫過氧十八碳三烯酸(9/13-HP0T)和 9/13-氫過氧十八碳二烯酸(9/13-HP0D)] (Dhondt, S.等，Plant J. 23 :431-440,2000 ； Vick，B. A.，見 Moore，T. S.的 Lipid metabolism in plants (植物中的脂質代謝)，佛羅裡達的 CRC 出版公司，167-191 頁，1993 ；Brash, A. R.，J. Biol. Chem. 274 :23679-23682,1999 ； Narvaez-Vasquez, J.等，Plant Cell 11 :2249-2260,1999) 這些氫過氧化物成為 4 個主要代謝途徑後續作用的底物，這些途徑是過氧酶(POX)、二乙烯基醚合酶(DES)、丙二烯氧合酶(AOS)和氫過氧化物裂合酶(HPL)途徑(Feussner, I.和 Wasternack，C.，Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 53 :275_297，2002)。認為這些途徑中 AOS-和 HPL-分支是兩個主要的關鍵植物脅迫響應途徑。它們競爭相同底物並負責生成脂基信號轉導化合物、抗菌和抗真菌化合物以及芳香化合物(Feussner，I.和festernack，C.，同上；Howe， G. ^P SchiImiller, A. L. ,Curr. Opin. Plant Bio. 5 :230-236,2002) 13-L0X 的 AOS 分支轉化13-HP0T成茉莉酸家族化合物，其包括茉莉酸(JA)、甲基茉莉酸(MeJA)及其代謝前體， 12-氧代-植物二烯酸(120PDA) (Howe, G.和 Schilmiller, A. L,同上)。
儘管擬南芥(Arabidopsis thaliana)具有一種HPL，很多植物品種具有一個以上基因編碼HPL酶。例如，有報導截形苜蓿(Medicago truncatula)有兩種HPL，而苜蓿和大米各有三種 HPL(Noordermeer，Μ. Α.等，Eur. J. Biochem. 267 :2473-2482,2000 ；Chehab, Ε. W.等，Plant Physiol. 141 :121-134，2006)。植物品種間基因數量的這種變化可反映該途徑的差異調節以及最終反映各品種應答不同刺激的多樣性。
HPL酶催化9/13-氫過氧化物的切割並產生多種代謝產物。HPL對9-HP0T/HP0D的作用引起參與果實和葉片氣味與芳香的殺菌性C9醛和酮酸的升高(Vick，B. Α.，見Moore， Τ. S. ,Lipid metabolism in plants (植物的脂質代謝)，佛羅裡達的CRC出版公司，167-191
1993 ；Brash, A. R. ， J. Biol. Chem. 274 :23679-23682,1999 ；Matsui, K. ， Curr. Opin. Plant Biol. 9(3) :274-280,2006 ；Cho, Μ. J.等，J. Food Prot. 67 :1014-1016，2004)。HPL 對13-HP0T/HP0D的活性導致生成綠葉揮發物(GLV)，包括Z-3-己烯醛和正己醛，以及其分別通過醇脫氫酶(ADH)產生的相應醇以及酯(Matsui，K.，Curr. Opin. Plant Biol. 9 (3) 274-280, 2006) 0醯基轉移酶(CHAT)轉化Z-3-己烯醇成乙酸Z-3-己烯酯(d' Auria, J. C.等，Plant J. 49 194-207，2006)。此外，Z—3—己烯醛異構化從而產生E—2—己烯醛。[0008]已顯示三種大米HPL基因(HPL1，HPL2和HPU)存在的水平和表達方式都不同 (Chehab，E.W.等，Plant Physiol. 141(1) 121-34，2006)。體外酶試驗測得三種對應編碼酶的底物特異性，聯同其在哥倫比亞-0生態型(Col-O)背景中產生的轉基因擬南芥中各關聯代謝物情況也不同。Col-O生態型是天然hpl突變型，它表達基因轉錄物但因10個鹼基對缺失而編碼功能失調的酶，並因此缺乏C6-醛(Duan，H.等，Plant Physiol. 139 :1529-1544, 2005)。
研究了多種背景中大米HPL3過量表達產生醛的作用(Chehab，Ε. W.等，PLoS ONE 3(4) :el904，2008)。已顯示，乙酸己烯酯是通過引導三級營養(植物-食草動物-天敵) 相互作用調節間接防禦響應的主要損傷誘導型揮發信號。
然而，現有技術尚未很好地理解這些代謝途徑，特別是氫過氧化物裂合酶在除損傷和昆蟲破壞應答以外的植物脅迫響應中的作用。本發明解決這一問題以及其它問題。
發明概述
本發明涉及耐非生物脅迫植物的開發。如本發明不同實施方式所述，提供了製備提高非生物脅迫耐受性和/或其它優勢特徵一例如，生物量增加、種子產率提高、籽粒更重、籽粒灌漿期更長和/或莖幹更強健的植物。根據一個示範性實施方式，本發明涉及轉基因植物的製備，所述轉基因植物表達氫過氧化物裂合酶序列，優選為異源氫過氧化物裂合酶序列。
本發明所述方法包括將含有編碼HPL酶的氫過氧化物裂合酶(HPL)多核苷酸的重組表達盒引入植物群；並選擇耐非生物脅迫的植物，其中所述HPL酶包括(L/I)-(F/ C) -G- (Y/F)根據本發明示範性實施方式的一個方面，所述HPL酶在所述植物群中表達時定位於質體外。在本發明的一些實施方式中，所述HPL酶識別9-氫過氧-十八碳三烯酸 (9-HP0T)或9-氫過氧-十八碳二烯酸(9-HP0D)。在本發明的一些實施方式中，所述HPL 酶識別13-氫過氧-十八碳三烯酸(13-HP0T)或13-氫過氧-十八碳二烯酸(13-HP0D)。
在本發明的一些實施方式中，所述HPL酶在所述植物群中表達時定位於質體外， 其中所述HPL酶識別9-氫過氧-十八碳三烯酸(9-HP0T)或9-氫過氧-十八碳二烯酸 (9-HP0D)。在本發明的一些實施方式中，所述HPL酶還識別13-氫過氧-十八碳三烯酸 (13-HP0T)或13-氫過氧-十八碳二烯酸(13-HP0D)。
根據本發明的一個示範性實施方式，製備耐非生物脅迫植物的方法包括將含有編碼HPL酶的氫過氧化物裂合酶(HPL)多核苷酸的重組表達盒引入植物群，其中所述HPL酶的胺基酸序列與SEQ ID NO. 2、4或6至少90%相同，並且選擇耐非生物脅迫的植物，其中所述HPL酶在植物群中表達時定位於質體外，其中所述HPL酶識別9-氫過氧-十八碳三烯酸(9-HP0T)或9-氫過氧-十八碳二烯酸(9-HP0D)，還識別13-氫過氧-十八碳三烯酸 (13-HP0T)或13-氫過氧-十八碳二烯酸(13-HP0D)。
在本發明的一些實施方式中，所述非生物脅迫是乾旱。在本發明的一些實施方式中，所述非生物性脅迫是鹽度。
在本發明的一些實施方式中，所述HPL多核苷酸與啟動子操作性連接。所選啟動子可以是組成型啟動子、或誘導型啟動子或組織優選的啟動子。
在本發明的一些實施方式中，所述HPL酶的胺基酸序列與SEQ ID NO. 2、4或6至少90%相同。在本發明的一些實施方式中，所述HPL酶的胺基酸序列與SEQ ID NO. 2、4或 6至少91%、92%、93%、94%或95%相同。在本發明的一些實施方式中，所述HPL酶的胺基酸序列與SEQ ID NO. 2、4或6至少96%、97%、98%或99%相同。在本發明的一些實施方式中，所述HPL酶與SEQ ID NO. 2、4或6的胺基酸序列相同性可低於90%，只要所述HPL 酶包括(L/I)所述HPL多核苷酸可引入任何能轉化重組表達構建物的植物中。本文優選在水稻 (Oryza sativa)中表達。根據本發明的各種示範性實施方式，可使用實用性相當的其它雙子葉或單子葉植物。
本發明還涉及耐非生物脅迫的轉基因植物。本發明所述轉基因植物具有提高的非生物脅迫耐受性和/或其它優勢特徵，例如，生物量增加、種子產率提高、籽粒更重、籽粒灌漿期更長和/或莖幹更強健。本發明涉及表達氫過氧化物裂合酶的轉基因植物。
本發明所述轉基因植物包含重組表達盒，其中含有編碼HPL酶或其任何活性片段的HPL多核苷酸，其胺基酸序列或者與SEQ ID N0. 2、4或6相同，或與SEQ ID N0. 2、4或6 的相同性足以獲得與SEQ ID N0. 2、4或6相似的功能性，其中所述轉基因植物不是擬南芥。 這些轉基因植物的一種實施例是水稻(Oryza sativa)。
本發明還涉及來自本發明所述轉基因植物的轉基因種子。這些轉基因種子的一種實施例是來自本發明所述轉基因植物的轉基因水稻種子。
附圖簡要說明

圖1 :HPL1和HPL2品系暴露於200mM鹽的存活測試。數據表示為平均值士標準差。
圖2 =HPL品系暴露於乾燥的存活測試。過量表達HPLl至3的品系分別定名為 OsHPLl 0E、0sHPL2 OE和0sHPL3 OE ；過量表達HP-3減去酶氨基末端質體轉運肽前15個胺基酸的品系定名為0sHPL3-TP 0E。數據表示為平均值士標準差。
發明詳述
I.定義
術語「HPL多核苷酸」是指源自氫過氧化物裂合酶多肽編碼基因及編碼保留了氫過氧化物裂合酶酶活性的多肽的多核苷酸。HPL編碼氫過氧化物裂合酶。從大米中分離出多個HPL基因，包括HPL1、HPL2和HPL3。本文所用術語涵蓋的多核苷酸包括天然氫過氧化物裂合酶序列及其修飾和片段。本文所用術語HPL多核苷酸涵蓋的多核苷酸分別包括天然氫過氧化物裂合酶序列及編碼活性HPL多肽的修飾和片段。
術語「ΗΡ0Τ」指氫過氧-十八碳三烯酸。術語「HP0D」指氫過氧-十八碳二烯酸。 術語「9-HP0T」指9-氫過氧-十八碳三烯酸。術語「9-HP0D」指9-氫過氧-十八碳二烯酸。 術語「 13-HP0T」指13-氫過氧-十八碳三烯酸。術語「 13-HP0D」指13-氫過氧-十八碳二烯酸。
術語「多肽」指胺基酸聚合物，可包括全長蛋白質、多肽及其片段。本發明中，「HPL 多肽」指具有至少一種HPL功能的多肽。[0032]因此，本發明的術語「HPL多核苷酸」和「HPL多肽」可包括多核苷酸或多肽序列的變化，只要所述變化產生的分子顯示HPL活性。因此，所述多核苷酸或多肽可以與參比序列 (例如，SEQ ID NO 1-6)基本相同。所述序列相同性可低於90%，只要所述HPL酶包括(L/ I)涉及本發明核酸或多核苷酸的術語「異源」指來自外來物種或來自相同物種經某些方式改變(例如，突變、添加多拷貝、與非天然啟動子或增強子序列連接等)的核酸或多核苷酸。
術語「質體」指植物內的細胞器，包括但不限於葉綠體和色質體。
術語「後代」通常指雜交的子代，包括直接Fl代以及此後的F2、F3等代。
術語「漸滲」通常指來自一個物種的基因通過遺傳雜交進入另一物種的基因庫。這通常通過種間雜交株與其親本之一的重複回交實現。
如本文所用，術語「非生物脅迫」或「非生物脅迫條件」指植物、植物細胞等暴露於對植物代謝、生長、發育、增殖和/或生存(總稱「生長」)有副作用的非生存性(「非生物」)物理或化學試劑或條件。例如，可由於環境因素如水分過量或不足(例如水淹、乾旱、 脫水)、厭氧條件(例如氧水平低)、異常滲透條件、鹽度或溫度(例如，高溫/熱度、冷、凍、 霜)、缺乏營養或暴露於汙染物，或通過激素、第二信使或其它分子向植物施加非生物脅迫。 例如，厭氧脅迫是由於足以產生脅迫響應的氧水平減少(低氧或缺氧)。淹水脅迫可因為植物、植物部分、組織或分離細胞長時或瞬時浸沒在液體培養基中，例如發生在雨季、潮溼季節、突發洪水或植物過量灌溉等。冷脅迫或熱脅迫可分別因為溫度從特定植物物種的最優生長溫度範圍降低或升高而發生。本領域技術人員可以容易地測定或已知這種最優生長溫度範圍。脫水脅迫可通過細胞、組織、器官或整株植物的水分損失、膨壓降低或水含量減少而引起。乾旱脅迫可通過細胞、組織、器官或生物體的水分剝奪或水分供給減少引起或與其相關。鹽水脅迫(鹽脅迫)可與細胞胞內或胞外環境滲透勢的擾動相關或由其引起。例如， 滲透脅迫也可與植物細胞胞內或胞外環境的分子濃度變化相關或由其引起，特別是當所述分子不能跨植物細胞膜分隔時。
植物對非生物脅迫的響應包括生成過量活性氧物質(R0Q，包括單線態氧、超氧化物、過氧化氫和羥基自由基，它們作為信號轉導分子並在防禦機制啟動中起作用。ROS在植物中參與多種環境脅迫。過度的極端溫度、水脅迫，由鹽度、空氣汙染和機械傷害(例如昆蟲吮吸或咀嚼引起的損傷或風造成的破損等)引起的離子失衡導致通過ROS傳播化學信號。對脅迫的適應將涉及通過一種或多種抗氧化酶或化合物如超氧化物歧化酶(SOD)、穀胱甘肽、抗壞血酸、類胡蘿蔔素等消隱ROS信號。當環境脅迫超過植物的消隱系統時，可通過ROS發生過度且快速的變性反應，例如蛋白質變性和脂質過氧化。當部分的耐受性改善機理包括改進氧化性或ROS脅迫的消減時，所述對一種特定非生物脅迫如乾旱的耐受性改善可賦予對另一脅迫如高亮度或熱耐受性的相似改善。
當充分高的溫度保持充分長時間足以導致植物功能、發育和/或產率發生不可逆損傷時，植物承受熱脅迫。熱脅迫可對生殖發育有不利影響並降低產率(異常生物量和/ 或果實與種子)。當承受極端熱脅迫時，植物可能無法存活。
本發明提供比相應參比植物更耐受脅迫條件的遺傳修飾植物，其可以是轉基因植物。如本文所用，用於植物的脅迫條件的術語「耐受」指所述特定植物在暴露於脅迫條件時，其響應所述條件的效果比相應參比植物(天然產生的野生型植物或不含本發明構建物的植物)輕或沒有影響。因此，本發明涵蓋的植物顯示由於非生物脅迫耐受性提高而改善農藝學性能和在更大變化條件下生長更好，例如生物量提高和/或產率更高和/或產生更多種子。優選地，在相應參比植物顯示生長、產率、代謝或活力降低，或雄性或雌性不育率提高的環境條件下，所述轉基因植物能基本正常生長。
如本文所用，術語「耐乾旱」指植物在缺水脅迫條件下更理想的生產能力。當水的蒸散需求超出水供給時，產生缺水脅迫。缺水脅迫程度可重可輕(例如數天或數周很少或沒有可用水)，但與乾旱敏感型植物相比，耐乾旱植物將顯示更好的生長和/或脅迫恢復。
如本文所用，術語「用水效率」指植物每單位用水的更理想生產能力。所用水可以是降水或灌溉的結果。
如本文所用，術語「耐鹽」指植物在鹽度脅迫條件下更理想的生產能力。對每個物種，土壤和/或水鹽度(常表示為導電性或E. C.)的臨界值不同，耐鹽植物在產率降低前具有更高的鹽度臨界值。耐鹽也指產率對超出臨界值的水和/或土壤鹽度的敏感度。因此， 耐鹽植物中每單位鹽度(E.C.)對產率的影響低於鹽敏感植物。耐鹽指臨界值提高和/或超出臨界值時產率對鹽度靈敏度降低。
術語「植物」包括完整植株、枝條營養器官/結構(例如葉、莖幹和塊莖)、根、花和花器官/結構(例如，苞、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花粉囊和胚珠)、種子(包括胚芽、胚乳和種皮)和果實(成熟子房)、植物組織(例如，維管組織、基本組織等)和細胞(例如，保衛細胞、卵細胞、毛狀體等)及其後代。本發明所述方法可用的植物種類通常寬泛到可使用轉化技術的高等和低等植物，包括被子植物(單子葉和雙子葉植物)、裸子植物、蕨類和多細胞藻類。其包括各倍體水平的植物，包括非整倍體、多倍體、二倍體、單倍體和半合子。
如本文所用，「轉基因植物」包括其基因組內含有異源多核苷酸的植物。通常，所述異源多核苷酸穩定摻入基因組使所述多核苷酸傳遞至後續世代。所述異源多核苷酸可以單獨或作為重組表達盒的部分摻入基因組。本文所用「轉基因」包括因存在異源核酸而改變基因型的任何細胞、細胞系、胼胝體、組織、植物部分或植物，包括初始如此改變的轉基因體以及從初始轉基因體通過有性雜交或無性繁殖所產生的。如本文所用，術語「轉基因」不包括通過常規植物育種方法或通過天然發生事件如隨機雜交受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉化、非重組轉座或自發突變產生的基因組(染色體或染色體外)改變。
術語「表達盒」指用於在任何細胞內的組成型或誘導型地體外或體內表達本發明所述核酸序列的任何重組表達系統，所述細胞除植物細胞以外還包括原核、酵母、真菌、昆蟲或哺乳動物細胞。所述術語包括線性和環狀表達系統。所述術語包括所有載體。所述盒可保持游離或摻入宿主細胞基因組。所述表達盒可具有自主複製的能力或不具有該能力(即，在細胞中僅驅動瞬時表達)。所述術語包括僅含所述重組核酸轉錄所需最少元件的重組表達盒。
術語「組成型」或「組成型地」指本發明所述多肽在根據本發明各示範性實施方式所述方法的植物中的時間和空間表達。術語「組成型」或「組成型地」指本發明所述多肽在植物組織中的表達延續所述植物整個生命，特別是在其完整生長周期中。在一些實施方式中，本發明所述多肽在所有植物組織中組成型表達。在一些實施方式中，本發明所述多肽在根、葉、莖、花和/或果實中組成型表達。在本發明的其它實施方式中，本發明所述多肽在根、葉和/或莖中組成型表達。
術語「誘導型」或「誘導型地」指在沒有誘導劑時，本發明所述多肽不表達或以極低水平表達。本發明所述多肽的表達響應誘導劑而被強烈誘導。
術語「誘導劑」用於指影響誘導型調控元件轉錄的化學、生物或物理試劑或環境條件。在對誘導劑的響應中，誘導型調控元件的轉錄通常從頭啟動在基底或組成型表達水平上提高。可採用本文公開的方法鑑定這種誘導，包括檢測所述調控元件操作性連接的核苷酸序列的RNA轉錄水平的提高、所述核苷酸序列編碼多肽表達的提高、或所述編碼多肽表達所賦予的表型。
術語「同源物」用於指在結構和進化起源上與另一物種的一個基因相似的基因。在 HPL基因的情況中，同源物編碼的蛋白質屬於細胞色素P450家族並含有名為I-、K-螺旋和血紅素結合域的典型特徵結構域，其催化切割9/13-氫過氧化物產生相應的代謝物，包括但不限於，9-氫過氧-十八碳三烯酸/氫過氧-十八碳二烯酸的C9醛與酮酸，以及13-氫過氧-十八碳三烯酸/氫過氧-十八碳二烯酸的C8醛、己烯醛和己醛。系統發生分析的描述參見 Chehab 等(JJntegrative Plant Biol. 49(1) :43-51，2007)，對來自多個物種 HPL 同源物的序列比對顯示HPL共有序列(L/I)本發明的短語「基本相同」指多核苷酸或多肽與參比序列(例如，SEQ ID NO 1-6 中之一)的序列相同性足以使之在植物中表達時實現與參比序列相似的功能性。根據本發明所述示範性實施方式的一個方面，顯示與參比序列(例如，SEQ ID N0:l-6中之一) 至少90%序列相同性的多核苷酸或多肽可認為是「基本相同」；但是，根據本發明的多個示範性實施方式，只要實現必需的功能性，顯示序列相同性低於90% (甚至顯著更低，如 60%-70%或更低)的多核苷酸或多肽可以與其參比序列「基本相同」。或者，百分比相似性可以是90% -100%之間的任意值。更優選的實施方式至少包括本文所用序列與參比序列用本文所述程序相比有90%、95%或99%相同；優選採用標準參數的BLAST，如下文所述。多核苷酸和多肽的序列相同性可低於90%，只要所述HPL酶包括(L/I)-(F/C)-G-(Y/ F)對於序列比較，一般將一種序列用作與測試序列相比的參比序列。使用序列比較算法時，測試和參比序列均輸入計算機，必要時指定子序列坐標，指定序列算法程序參數。 可使用默認的程序參數，或者可指定另外的參數。然後，該序列比較算法根據程序參數計算出測試序列相對於參比序列的序列相同性百分數。
本文所用的「比較窗」包括參考任意數量的連續位置的區段，例如20-600，通常約50-200，更常是約100-150，對兩個序列進行最優比對後，可將該序列與相同數量連續位置的參比序列作比較。若未提供範圍，所述比較窗為參比序列的全長。比對序列的比較方法是本領域熟知的。可進行最優序列比對以作比較[例如，通過Smith和Waterman的局部同源性算法，Adv. Appl. Math. 2 :482(1981)；通過Needleman和Wunsch的同源性比對算法， J. Mol. Biol. 48 :443 (1970)；通過 Pearson 和 Lipman 的相似性搜索法，Proc. Nat，1. Acad. Sci. USA 85 :2444(1988)；通過計算機執行這些算法(遺傳學計算組(Genetics Computer Group)的威斯康星遺傳學軟體包(Wisconsin Genetics Software Package)中的 GAP、 BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，威斯康星州麥迪遜(Madison, WI)科學大道(Science Dr.) 575 號)，或通過手工比對和目測]。
適合測定序列相同性和序列相似性百分數的算法的例子是BLAST算法，參見 Altschul, S. F.等，J Mol Biol 215:403-410(1990)。進行 BLAST 分析的軟體可通過國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)從公開渠道獲得。此算法包括首先通過鑑定查詢序列中長度為W的短字來鑑定高評分序列對(HSP)，與資料庫序列中長度相同的字比對時它們能匹配或滿足一些正值的閾值評分T。T稱為相鄰字評分閾值(Altschul，S.F.等，同上)。這些初始相鄰字命中用作啟動搜索的種子，以便找到含有它們的較長HSP。該字命中在沿各序列的兩個方向上延伸，只要可提高累積比對評分。出現以下情況時中止字命中在各個方向上的延伸累積比對評分比最大獲得值降低X ； 由於一個或多個負評分殘基比對的累積，累積評分變為零或零以下；或者達到各序列的末端。BLAST算法參數W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLAST程序使用的默認值為字長(W)為 11、BL0SUM62 評分矩陣(參見 Henikoff 和 Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915(1989))、比對(B)為50、期望值(E)為10、M = 5、N = -4以及比較兩條鏈。
BLAST算法也對兩種序列進行相似性的統計學分析(參見例如，Karlin和 Altschul,Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 90 :5873-5787 (1993))。BLAST 算法提供的一種相似性測量是最小概率和(P(N))，它表明兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶爾發生匹配的概率。 例如，如果測試核酸與參比核酸的比較中最小概率和小於約0. 2，優選小於約0. 01，更優選小於約0. 001，則認為該核酸類似於參比序列。
II.核酸
根據本發明示範性實施方式的一個方面，多核苷酸可包括(a)編碼SEQ ID NO :2、 SEQ ID NO :4 或 SEQ ID NO :6 多肽的多核苷酸，包括 SEQ ID NO =USEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :5的示範性多核苷酸；(b)與(a)的多核苷酸有特定序列相同性的多核苷酸；(c) SEQ ID N0:l、3和5的同源物；(d) (a)、(b)或(c)多核苷酸的互補序列；以及(e)任何(a)、(b)、 (c)或(d)的活性片段。
本發明提供分離的RNA、DNA核酸及其類似物和/或嵌合體等，包括本發明所述多核苷酸。
A.編碼本發明所述多肽的多核苷酸
本發明提供包含本發明所述多核苷酸的分離核酸，其中所述多核苷酸編碼本發明所述多肽或其活性片段。依據遺傳編碼，本文所述編碼多肽的各核酸序列也描述該核酸的每種可能的沉默變異。本領域普通技術人員認識到，可修飾核酸中的各個密碼子(除了 AUG 和UGG，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，UGG通常是色氨酸的唯一密碼子)，以產生功能相同的分子。因此，編碼本發明所述多肽的核酸的各沉默變異均隱含在各所述多肽序列中， 並在本發明的範圍內。因此，本發明包括本發明的多核苷酸和編碼本發明所述多肽的多核苷酸。
B. ~ (A)白姊浦_雜辦歹丨丨騰_雜_
根據不同的示範性實施方式，本發明提供含上文所述HPL多核苷酸的分離HPL核酸，其中所述HPL多核苷酸與上文(A)部分所公開多核苷酸在核苷酸水平上具有特定的相同性。例如，可採用BLAST算法在默認條件下計算相同性百分數。
C.作為同源物的多核苷酸
本發明提供的分離HPL核酸包含作為SEQ ID NO :1、3和5同源物的HPL核苷酸。 Chehab 等描述了一些 HPL 同源物(JJntegrative Plant Biol. 49(1) :43_51，2007)，可採用本領域已知方法鑑定其它同源物，並且由於其它基因組序列可得到，能鑑定來自其它物種的補充HPL同源物。
本發明提供的分離核酸包括與上文A-B部分的多核苷酸互補的多核苷酸。本領域技術人員應當理解，互補序列在其全長內與(A)-(C)部分的多核苷酸鹼基配對(即序列在其全長內100%互補)。在雙鏈核酸中互補鹼基通過氫鍵連接。例如，下列鹼基對是互補的 鳥嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；以及腺嘌呤和尿嘧啶。此外，本領域技術人員應當理解，在全部重疊區鹼基配對(即在重疊區100%互補，但在其全長內不是100%互補)的序列可以是互補的。另外，儘管互補度較低(例如60%-70%或更低)，不是100%互補的序列仍可作為反義構建物，並因此能實現本發明此方面所述功能。
III.核酸的構建
可採用標準重組方法、合成技術及其組合或任何現在已知或此後開發用於製備此類核酸的其它方法製備本發明所述分離的核酸。
A.用於構建核酸的重組方法
可採用本領域技術人員現在已知或此後設計的任意數量克隆方法從植物生物來源(例如植物的組織)獲得本發明的分離核酸組合物。在一些實施方式中，採用在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸選擇性雜交的寡核苷酸探針鑑定cDNA或基因組DNA文庫中的所需序列。本領域普通技術人員熟知RNA的分離和cDNA以及基因組文庫的構建。參見例如，Plant Molecular Biology :A Laboratory Manual (植物分子生物學實驗手冊)，Clark 編著，Springer-Verlag,柏林，1997 ；禾口 Current Protocols in Molecular Biology (新編分子生物學實驗指南)，Ausubel等編著，格林出版公司(Greene Publishing)和 ffiley-Interscience, M.^, 1995。
Al.基因組 DNA
可直接從水稻分離的基因組DNA中獲得本發明所述分離的核酸組合物(Chehab 等，Plant Phys. 141 :121-134,2006)。
A2. cDNA 文庫
已描述了提供富集全長cDNA文庫的多種cDNA合成方案。構建富集的全長cDNA文庫以包含所有含插入片段克隆中的至少60 %，更優選至少70 %、80 %、90 %或95 %全長插入片段。這些文庫中插入片段的長度可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10千鹼基(kb)對或更長。容納這些尺寸插入片段的載體是本領域已知並有市售。參見例如，Stratagene公司的 λ ZAP表達系統(lambda ZAP Express,克隆容量為0_12kb的cDNA克隆載體)。Carninci 等描述了構建大於95%純全長cDNA文庫的示範性方法，Genomics 37 :327_336，1996。本領域已知生成全長文庫的其它方法。參見例如，Edery等，Mol. Cell Biol. 15(6) :3363-3371, 1995 ；和 PCT 專利申請 W0/1996/034981。
非均一化或消減cDNA文庫還可根據標準方法用於構建本發明所述核酸。
可採用基於本發明所述HPL多核苷酸序列如本文所公開序列的探針篩選cDNA或基因組文庫。探針可用於與基因組DNA或cDNA序列雜交以分離相同或不同植物物種內的同源基因。本領域技術人員應當理解，試驗中可採用不同的雜交嚴謹程度；且雜交或清洗介質可以嚴格。
還可採用擴增技術從核酸樣品中擴增感興趣的核酸。例如，可使用聚合酶鏈反應 (PCR)技術直接從基因組DNA或cDNA文庫擴增本發明所述多核苷酸序列和相關基因。PCR 和其它體外擴增方法也可用於，例如，克隆編碼待表達蛋白質的核酸序列，製備核酸用作檢測樣品中是否存在所需mRNA、核酸測序或其它目的的探針。可用T4基因32蛋白(勃林格殷格翰公司(Boehringer Mannheim))改善長PCR產物的得率。
已描述基於PCR的篩選方法。Wilfinger等描述了基於PCR的方法，其中在第一步中鑑定最長的cDNA從而可以去除研究中的不完全克隆(Bio Techniques 22(3) :481-486, 1997)。這些方法與上述全長cDNA構建方法聯合時尤其有效。
B.用於構建核酸的合成方法
本發明所述分離的核酸還可通過直接化學合成製備，例如用Narang等的磷酸三酯法，Meth. Enzymol. 68 :90-99,1979 ；Brown 等的磷酸二酯法，Meth. Enzymol. 68 109-151， 1979 ；Beaucage 等的二乙基亞磷醯胺法，Tetra. Letts. 22 1859-1862，1981 ；Beaucage 和 Caruthers描述的固相亞磷醯胺三酯法，Tetra. Letts. 22(20) 1859-1862，1981 ；例如使用自動合成儀，如 Needham-VanDevanter 等所述，Nucleic Acids Res. 12 :6159-6168,1984 ； 以及美國專利第4，458，066號所述固相載體法。化學合成通常產生單鏈寡核苷酸。這可通過與互補序列雜交或用單鏈作為模板由DNA聚合酶進行聚合化而轉化成雙鏈DNA。技術人員應當理解，儘管DNA的化學合成最好用於約100個鹼基或更短的序列，但可通過連接較短序列獲得更長的序列。
IV.重組表達盒
根據示範性實施方式的另一方面，本發明提供包含本發明所述核酸的重組表達盒。編碼本發明所需多核苷酸的核酸序列，例如編碼本發明所述全長多肽的cDNA或基因組序列，可用於構建能引入所需宿主細胞的重組表達盒。重組表達盒通常包含與轉錄起始調控序列操作性連接的本發明所述多核苷酸，該調控序列指導所述多核苷酸在意向宿主細胞如轉化植物組織內的轉錄。
例如，植物表達載體可包括(1)在5'和3'調控序列的轉錄控制下的克隆植物基因和( 顯性選擇標記。需要時，這些植物表達載體還可包含啟動子調控區(例如，賦予誘導型或組成型、環境或發育調節、或細胞或組織特異性/選擇性表達)、轉錄起始位點、核糖體結合位點、RNA加工信號、轉錄終止位點和/或聚腺苷酸信號。
A.載體[0085]本領域熟知可用於在高等植物中基因表達的典型載體。已描述了適合穩定轉化植物細胞或建立轉基因植物的多種表達載體，包括W^eissbach和flfeissbach，Methods for Plant Molecular Biology (植物分子生物學方法)，學術出版社(Academic Press), 1989，和 Gelvin 等，Plant Molecular Biology Manual (植物分子生物學手冊)，克魯學術出版社(Kluwer Academic Publishers)，1990所述載體。具體示例包括來自根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的腫瘤誘導(Ti)質粒或根誘導(Ri)質粒，以及 Herrera-Estrella, L.等(Nature 303 :209，1983)，Bevan, M. (Nuc1. Acids Res. 12 8711-8721,1984)和 Klee，H.J. (Bio/Technology 3 :637-642,1985)中公開的用於雙子葉植物的載體。可採用農桿菌介導轉化將Ti衍生質粒轉移至單子葉和雙子葉物種內(Ishida 等，Nat. Biotechnol. 14 :745-50,1996 ；Barton 等，Cell 32 1033-1043，1983)。本文所用示範性根瘤土壤桿菌質粒是 Schardl 等(Gene 61 :1-11,1987)和 Berger 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :8402_6，1989)的pKYL)(6和pKYLX7質粒。本文另一個有用的質粒是來自加利福尼亞州帕洛阿爾託的克隆技術實驗室公司(CL0NTECH Laboratories, Inc.，Palo Alto, Calif.)的 pBIlOl. 2。
或者，可使用非Ti載體採用游離DNA遞送技術將DNA轉移至植物和細胞內。例如，這些方法可包括使用脂質體、電穿孔、微粒轟擊、碳化矽晶須和病毒。未成熟胚胎也可以是採用顆粒槍進行直接DNA遞送技術(Weeks，Τ.等，Plant Physiol. 102 :1077-1084, 1993 ；Vasil, V. ，Bio/Technology 10 :667-674,1993 ；Wan，Y.禾口 Lemeaux，P. ，Plant Physiol. 104 :3748,1994)和用於農桿菌介導 DNA 轉移(Ishida 等，Nature Biotech. 14 745750,1996)的良好靶組織。
B.啟動子
B 1.組成型啟動子
多種啟動子可用於實施本發明。可使用在再生植物所有組織中指導本發明所述多核苷酸表達的植物啟動子片段。這些啟動子在本文中稱為「組成型」啟動子，並在大多數環境條件和發育狀態或細胞分化中是活性的。組成型啟動子的示例包括椰菜花葉病毒 (CaMV) 35S轉錄起始區。
B2.誘導型啟動子
或者，所述植物啟動子可以在環境控制下指導本發明所述多核苷酸的表達。這些啟動子在本文中稱為「誘導型」啟動子。可通過誘導型啟動子影響轉錄的環境條件包括生物脅迫、非生物脅迫、鹽脅迫、乾旱脅迫、病原體侵襲、厭氧條件、冷脅迫、熱脅迫、低氧脅迫或光的存在。
誘導型啟動子的示例包括但不限於，鹽誘導型啟動子rd29A(KaSuga，M.等， Nature Biotechnol. 17，287-291，1999)，玉米的乾旱誘導型啟動子(Busk 等，Plant J. 11 :1285-1295,1997)；馬鈴薯的冷、乾旱和高鹽誘導型啟動子(Kirch, Plant Mol. Biol. 33 :897-909,1997)，光誘導型啟動子PPDK，來自酮糖_1，5_ 二磷酸氫羧化酶小亞基(ssRUBISCO)的光誘導型啟動子，低氧或冷脅迫誘導型啟動子Adhl，熱脅迫誘導型啟動子Hsp70啟動子，和本領域已知的很多冷誘導型啟動子，例如擬南芥(Arabidopsis thaliana)的 rd29a 和 corl5a 啟動子(GenBank ID :D13044 和 U01377)、大麥的 bltlOl 和 blt4. 8 (GenBank ID :AJ310994 和 U63993)、小麥的 wcsl20 (GenBank ID :AF031235)和玉米的 mlipl5 (GenBank ID 細563)。
已描述的其它誘導型啟動子包括ABA-和膨壓誘導型啟動子、植物生長素結合蛋白基因的啟動子Gchwob等，Plant J. 4(3) :423_432，1993)、UDP葡萄糖類黃酮糖基轉移酶基因啟動子(Ralston等，Genetics 119 :185_197，1988)、MPI蛋白酶抑制劑啟動子 (Cordero等，Plant J. 6 (2) 141-150，1994)和甘油醛_3_磷酸脫氫酶基因啟動子(Kohler 等，Plant Mol. Biol. 29(6) :1293-1298,1995 ；Quigley 等，J. Mol. Evol. 29(5) :412-421, 1989 ；Martinez 等，J. Mol. Biol. 208 (4) :551-565,1989)。
B3.組織優詵啟動子
發育控制的啟動子示例包括僅僅或優選在某些組織，例如葉、根、果實、種子或花中啟動轉錄的啟動子。有時稱這些啟動子為組織優選啟動子。示範性啟動子包括花粉囊特異性啟動子5126 (美國專利第5，689，049和5，689，051號)、glob-Ι啟動子和Y _玉米醇溶蛋白基因啟動子。MS8-15(PCT公開號WO 98/00533)是用於葉和杆優選表達的示範性啟動子。種子優選啟動子的示例包括但不限於，27kD γ-玉米醇溶蛋白基因啟動子和蠟質基因啟動子(Boronat, A.等，Plant Sci. 47 :95-102,1986 ；Reina, M.等，Nucleic Acids Res. 18 (21) :6426,1990 ；和 Kloesgen, R. B.等，Mol. Gen. Genet. 203 :237-244,1986)。PCT 公開號WO 00/11177和WO 00/12733中公開了在胚胎、果皮和胚乳中表達的啟動子，它們均通過引用納入本文。啟動子的操作也可根據其在基因組中的位置而不同。因此，發育調控的啟動子可以在某些位置是完全或部分組成型的。需要時，也可修飾發育調控啟動子用於弱表達。
異源和非異源(S卩，內源)啟動子都可用於指導本發明所述核酸的表達。這些啟動子還可用於如重組表達盒以驅動反義核酸的表達從而降低、提高或改變本發明所述蛋白質在所需組織中的濃度和/或組成。因此，在一些實施方式中，所述核酸構建物將含有操作性連接本發明所述多核苷酸的在植物細胞例如玉米(Zea mays)中有功能的啟動子。這些實施方式所用的啟動子包括驅動本發明所述多肽表達的內源啟動子。
在一些實施方式中，作為啟動子或增強子元件的分離核酸可引入本發明所述多核苷酸非異源形式的合適位置(通常在上遊)從而上調或下調本發明所述多核苷酸的表達。例如，可在體內通過突變、缺失和/或取代來改變內源啟動子(參見Kmiec，美國專利第 5，565，350號和Zarling等，美國專利第5，763，240號)，或者分離的啟動子可以從本發明所述基因的適當方向和適當距離引入植物細胞內從而控制所述基因的表達。可在適合植物生長的條件下調節基因表達，從而改變植物細胞內本發明所述多肽的總濃度和/或改變其組成。因此，本發明提供了用於製備與本發明所述多核苷酸的天然、內源(即，非異源)形式操作性連接的異源啟動子和/或增強子的組合物及方法。
根據其它示範性實施方式，本發明所述表達盒還可包括增強子元件、聚腺苷酸區段、內含子增強元件、選擇性標記和/或終止子元件。
本發明所述表達盒可用於賦予幾乎任何植物非生物脅迫耐受性。具體地，本發明可用於單子葉如穀物植物，例如燕麥屬(Avena)、大麥屬(Hordeum)、水稻屬(Oryza)、黑麥屬Gecale)、高粱屬(Sorghum)、小麥屬(Triticum)和玉蜀黍屬(Zea)。本發明還對廣範圍的植物有用，包括以下屬的物種天門冬(Asparagus)、顛茄(Atropa)、芸苔(Brassica)、柑橘(Citrus)、西瓜(Citrullus)、辣椒(Capsicum)、黃瓜(Cucumis)、南瓜(Cucurbita)、胡蘿蔔(Daucus)、草莓(Fragaria)、大豆(Glycine)、棉(Gossypium)、向曰葵(Helianthus)、萱草(Heterocallis)、直菪(Hyoscyamus)、萵苣(Lactuca)、亞麻(Linum)、黑麥(Lolium)、番 ^p (Lycopersicon)、蘋果(Malus)、木薯(Manihot)、馬有P蘭(Majorana)、苜猜(Medicago)、 菸草(Nicotiana)Jg (Panieum)、狼尾草(Pannesetum)、鱷梨(Persea)、豌豆(Pisum)、梨 (Pyrus)、李(Prunus)、蘿蔔(Raphanus)、千裡光(Senecio)、白芥(Sinapis)、爺(Solanum)、 胡盧巴(Trigonella)、葡萄(Vitis)和豇豆(Vigna)。在本發明的一些實施方式中，本發明所述表達盒用於賦予耐乾旱性。在本發明的一些實施方式中，本發明所述表達盒用於賦予耐鹽性。
V.植物轉化
一旦構建出含本發明所述多核苷酸的表達盒，可使用任何已知技術或本領域技術人員此後設計的技術將所述多核苷酸引入植物。例如，參見Ammirato等Handbook of Plant Cell Culture—Crop Species (植物細胞培養手冊一作物品種)，麥克米蘭出版公司(Macmillan Publ. Co.) 1984 ；Shimamoto φ, Nature 338 :274-276,1989 ；Fromm 等，Bio/ Technology 8 :833-839,1990 ；禾口 Vasil 等，Bio/Technology 8 :429-434,1990 中所描述的方案。
植物的轉化和再生是本領域公知的，本領域技術人員能確定本發明具體實施方式
中最適轉化技術的選擇。合適的方法可包括但不限於植物原生質體電穿孔；脂質體介導的轉化；聚乙二醇(PEG)介導的轉化；使用病毒的轉化；植物細胞的微注射；植物細胞微粒轟擊；真空浸潤；和根瘤土壤桿菌介導的轉化。轉化意味著以引起所述序列穩定或瞬時表達的方式將核苷酸序列引入植物中。這些方法在不同植物中的示例包括美國專利第 5，571，706 ；5，677，175 ；5，510，471 ；5，750，386 ；5，597，945 ；5，589，615 ；5，750，871 ； 5，268，526 ；5，780，708 ；5，538，880 ；5，773，269 ；5，736，369 和 5，610，042 號。
轉化以後，優選採用摻入轉化載體的顯性選擇性標記選擇植物。通常，這種標記將賦予轉化植物抗生素或除草劑耐受性，可通過將所述植物暴露於適當濃度的所述抗生素或除草劑而實現轉化株的選擇。
所述經轉化的細胞可根據常規方式長成植物。參見例如，McCormick等，Plant Cell Reports 5 :81_84，1986。然後，這些植物可以生長，用相同轉化植株或不同植株授粉， 鑑定具有所需表型特徵的所得雜交株。可生長2代或2代以上以確保目標表型特徵穩定保持且被遺傳，隨後收集種子確保實現所需表型或其它特性。
VI.用遺傳雜交生成轉基因植物
本發明涉及產生耐非生物脅迫的植物的方法，通過將本發明所述核酸從供體植物轉移入不具非生物脅迫耐受性的受體植株中，從而賦予所述受體植株該非生物脅迫耐受性特質。
因此，實現這種轉移的一種方法是通過所述植物雜交將賦予或有助於這一特質的核酸序列從耐非生物脅迫的供體植物漸滲入不具非生物脅迫耐受性的受體植物內。因而， 可採用傳統育種技術適當實現這一轉移。
在一種方法中，顯示非生物脅迫耐受性並包含本發明所述核酸的供體植物與不具非生物脅迫耐受性並優選顯示如籽粒更重、籽粒灌漿期更長和莖幹更強健等商用理想性質的植物雜交。然後，使所得植物群體(代表Fl雜交株)自花授粉並獲得種子(F2種子)。然後，用本文所述任意方法篩選非生物脅迫耐受性的F2種子。
可採用輪迴選擇和回交、自體和/或雙單倍體或用於製備親本品系的任意其它方法產生近交的耐非生物脅迫植株系。在選擇和回交的方法中，非生物脅迫耐受性特質可漸滲入靶受體植物(稱為回歸親本)，通過將所述回歸親本與第一供體植物(不同於回歸親本，本文中稱為「非回歸親本」)雜交實現。所述回歸親本無非生物脅迫耐受性並具有商用理想性質的植物。
所述非回歸親本顯示非生物脅迫耐受性並包含本發明所述核酸，其中本發明所述多肽的表達強於不具非生物脅迫耐受性的植物。所述非回歸親本可以是與所述回歸親本雜交繁殖的任何植物品種或近交品系。回歸親本和非回歸親本之間雜交所得後代與回歸親本進行回交。然後，篩選所得植物群體。隨後，選出包含本發明所述必需核酸的Fl雜交植物， 自花授精並選擇多代以使得所述植物愈加近交。這一持續自花授精和選擇的過程可進行 2-5代或更多代。該育種和選擇的結果是產生與非生物脅迫耐受性相關基因以及與商用利益特質相關的其它基因具有遺傳同源性的品系。
可以根據多種熟知技術中的任意技術測試非生物脅迫耐受性。可通過用熟知的知方法比較經處理植物與對照(參比)植物來確定根據本發明所述方法修飾的提高了對引發脅迫條件耐受性的植物。例如，可通過使所述植物在含鹽水平超出相應參比植物能夠生長的介質所含鹽量約100%的介質如土壤中生長來鑑定鹽脅迫耐受性提高的植物。有利地， 根據本發明所述方法處理的植物可生長的介質或土壤的含鹽水平為相應參比植物能生長的介質或土壤的鹽水平的至少約110%，優選至少約150%，更優選至少約200%，最優至少約400%。具體地，該處理植物可在含鹽至少40mM，通常至少IOOmM,特定至少200mM，優選至少300mM的介質或土壤中生長，鹽包括例如，水溶性無機鹽如硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸鈣、氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣、氯化鉀等；農用肥料的鹽和與鹼性或酸性土壤條件相關的鹽；特別是 NaCl。
可通過包括膨壓、生長、得率等在內的多種標準測試中的任意測試確定耐乾旱性。 例如，可通過使所述植物在降水和/或灌溉供應的水量低於最適水量的條件下生長來鑑定乾旱耐受性增強的植物。具體地，可通過使所述植物在含水量低於相應參比植物可生長介質的介質如土壤上生長來鑑定乾旱耐受性增強的植物。有利地，根據本發明所述方法處理的植物可生長介質或土壤的含鹽水平低於相應參比植物能生長的介質或土壤含水量的 90%、優選低於約80%、更優選低於約50%、最優低於約20%。或者，可通過在一段乾旱期後提供再水化時植物從乾旱恢復的能力來鑑定耐乾旱性增強的植物。有利地，當在至少3 天、至少5天、優選至少7天、更優選至少約10天以及最優至少約18天乾旱後提供再水化時，根據本發明所述方法處理的植物可恢復。
可通過評估每單位植物可用水的植物幹生物量積累量(根據感興趣的得率組成， 生物量可以是營養性、生殖性或兩者都有)測定用水效率。用水效率增強的植物將比相同條件下生長的對應參比植物具有更高的每單位可用水的幹生物量積累量。葉子或植物水平的用水效率是指淨(X)2同化率和蒸騰率間的比值，常在數秒或數分鐘時間內檢測。在限制水條件下，用水效率改善植物的得率將比相同條件下生長的對應參比植物高(例如高出 1-5%,5-10%,10-15% )。
可通過評估相對溫度升高的植物幹生物量累積量(根據感興趣的得率組成，生物量可以是營養性、生殖性或兩者都有)測定熱耐受性。在升溫條件下(例如1°C、2°C、 3°C、4°C等)，熱耐受性改善植物的得率將比相同條件下生長的對應參比植物高(例如高出 1-5%,5-10%,10-15% )。
一旦作出適當選擇，則重複所述過程。重複與回歸親本回交並選擇非生物脅迫耐受性的過程約5代或更多代。該過程所得後代是一個或多個非生物脅迫耐受性編碼基因的雜合子。然後，將最後回交代自花授精以提供非生物脅迫耐受的純合子純育種後代。
本文所述非生物脅迫耐受性近交植物系可用於額外的雜交以產生進一步的非生物脅迫耐受性雜交植物。例如，本發明所述第一非生物脅迫耐受性近交植物可與具有其它商用理想特質的第二近交植物雜交。所述第二近交植物系也可顯示或不顯示非生物脅迫耐受性。
VII 實施例
實施例1 大米HPL的克降和序列分析
用分離自粳稻日本晴(L. cv Nipponbare)的基因組DNA，基於PCR擴增這些基因，採用以下基因特異性寡核苷酸OsHPLl (正向5 『 -ATAGATATCGCATGCATGGCGCCGCCGC GAGCCAACTCCG-3 『和反向5 『 -ATATACGTACTGCAGCGCGCGCCGCCGCTTGACACTATTA-3 『)、 0sHPL2 (正向5 『 -ATAGATATCGCATGCATGGCGCCACCGCCAGTGAACTCCG-3 『和反向5 『 ATAT ACGTACTGCAGGCACGTGACGTCGACGTGCGTGCTA-3 『)以及 0sHPL3 (正向5 『 -ATAGATATCGCAT GCATGGTGCCGTCGTTCCCGCAGCCGG-3 『和反向5 『 -ATATACGTACTGCAGGAGAGAATGGCGGCAGCA AAGCTTA-3')。對於各擴增，採用Gene Amp PCR系統9700 (應用生物系統公司(Applied Biosystems))，在含 IOmM Tris-HCl(pH 8.3)、50mM KClU. 5mM MgCl2、4 % 二甲基亞碸 (DMS0)、100y M各dNTP、500nM各正向和反向引物、0.625單位Taq DNA聚合酶(英傑公司anvitrogen))和50ng基因組DNA的25 μ L反應混合物中進行30輪PCR循環。進行擴增94°C持續1分鐘，94°C持續30秒，OsHPLl在55 °C、0sHPL2在63 °C以及0sHPL3在 55°C持續1分鐘，72°C持續90秒，最後在72°C進行10分鐘延伸步驟。通過(w/v)瓊脂糖凝膠電泳解析擴增產物。切出對應各全長基因的條帶，用QIAquick凝膠提取試劑盒 (凱傑公司Oliagen))純化並按照生產商說明書克隆入pCR 2. 1-T0P0載體(英傑公司 (Invitrogen)) 0通過DNA測序確認這些克隆的身份。採用Vector NTI高級程序9(英傑公司)進行所有DNA以及多肽序列分析。
實施例2 三種大米HPL的擬南芥轉化
通過將經PCR擴增、TOPO克隆和Ec0RI-/BamHI-消化的所有三種大米全長HPL 的片段克隆入pEM-NLGFP的EcoRI/BamHI位點構建用於穩定表達的綠色螢光蛋白(GFP) 融合體。引物設計為消除終止密碼子並將編碼序列與GFP基因的5'末端融合。OsHPLl 所用引物為正向5 『 -ATA-GAATTCATGGCGCCGCCGCGAG-3 『和反向5 『 -ATAGGATCCGCT A-CTCCGCGCCGCGCG-3 『。0sHPL2 所用引物為正向ATAGAATTCATGGCGCCACCGCCAGT_3 『 和反向5 『 -ATAGGATCC-GCTCCCGACGACGCCCGT-3 『。採用以下引物擴增 0sHPL3 正向 5 『 -ATAGAATTCATGGTGCCGTCGTTCCC-3 『和反向5 『 -ATAGGATCCGCGCTGGGAGTGAGCTCCC -3'。為產生0sHPL3-TP(HPL3減去蛋白氨基末端前15個胺基酸的質體轉運肽)，擴增 0sHPL3cDNA (正向5 『 -CCGGCCAATACCGGGG-3 『和反向 5 『 -TTAGCTGGGAGTGAGCTC-3 『)。 如上所述進行PCR擴增，對所有擴增基因採用Tm = 55°C。通過採用NotI限制性位點將OsHPLU0sHPL2與0sHPL3的開放閱讀框從ρΕΜ-NLGFP亞克隆到二元載體內使GFP基因位於各基因的C末端，產生用於擬南芥轉化的GFP融合體。對於0sHPL3-TP，根據生產商的推薦將PCR產物克隆入(Gateway pENTER載體。然後，所述構建物被完整測序，並在入門克隆 pENTR 0sHPL3-15AA TP 和 pB7WGF2 載體之間的重組反應中產生 pB7WGF2-0sHPL3_15AA TP 構建物。所述構建物經測序校驗，引入土壤桿菌EHAlOl菌株，並通過花浸漬方法用於轉化擬南芥植物(Clough，S. J.和 Bent, Α. F.，Plant J. 16 =735-743,1998)。Tl 植物在土壤上發芽。通過用1 1，OOOFinale(商業產品，其是5. 78%草丁膦銨)每周2次處理10至12 天的幼苗來選擇轉基因植物。在轉化植物中證實OsHPLl、HPL2和HPL3-TP定位於質體外， 以及0sHPL3定位於質體內。
^MM 3 大米HPLl和/或HPL2在擬南芥中的表汰1武予耐轎件
根據測得的植物暴露於200mM NaCl 5天的存活率(圖1)，觀察到 HPLl (p ^ 0. 003)和HPL2 (p ^ 0. 001)品系對鹽脅迫的耐性都提高。天然hpl的無效突變體Col-O用作對照。採用在Col-O內源啟動子下表達HPL基因校正版本的純合品系。
在第二項實驗中，五周齡的HPL2和Col-O植物經受三周鹽處理，然後恢復10天。 每三天用營養液(改良的斯伯丁溶液(Spalding solution))給植物澆水一次。所加液體的體積可允許浙1/3體積。對於所用花盆尺寸，每盆加入50-75ml營養液。當鹽處理植物時， 每三天用加有IOOmM NaCl的營養液對它們澆水一次。在恢復期間，每三天用營養液給植物澆水一次。當植物生長於 Sunshine Mix#3 (67%相對 50% )或 Sunshine Mix#3 和 Profile Green (31%相對21% )的50/50混合物時，IOOmM鹽脅迫後，HPL2品系的存活率高於Col-O 品系。
實施例4 大米HPL在擬南芥質體外的表達賦予乾旱耐受性
根據撤去水10天後測得的植物存活率(圖幻，觀察到HPLl、HPL2和HPL3-TP (HPL3 減去質體轉運肽的15個胺基酸，所述酶定位於質體外)品系對乾旱脅迫的耐受性提高(分別為ρ彡0. 001,0. 004和0. 001)。天然hpl的無效突變體Col-O用作對照。和HPL定位與質體外的品系相反，HPL3品系(酶定位在質體內)的存活與Col-O品系沒有區別。植物在含有相同量土壤的盆中各自生長。所有盆用相同水量澆水。當植物為2.5周齡時(所有植物有8-10片真葉)，撤去水9天，此時約50%的Col-O植物看來已死。隨後，植物過量澆水並在進一步分析前放置恢復5天。進行三次獨立實驗。在各實驗中，各品系由10-14株植物代表。
實施例5 表達大米HPLl和HPL3的擬南芥品系的微陣列分析
評估表達大米HPLl和大米HPL3的擬南芥品系葉子相較Col_0的基因表達水平。 從標準條件下(22°C下16小時光照/8小時避光循環)生長在生長室中的3周齡植物的葉中提取RNA。用來自安捷倫技術公司(Agilent Technologies)的擬南芥晶片一式兩份地運行三個生物性樣品(HPL1，HPL3，Col-O)。儘管在HPLl品系和HPL3品系相較Col-O的基因表達水平中觀察到一些差異，特別感興趣的觀察是與熱激蛋白和熱激轉錄因子有關的多個序列在HPLl品系中的增強程度高於HPL3品系(見表1)。
表1 與Col-O品系相比，在HPLl品系和HPL3品系中差異表達的熱激相關蛋白的示例。
序列簡要說明倍數變化 HPLl倍數變化 HPL3At2g26150熱激轉錄因子家族蛋白8.52.22At5g51440小熱激蛋白(HSP23.5-M)8.372.15At3gl2580熱激蛋白705.651.8Atlg07400 17.8 kDa I 型熱激蛋白5.231.68At2g20560 DNAJ 熱激家族蛋白 SP|Q9UDY42.821.48Atlg74310熱激蛋白 101 (HSPlOl)2.74NDAt5g37670 15.7 kDa I型相關小熱激蛋白樣 (HSP15.7-CI)2.441.41At4g 11660熱激轉錄因子7(HSTF7)2.241.33At3gl4200含DNAJ熱激N末端結構域的蛋白2NDAtlg56410熱激蛋白關聯70 kDa蛋白1.95ND
這些序列其一，熱激蛋白101在HPLl中比Col-O上調了 2. 74倍，但在HPL3品系中相比Col-O沒有改變(ND)。近來，熱激蛋白101顯示在賦予熱耐受性中起到重要作用 CTonsor等，Mol. Ecol. 17(6) 1614-1626，2008)。這些數據證明了 HPL基因在質體外過量表達可能針對溫度提高引起的損傷提供保護，引起熱耐受性的增強。
應理解，本文所述的實施例和實施方式僅用於說明，本領域技術人員應了解據此作出的各種修飾或改變，且它們包括在本申請的精神和權限以及所附權利要求
書的範圍內。本文引用的所有發表物、專利和專利申請通過引用全部納入本文以用於所有目的。
非正式序列表
SEQ ID NO 1 (HPL1, AK105964)
gtggctgtgacgatccgacacctgcacgctagtacgtagtgcgtatacgtagccagtacc[0136]61ctactcccgtccatggcgccgccgcgagccaactccggcgacggtaacgaCggCgCCgtC[0137]121ggagggcagagcaagctctcgccgtcgggcctgctgatacgcgagattccgggcggctac[0138]181ggcgtgcccttcctctcgccgctgcgcgaccgcctcgactactattacttccagggcgcc[0139]241gacgagttcttccgctcacgCgtCgCCCgCcacggcggcgccaccgtgctccgcgtcaac[0140]301atgccgcccggccccttcctcgccggcgacCCCCgCgtCgtcgccctcctcgacgcgcgc[0141]361agcttccgcgtcctcctcgacgactccatggtggacaaggccgacacgctcgacggcacc[0142]421ttcatgccgtcgctcgcgctCttCggCggCcaccgcccgctcgccttcctcgacgccgcc[0143]481gaccctcgccacgccaagatcaagcgcgtcgtgatgtcgctcgccgcggcgaggatgcac[0144]541cacgtcgcgcCggCgttCCgcgccgccttcgccgccatgttcgacgaggtcgacgccggc[0145]601ctcgtcgccggcggccccgtcgagttcaacaagctcaacatgcggtacatgctcgacttc[0146]661acctgcgccgCgCtgttCggCggCgCgCCgccgagcaaggccatgggcgaCgCtgCCgtg[0147]721acgaaggcggtgaagtggctcatcttccagcttcacccgctcgccagcaaggtcgtcaag[0148]781CCgtggCCgCtggaggacctcctcctccacaccttccgcctgccgccgttCCtggtgCgC[0149]841cgcgagtacggcgagatcacggcgtacttcgccgccgccgccgcggccatcctcgacgac[0150]901gccgagaagaaccacccgggaatcccgcgcgacgagctcctccacaacctcgtgttcgtc[0151]961gccgtcttcaacgcctacggcggcttcaagatcttcctgccacacatcgtcaagtggctc0152]1021gcccgcgccggcccggagctccacgccaagctagcctccgaggtccgcgcCgCCgCgCCC0153]1081gccggcggcggcgagatcaccatctccgccgtggagaaggagatgccgctggtgaagtcg0154]1141gtggtgtgggaggcgctgcgcatgaacccgccggtggagttccagtacgggcgcgcgcgg0155]1201cgcgacatggtcgtcgagagccacgacgcggcgtacgaggtccgcaagggggagctgctg0156]1261ttcgggtaccagccgctcgccacccgcgacgagaaggtgttcgaccgcgccggcgagttc0157]1321gtccccgaccggttcgtctccggcgccggaagcgccgcccggccgctgctggagcacgtg0158]1381gtgtggtcgaacgggccggagaccgggacgccatcggaggggaacaagcagtgccccggg0159]1441aaggacatggtggtggcggtggggcggctgatggtggcggggctgttccggcggtacgac0160]1501acgttcgccgccgacgtggaggagctgccgcttgagccggtggtcacgttcacgtcgctg0161]1561acccgcgccgccgacggcgaCggCgCCgCgcggcgcggagtataatagtgtcaagcggcg0162]1621gcgcgcgtgagcggcgagtgttggtgcggcgacgacgctgtccatgcatggtcgctgtca0163]1681gttggtcagatttgcatggatttcttttttctttgacctaaaaaaattgggaaaaaggtg0164]1741tactttcgcgtgcttgtgggggcaggttcttaagtatagggattcggtttgtcattgtgt0165]1801gaagttcaatacgatgtttgaagttgaataaaattatgtgcgttcctcgtggtttt0166]SEQID NO 20167]MAPPRANSGDGNDGAVGGQSKLSPSGLLIREIPGGYGVPFLSPLRDRLDYYYFQGADEFFRSRVARHGG
ATVLRV匪PPGPFLAGDPRWALLDARSFRVLLDDSMVDKADTLDGTFMPSLALFGGHRPLAFLDAADPRHAKIKRV VMSLAAARMHHVAPAFRAAFAAMFDEVDAGLVAGGPVEFNKL匪RYMLDFTCAALFGGAPPSKAMGDAAVTKAVKWL IFQLHPLASKVVKPWPLEDLLLHTFRLPPFLVRREYGEITAYFAAAAAAILDDAEKNHPGIPRDELLHNLVFVAVFN AYGGFKIFLPHIVKWLARAGPELHAKLASEVRAAAPAGGGEITISAVEKEMPLVKSVVWEALRMNPPVEFQYGRARR DMVVESHDAAYEVRKGELLFGYQPLATRDEKVFDRAGEFVPDRFVSGAGSAARPLLEHVVWSNGPETGTPSEGNKQC PGKDMWAVGRLMVAGLFRRYDTFAADVEELPLEPWTFTSLTRAAD ⑶ GAARRGV
SEQID NO :3(HPL2, AK107161)[0169]ctcctcgaacCSLSLCCCSLSLCSLcaacacttgcacttgcactacgtactctcatttcatccgc[0170]6tcccggccggcaatggcgccaccgccagtgaactccggcgacgccgccgccgccgccacg[0171]12ggagagaagagcaagctctcgccgtcgggcctccccatacgcgagatacccggcggctac[0172]18ggcgtgcccttcttctcgccgctgcgcgaccgcctcgactacttctacttccagggcgcc[0173]24gaggagtacttccgatcacgcgtcgcccgccacggcggcgccaccgtgctccgcgtcaac[0174]30atgccgcccggccccttcatctccggcaacccccgcgtcgtcgccctcctcgacgcgcgc[0175]36agcttccgcgtcctcctcgacgactccatggtggacaaggccgacacgctcgacggcacc[0176]42tacatgccgtcgcgcgcgctcttcggcggccaccgcccgctcgccttcctcgacgccgcc[0177]48gacccgcgccacgccaagatcaagcgcgtcgtgatgtcgctcgccgccgcgcggatgcac[0178]54cacgtcgcgcCggCgttCCgcgccgcctttgccgccatgttcgacgccgtcgaggccggc[0179]60ctcggcgccgccgtcgagttcaacaagctcaacatgaggtacatgctcgacttcacctgc[0180]66gccgcgctgttcggcggcgagccgccgagcaaggtggtcggcgacggcgccgtgacgaag[0181]66gccgcgctgttcggcggcgagccgccgagcaaggtggtcggcgacggcgccgtgacgaag[0182]72gccatggcgtggctcgcgttccagctgcacccgatcgcgagcaaggtcgtcaagccatgg[0183]78ccgctcgaggagctactcctgcacaccttctccctgccgccgttcctggtgcggcgtggc[0184]84tacgccgacctgaaggcgtacttcgccgacgccgccgcggccgtcctcgacgacgccgag0185]901aagagccacacgggaatcccgcgcgacgagctcctcgacaaccttgtgttcgtcgccatt0186]961ttcaacgccttcggcggcttcaagatcttcctgccacacatcgtcaagtggctcgcccgc0187]1021gccggcccggagctccacgccaagcttgccaccgaggtccgcgccaccgtgcccaccggc0188]1081gaggacgacggcatcaccctCgCCgCCgtCgagcggatgccgctggtgaagtcggtggtg0189]1141tgggaggcgctgcgcatgaaCCCgCCggtggagttccagtacggccacgcgcggcgcgac0190]1201atggtggtcgagagccacgacgcggcgtacgaggtgcgcaagggggagatgctgttcggc0191]1261taccagccgctcgccacccgcgacgagaaggtgttcgaccgcgccggcgagttcgtcgcc0192]1321gaccggttcgtcgccggcggCgCCgCCggCgaccggccgctgctggagcaCgtggtgtgg0193]1381tcgaacgggccggagacgagggcgccatcggaggggaacaagcagtgccccgggaaggac0194]1441atggtggtggcggtggggcggctgatggtggcggagctgttccggcggtacgacacgttc0195]1501gccgccgacgtggtggaggcgccggtggagccggtggtgacgttcacgtcgctgacacgg0196]1561gcgtcgtcgggatagcacgcacgtcgacgtcacgtgcgcgCCgtgCtgtgatttagtact0197]1621gtactaggttggtggatgttttaattgcgtggttaattattaatcacgcataaagtatta0198]1681atcatgttttatcatctaacaacaatgaaa￡Ι ￡Ι ￡1￡Ι 0￡1t0199]SEQID NO 40200]MAPPPVNS⑶AAAAATGEKSKLSPSGLPIREIPGGYGVPFFSPLRDRLDYFYFQGAEEYFRSRVARHGG
ATVLRV匪PPGPFISGNPRWALLDARSFRVLLDDSMVDKADTLDGTYMPSRALFGGHRPLAFLDAADPRHAKIKRV VMSLAAARMHHVAPAFRAAFAAMFDAVEAGLGAAVEFNKL匪RYMLDFTCAALFGGEPPSKVV⑶GAVTKAMAWLAF QLHPIASKVVKPWPLEELLLHTFSLPPFLVRRGYADLKAYFADAAAAVLDDAEKSHTGIPRDELLDNLVFVAIFNAF GGFKIFLPHIVKWLARAGPELHAKLATEVRATVPTGEDDGITLAAVERMPLVKSVVWEALRMNPPVEFQYGHARRDM WESHDAAYEVRKGEMLFGYQPLATRDEKVFDRAGEFVADRFVAGGAA⑶RPLLEHVVWSNGPETRAPSEGNKQCPG KDMVVAVGRLMVAELFRRYDTFAADVVEAPVEPVVTFTSLTRASSG
SEQID NO :5(HPL3,AY340220)-缺失帶下劃線的序列以避免所編碼的多肽轉運進入質體[0202]tagagtcagtgtcataacgcaagctaccacacgtagctgataagtccgatCgtCgCCgCg[0203]6CgCCgCgCC互tRRtRCCRtCRttCCCRCaR CCRRCCaRtR CRRCRRCRRCRaCRCRRCCa[0204]12ataccggggagctacggcccgccgctgctcggcccgctccgcgaccgcctcgactacttc[0205]18tggttccagggccccgacgacttcttccgcCgCCgCgCCgccgaccacaagagcaccgtg[0206]24ttccgcgccaacatcccgcccaccttccccttcttcctcggcgtcgacccgcgcgtcgtc[0207]30gccgtcgttgatgccgccgccttcaccgcgctcttcgacccggccctcgtcgacaagcgc[0208]36gacgtcctcatcggcccctacgtccccagcctcgccttcacccgcggcacCCgCgtCggC[0209]42gtctacctcgacacccaggaccccgaccacgcccgcaccaaggccttctccatcgacctc[0210]48ctccgccgcgccgcccgcaaCtgggCCgCCgagctccgcgccgccgtcgacgacatgctc[0211]54gccgccgtcgaggaagacctcaacagggcccctgaccccgccgccgcctccgccagctac[0212]60ctcatcccgctccagaagtgcatcttccgcttcctctgcaaggcgctcgtcggcgccgac[0213]66CCggCggCggacggcctcgtcgaccgcttcggcgtgtacatcctcgacgtgtggctggcg[0214]72ttgcagctggtgccgacgcagaaggtgggcgtcatcccgcagccgctggaggagctcctg[0215]78ctccactccttcccgctgccgtcgttcgtcgtcaagcccgggtacgacctcctctaccgc[0216]84ttcgtggagaagcacggcgcCgCCgCCgtgtccatcgctgagaaggagcacggcatcagc[0217]901aaggaggaggCC￡ltC￡l￡lC￡l￡lcatcctcttcgtgctcggcttcaacgcgttcggcggcttc[0218]961tcggtgttcctgccgttcctggtcatggaggtcggcaagcccggccgggaagacctgcgg[0219]1021CggCggCtgCgggaggaggtgcgccgcgtgCtgggCggCggcgacggcggcgaggccggg[0220]1081ttcgcggcggtgagggagatggcgctggtgcggtcgacggtgtacgaggtgctccggatg[0221]1141cagccgccggtgccgctgcagttcgggcgggcgcggcgagacttcgtgctgcggtcgcac[0222]1201ggcggcgcggcgtacgaggtgggcaagggcgagctgctgtgcgggtaccagccgctggcc[0223]1261atgcgcgaccCggCggtgttcgaccggccggaggagttcgcgccggagaggttcctcggc[0224]1321gacgacggcgaggcgctgctgcagtacgtgtactggtccaacgggccggagaccggcgag[0225]1381CCgtCgCCggggaacaaacagtgtgccgccaaggaggtggtcgtcgccaccgcgtgcatg[0226]1441ctcgtcgccgagcttttccggcggtacgacgacttcgaatgcgacggcacctccttcacc[0227]1501aagctcgacaagcgggagctcactcccagctaagctttgctgccgccattctctcactcg[0228]1561atctccatgcacatatgcatgaagaaattaagttgctagctccatttttt[0229]1621ctctttgagctgctgataaatattcttctgtgcaataagc
1681 gcattaatca gagcgtacaa gtaaaaattg ttttcactgt tttatgtgga t
SEQ ID NO :6_缺失帶下劃線的序列以避免多肽轉運進入質體
MVPSFPQPASAAAATRPIPGSYGPPLLGPLRDRLDYFWFQGPDDFFRRRAADHKSTVFRANIPPTFPFF LGVDPRVVAVVDAAAFTALFDPALVDKRDVLIGPYVPSLAFTRGTRVGVYLDTQDPDHARTKAFSIDLLRRAARNWA AELRAAVDDMLAAVEEDLNRAPDPAAASASYLIPLQKCIFRFLCKALVGADPAADGLVDRFGVYILDVWLALQLVPT QKVGVIPQPLEELLLHSFPLPSFVVKPGYDLLYRFVEKHGAAAVSIAEKEHGISKEEAINNILFVLGFNAFGGFSVF LPFLVMEVGKPGREDLRRRLREEVRRVLGGGDGGEAGFAAVREMALVRSTVYEVLRMQPPVPLQFGRARRDFVLRSH GGAAYEVGKGELLCGYQPLAMRDPAVFDRPEEFAPERFL⑶DGEALLQYVYWSNGPETGEPSPGNKQCAAKEVWAT ACMLVAELFRRYDDFECDGTSFTKLDKRELTPS
權利要求
1.一種製備耐非生物脅迫植物的方法，所述方法包括(a)將含有編碼HPL酶的氫過氧化物裂合酶(HPL)多核苷酸的重組表達盒引入植物群體；以及(b)選擇耐受非生物脅迫的植物；其中所述 HPL 酶包含(L/I)-(F/C)-G-(Y/F)-(Q/R)-(P/K)和(N/D)-K-(Q/I)-C-(A/ P)-(G/A)-K- (D/N)。
2.如權利要求
1所述的方法，其特徵在於，所述HPL酶在植物群體中表達時定位於質體外。
3.如權利要求
1所述的方法，其特徵在於，所述HPL酶識別9-氫過氧-十八碳三烯酸 (9-HP0T)或9-氫過氧-十八碳二烯酸(9-HP0D)。
4.如權利要求
1所述的方法，其特徵在於，所述HPL酶識別13-氫過氧-十八碳三烯酸 (13-HP0T)或13-氫過氧-十八碳二烯酸(13-HP0D)。
5.如權利要求
1所述的方法，其特徵在於，所述HPL酶在所述植物群體中表達時定位於質體外，其中所述HPL酶識別9-氫過氧-十八碳三烯酸(9-HP0T)或9-氫過氧-十八碳二烯酸(9-HP0D)。
6.如權利要求
5所述的方法，其特徵在於，所述HPL酶還識別13-氫過氧-十八碳三烯酸(13-HP0T)或13-氫過氧-十八碳二烯酸(13-HP0D)。
7.如上述權利要求
中任一項所述的方法，其特徵在於，所述HPL酶的胺基酸序列與SEQ ID NO. 2、4或6至少90%相同。
8.一種製備耐非生物脅迫植物的方法，所述方法包括(a)將包含編碼HPL酶的氫過氧化物裂合酶(HPL)多核苷酸的重組表達盒引入植物群體，其中所述HPL酶的胺基酸序列與SEQ ID NO. 2、4或6至少90%相同；以及(b)選擇耐受非生物脅迫的植物，其中所述HPL酶在植物群體中表達時定位於質體外。
9.如權利要求
1所述的方法，其特徵在於，所述引入步驟通過有性雜交進行。
10.如權利要求
1所述的方法，其特徵在於，所述引入步驟採用微粒轟擊進行。
11.如權利要求
1所述的方法，其特徵在於，所述HPL多核苷酸是SEQID NO. 1、3或5。
12.如權利要求
1所述的方法，其特徵在於，所述植物是水稻(Oryzasativa)。
13.如權利要求
1所述的方法，其特徵在於，所述非生物脅迫是乾旱。
14.如權利要求
1所述的方法，其特徵在於，所述非生物脅迫是鹽。
15.如權利要求
1所述的方法，其特徵在於，所述HPL多核苷酸與啟動子操作性連接。
16.如權利要求
15所述的方法，其特徵在於，所述啟動子是組成型或誘導型。
17.一種包含重組表達盒的轉基因植物，其中所述重組表達盒包含編碼HPL酶的HPL多核苷酸，所述HPL酶的胺基酸序列與SEQ ID NO. 2、4或6至少90%相同，前提是所述植物不是擬南芥。
18.如權利要求
17所述的轉基因植物，其特徵在於，所述植物是水稻(Oryzasativa) 0
19.一種來自如權利要求
18所述的轉基因植物的轉基因種子。
20.如權利要求
19所述的轉基因種子，其特徵在於，所述種子是轉基因水稻種子。
專利摘要
本發明提供了製備耐受非生物脅迫如乾旱或鹽的植物的新方法。本發明還提供了耐受非生物脅迫的轉基因植物和轉基因種子。本發明所述方法包括將含有編碼氫過氧化物裂合酶的氫過氧化物裂合酶多核苷酸的重組表達盒引入植物，並選擇耐受非生物脅迫的植物。根據本發明所述方法產生的轉基因植物和種子相應包含重組表達盒，其含有編碼HPL酶的HPL多核苷酸。
文檔編號A01H5/00GKCN102395265SQ201080017089
公開日2012年3月28日 申請日期2010年3月2日
發明者K·德海西, T·薩夫臣科 申請人:加利福尼亞大學董事會導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan