改進的脂解酶及其用途的製作方法
2023-04-28 06:54:51
專利名稱：改進的脂解酶及其用途的製作方法
總的來說，本發明涉及脂解酶領域。更具體地說，本發明涉及採用重組DNA技術改進的脂解酶，涉及該酶的製備方法及該酶的用途，尤其是應用酶促洗滌組合物。
脂解酶是指將甘油三酯水解為游離脂肪酸以及甘油二酯，甘油單酯以及最後水解為甘油的酶。它們還能分解更複雜的酯如植物的角質層或皮膚的皮脂。工業上的各種酶促過程如甘油三酯的酯交換以及酯基轉移作用以及酯合成過程中都應用脂解酶。為了有助於提高洗滌劑產品的去除油脂的特性，將脂解酶用於洗滌劑組合物中。
最普遍使用的脂解酶是脂酶(EC 3.1.1.3)。例如，EP-A-258 068和EP-A305 216(兩個Novo Nordisk)兩者描述了採用重組DNA技術由異源宿主微生物製備的真菌脂酶，尤其是從Thermomyces Lanuginosus/Humicola lanuginosa製備的脂酶。EP-A-331 376(Amano)描述了含有蔥頭假單胞脂酶的胺基酸序列的脂酶以及該酶的重組DNA製備技術，及其用途。在WO 89/09263以及EP-A-218272(兩個Gist-Brocades)進一步提供了重組DNA技術製備的脂酶的例子。儘管公開了大量的脂酶及其修飾物，但到目前為止，僅發現來源於Humicola lanuginosa的脂酶由於其可用作為商品名為Lipolase(TM)的洗滌產品的附加成分而具有廣泛的商業應用性。
脂酶的一個鑑別特徵是它們具有界面活化作用。這意味著該酶對已形成界面或膠態分子團的底物的作用比對完全溶解的底物的作用活性更高。當將底物濃度提高至底物的臨界膠團濃度(CMC)，並形成界面時突然提高脂解活性可出現界面活化作用。將試驗結果繪製酶活性相對底物濃度圖譜，上述現象在該圖上表現為不連續的點。
根據脂酶分子蛋白質結構中構象變化可解釋脂酶的界面活性化作用機制。在游離的未結合狀態，由一個螺旋形的蓋覆蓋了催化結合位點。在結合至脂類底物上後，該蓋被取代並將催化位點暴露出來。也可以認為螺形蓋與脂類界面相互作用，因而使酶仍結合至該界面上。
WO-A-92/05249(Novo Nordisk)公開了通過遺傳手段改進的脂酶，尤其是來自於Humicola lanuginosa的脂酶，在該酶的脂類接觸區已進行了改變。該申請中將脂類接觸區定義為由螺旋形復蓋的活性形式的表面。其中的改進包括缺失或取代該脂類接觸區中的一個或多個胺基酸殘基，經增加脂類接觸區的靜電荷和/或降低其疏水性，或便於改變脂類接觸區的表面構型。這種改進可以採用使脂類接觸區內的一個或多個帶負荷胺基酸殘基缺失，或用中性或多個帶正電荷胺基酸取代這些胺基酸，和/或用帶正電荷胺基酸替代該脂類接觸區內的一個或多個中性胺基酸殘基，和/或缺失該脂類接觸區內的一個或多個親水性胺基酸殘基，或由疏水性胺基酸取代這些殘基來實現。
角質酶(Cutinase)是蠟酯水解酶的一個亞類(EC3.1.1.50)。這些酶能降解角質層即存在於植物上的脂化的長鏈脂肪酸和脂肪醇的網狀組織，作為葉和莖的保護性覆蓋層。另外，角質酶具有某些脂解活性。即能夠水解甘油三酯。因此將這些酶作為脂酶的一個特殊種類。但是，與脂酶相反，角質酶沒有顯示任何本質上的界面活化作用。
角質酶可從如植物(例如花粉)，細菌以及真菌的多種來源得到。由於其降解脂肪的特性，已有人建議將角質酶作為酶促洗滌劑組合物的成分。例如，WO-A-88/09367(Genencor)建議將一種表面活性劑和一種基本上活化的細菌角質酶結合可以配製有效的洗滌劑組合物。它公開的洗滌劑組合物包括從革蘭氏陽性細菌蔥頭假單胞菌ATCC 53552獲得的角質酶。但是，在更新的歐洲專利申請EP-A-476 915(Clorox)中，公開了當以常規方法使用時，同樣的該酶(該文中稱為脂酶)在從纖維織物上去除油汙漬時並不比其他脂酶更有效。
最近，已測定了從茄病鐮孢得到的角質酶的三維結構(Martinezet al.(1992)Nature 356，615-618)。已發現這些角質酶並不具有覆蓋催化結合位點的螺旋形蓋子。代替之，似乎溶劑可接近該活性位點絲氨酸殘基。這些結果似乎已證實本發明的關於脂酶的界面活化作用機制的理論。
已將茄病鐮孢的角質酶基因進行克隆並已測序(Ettinger et al.，(1987)Biochemistry 26，7883-7892)。WO-A-90/09446(植物遺傳系統)描述了該基因在大腸桿菌中的克隆和製備。在角質酶和底物之間有或無界面對，該角質酶能有效地催化水相和非相介質中的酯的水解和合成。基於它的總體穩定性，暗示該角質酶能用於製備如洗衣用洗滌劑的洗滌劑以及其他特殊的脂溶性製劑如化妝用組合物和香波。尚沒有公開經濟可行的製備該酶的方法，也沒有公開含有角質酶的具體的酶促洗滌劑組合物。
由於上面所述鑑別特徵，即沒有界面活化作用。為了達到公開本專利申請的目的，我們將角質酶定義為基本上沒有界面活化作用的脂解酶。因此角質酶與經典的脂酶不同，它不具有覆蓋催化結合位點的螺旋形蓋。
如上所述，至今為止只有來源於Humicola lanuginosa的脂酶由於其可作為商品名為Lipolase(TM)的洗滌劑產品的添加劑而具有廣泛的商業應用性。在CHemistry and Industry 1990，第183-186上登載的Henrik Malmos的文章中，指出已知在洗滌過程中脂酶活性通常是低的，並且Lipolase(TM)也不例外。在乾燥過程中，當纖維織物中水含量降低時，酶恢復其活性並且水解脂肪汙染垢物，在隨後的洗滌周期期間，除去經水解的物質。這一觀點也解釋了為什麼在第一個洗滌周期後脂酶作用較低，但在接著的周期有顯著作用。因此，仍然需要在洗滌過程中具有顯著活性的脂解酶。
我們已經發現角質酶，尤其是茄病鐮孢的角質酶具有明顯的，洗滌用的效果。但是，仍然需要能在富含陰離子的洗滌劑的組合物中具有改善了的洗滌用的脂解活性的角質酶變異體，以及需要製備此類酶的方法。
根據本發明，提供了其中的胺基酸序列已以一定方式進行了改變的角質酶變體，該方式是指提高其與陰離子表面活性劑的相容性。更具體地講，已發現通過降低陰離子表面活性劑與該酶的結合力可以提高富含陰離子的洗滌劑組合物中真核角質酶，尤其是來源於茄病鐮孢，Colletotrichum capsici，盤長孢狀毛盤孢以及Magnaporthe grisea的角質酶的脂解活性。
一種親本角質酶的角質酶變異體，是指以一定的方式改變了其中的胺基酸序列，該方式指特別是通過降低陰離子表面活性劑與該酶結合而提高與陰離子表面活性劑的相容性。
本發明涉及角質酶的變異體。如上所討論，角質酶可從例如植物(如花粉)，細菌和真菌多種來源獲得。在本發明中，作為親本角質酶或起始材料，採用重組DNA進行修飾的角質酶選自於真核角質酶。真核角質酶可以從例如植物(如花粉)，或真菌的各種來源獲得。
(真核)真菌角質組可能含有具有不同特異性，即葉特異性和莖特異性的兩個家族。具有葉特異性的角質酶傾於具有酸性或中性最適PH值，而具有莖特異性的角質酶傾於具有鹼性最適PH值。具有鹼性最適PH值的角質酶更適用於鹼組成的洗滌劑組合物如重垢的織物洗滌粉和洗滌液。具有酸性至中性最適PH的角質酶更適用於輕垢的產品或漂洗調理劑，但也適用於工業洗滌產品。
在下列表Ⅰ中，列出了四種的莖-特異性角質酶，以及它們的最適PH。
表1具有莖特異性的角質酶的例子 最適PH茄病鐮孢 9玫瑰包鐮孢 10茄屬絲核菌 8.5甘藍鏈格孢(PNB ase I) 9本發明中特別優選的角質酶來源於野生型茄病鐮孢(Ettinger et al.1987)。當用於特定洗滌劑組合物時，該角質酶具有明顯的「洗滌用」的效果。
與來自於茄病鐮孢的角質酶具有高度胺基酸序列同源性的角質酶也適合作為本發明中採用重組DNA技術進行修飾的親本角質酶或起始材料。這樣的例子有來自Colletotrichum capsici，盤長孢狀盤孢以及Magnaporthe grisea的角質酶。在
圖11中列出了這些角質酶的部分胺基酸序列，並從中可看出有高度同源性。
可供選擇來用於通過改變其基因而改進茄病鐮孢角質酶的方案是，使用源於茄病鐮孢，Colletotrichum capsici，盤長孢狀毛盤孢以及Magnaporthe grisea的編碼(原)角質酶的cDNA的5′和3′-DNA探針以及能識別其他角質酶中的保守序列的探針來分離編碼其他真核有機體角質酶的遺傳信息，並且如果必要，通過聚合酶鏈反應或PCR技術，使用這此探針以擴增源於產生角質酶的真核細胞的信使RNA(mRNA)的cDNA(參見，例如WO-A-92/05249)。根據標準方法，將得到的角質酶編碼基因克隆於大腸桿菌並在其中表達以後，在合適條件下檢測角質酶在去除(脂肪)汙物方面的效果。在該方法中可以獲得大量的具有改善的洗滌效果的上面所述角質酶天然存在的變異體。而且，這些天然存在的角質酶序列為茄病鐮孢角質酶進一步的蛋白質工程提供了極好的依據。
基於關於決定脂解酶的「洗滌用」活性的因子以及仔細檢查茄病鐮孢角質酶的3D結構(Martinez et al.(1992)Naturc 356，615-618)的新觀點並且檢查了茄病鐮孢角質酶的3D結構，我們發現通過重組DNA技術有多種可能性可以提高該角質酶以及一般所說角質酶與陽離子表面活性劑的相容性。
從已知的茄病鐮孢角質酶的3D結構開始，應用在SYBYL分子成型軟體包裝的COMPOSER組件(TRIPOS associates，Inc.St.Louis，Missouri)中提供的基於規則的可相比的成型技術獲得盤長孢角質酶的3D結構。應用BIOSYM分子面型軟體包裝(BIOSYM，SanDiego，California)中提供的能量最小化方法(EM)以及分子動態學(MD)技術精製所獲得的盤長孢狀毛盤孢角質酶模型。在該模型的EM和MD精製過程中，使用基於公知技術的方法，基於潛在的能量作用以及已知的結構標準，同時可使模型的能量分派達到最佳化。按照如二級結構成分中氫鍵的數目和特性，氫鍵合類型，肽單位的定向主鏈二面角的值，芳香族基因的幹擾角以及腔的大小的標準估測模型性質。而且，檢測模型中非適當掩蔽的電荷，極度顯露的疏水基以及處於能量不穩定的位置的二硫鍵。從Ponder Richards旋轉異構體文庫(Ponder et al.(1987)J.Mol.Biol.193，775-791)選擇相關的側鏈旋轉異構體。根據上面介紹的結構評估標準，從該文庫中最後選擇出特定的側鏈旋轉異構體。用MD法將側鏈原子退火至其位置上。應用同樣的方法可獲得Magnaporthe grisea角質酶的3D-結構。
本發明顯示以一定方式可以改進角質酶，該方式是降低與陰離子表面活性劑的相互作用而不改變改進後的角質酶的洗滌用效果。可用多種方法達到上述結果。首先，通過降低陰離子表面活性劑和酶之間的靜電荷作用而減少陰離子表面活性劑與該酶的結合。例如，通過用賴氨酸殘基替代一個或多個帶正電荷的精氨酸殘基，這此殘基的定位接近於能與陰離子表面活性劑的非極性尾相結合的疏水拼接物。通過在離精氨酸約6
的距離內導入一個負電荷，例如一個穀氨酸殘基而應蓋著該精氨酸殘基的正電荷從而也可以降低陰離子表面活性劑與該酶之間的靜電荷作用。可選擇另一種方法，通過用未帶電荷的胺基酸殘基替代一個或多個正電荷精氨酸殘基可以降低陰離子表面活性劑與該酶之間的靜電荷作用，其中的精氨酸殘基的定位接近於能與陰離子表面活性劑的非極性尾相結合的疏水性拼接物。再者，通過用負電荷胺基酸殘基替代一個或多個正電荷精氨酸殘基可以降低陰離子表面活性劑與酶之間的靜電荷作用，其中所說的精氨酸殘基的定位接近於能與陰離子表面活性劑的非極性尾相結合的疏水性拼接物。
降低陰離子表面活性劑與酶之間的結合力的另一種途經是用疏水性較小的胺基酸殘基替代一個或多個胺基酸殘基，這些殘基定位於能與陰離子表面活性劑的非極性尾相結合的疏水拼接物。這些較小的疏水性胺基酸殘基優選選自於下列組甘氨酸，絲氨酸，丙氨酸，天冬氨酸以及蘇氨酸。
由於這些酶提高了與陰離子的相容性，當用作為富含陰離子洗滌劑或清潔組合物的成分時，本發明製備的角質酶變異體在酶活性方面有優勢。在本發明公開的內容中，富含陰離子是指該洗滌劑或清潔組合物含有表面活性劑系統，組成該系統的陰離子表面活性劑含量高於5%，通常高於10%，特別是高於20%。
已發現在洗滌過程的主要周期中本發明的角質酶變異體具有提高了的洗滌用性能。在洗滌過程的主要周期中具有洗滌用性能是指在用歐洲型的自動化洗衣機進行的單一洗滌過程中，使用就濃度，溫度而言的正常洗滌條件，含有該酶的洗滌劑組合物能從髒汙的織物上除去顯著量的油汙漬。應牢記在同樣條件下，常規使用的從商業途經購買的脂解酶Lipolase(TM)ex Novo Nordisk完全不具有顯著的對油性汙漬的洗滌用效果。
使用下面的分析方法可以估評一種酶對油性汙漬的洗滌用效果。利用不含酶的洗滌劑產品如下文中給出的產品將含有低於10%棉花的新的多酯試驗物預洗滌並且隨後徹底漂洗乾淨。然後用橄欖油或其他適於水解的油汙物弄髒上述的沒有髒汙的布。在一個100ml聚乙烯瓶中將各塊待測布(重約1克)於30ml洗滌液中保溫。該洗滌液含有1克劑量/l的下文中給出的洗滌劑產品。在裝了水的Miele TMT洗衣機中，使用正常的30℃主要洗滌程序將瓶振蕩30分鐘。將3LU/ml濃度的角質酶變異體預加到洗滌液中。對照不含有任何酶。
該洗衣粉具有下列組成(按重量%)LAS 6.9皂 2.0非離子型表面活性劑 10.0沸石 27.0碳酸鈉 10.2硫酸鈉 13.0在洗滌之後，用冷水徹底漂洗布片並在乾燥機中用冷空氣乾燥，估測殘留脂肪的量。這一過程可用幾種方法完成。常用的方法是在Soxhlet萃取中僅用石油醚萃取所檢測的布，蒸餾掉溶劑並且通過稱重而將布片上殘留的脂肪物質作為布片上起始脂肪量的分數，計算出殘留脂肪物質的百分數。
根據第二種更靈敏的方法，用溴化的橄欖油弄髒所檢測的布(Richards，S.，Morris，M.A.and Arklay，T.H.(1968)，Textile Research Journal 38，105-107)。然後在100ml的聚乙烯瓶中將每塊待測布片在30ml洗滌液中保溫。然後在裝滿水的洗衣機中，使用正常的30℃主洗滌程序和振蕩這一系列瓶子。在它程序洗滌後，將待測的布片在冷水中小心地漂洗5秒鐘。漂洗後立即將待測的布在乾燥器中用冷空氣乾燥。在乾燥之後，藉助於X-射線螢光分光光度計通過檢測布片的溴含量而決定殘留的脂肪量。測出移走的脂肪佔待測布片存在的起始量脂肪的百分數，按如下所示除去的髒汙物%＝ (溴bw-溴aw)/(溴bw) ×100%其中溴bw表示在洗滌前布片上溴的百分數，溴aw是在洗滌之後布片上溴的百分數。
估測酶活性的再一種方法是根據經典技術檢測460nm處的反射係數。
在本發明的內容中，一種改進的，變異的或被突變的酶或一種酶的變異體是指由表達一種變異基因的變異有機體產生的酶。一種突變基因(除僅含有靜止突變的酶以外)是指編碼一種酶的基因，該酶具有直接或間接地從其相應的親本酶的序列衍生的一個胺基酸序列，並且酶的序列中有一個或多個位點與親本酶的序列不相同。親本酶是指相應的未改變的基因的基因產物。基因的靜止突變是指在該基因的多核苷酸序列中產生和變化或不同(歸因於多餘的密碼子-胺基酸關係)並未導致該基因編碼的酶的胺基酸序列的變化。
一種變異的或突變的微生物是指一種微生物，它是一種被用於突變其編碼該酶的基因的親本微生物或是從該親本微生物遺傳下來的一種微生物。(a)通過使已存在於親本微生物的相應基因(親本基因)發生突變，或(b)通過轉移(導入)直接或間接從另一種來源獲得的相應基因，然後將其導入(包括突變的基因)至將成為變異微生物的微生物中而完成該微生物的上述突變過程。一種宿主微生物是指由突變基因，或其他來源的一個轉移基因構成其一個成分的微生物。通常它是與親本微生物相同或不同的菌株或具有相同或不同的種源或遺傳特性。
具體講，本發明提供了在WO-A-90/09446(Plant Genetics Systems)中公開的茄鐮孢的角質酶的突變體，以及來源於Colletotrichum capsici，盤長孢狀毛孢以及Magnaporthe grisea的角質酶的突變型。採用重組DNA改進的微生物可以製備這些角質酶變異體，該微生物含有通過重組DNA技術獲得或製備的一個基因。
已經鑑別了由另外一個胺基酸殘基替代幾個胺基酸殘基，例如相對於茄病鐮孢角質酶的序列或其同源序列的突變R17E。
本領域內技術人員將明白，這種改進會影響角質酶的結構。顯然，優選的修飾是不會對活性位點周圍的靜電荷有太多影響。本發明人已經研究出了在酶構象的不可避免的變形與提高活性而得到的利益之間必需要達到何種水平的平衡關係，知道這種平衡何使我們具有高度的成功率，推測並製備成功的角質酶異體。在下面的表Ⅱ或說明書其他段落中，採用如下所示的一字母和三字母縮寫表示肽序列中的胺基酸和胺基酸殘基
表ⅡA=Ala=丙氨酸 V=Val=纈氨酸L=Leu=亮氨酸 I=Ile=異亮氨酸P=Pro=脯氨酸 F=Phe=苯丙氨酸W=Trp=色氨酸 M-Met=蛋氨酸G=Gly=甘氨酸 S=Ser=絲氨酸T=Thr=蘇氨酸 C=Cys=半胱氨酸Y=Tyr=酪氨酸 N-Asn=天冬醯胺Q=Gln=穀氨醯胺 D=Asp=天冬氨酸E=Glu=穀氨酸 K=Lys=賴氨酸R=Arg=精氨酸 H=His=組氨酸在本說明書中，採用下列簡述方法中的突變位置及特性描述了存在於蛋白質胺基酸序列中的突變以及由該突變引起的蛋白質本身突變通過識別受突變影響的原始胺基酸殘基;該突變的位點(以序列編號表示);以及通過識別被用來替代原始殘基的胺基酸殘基。如果有一個額外的胺基酸插入到該序列中，用連接到調節序列或參照序列的最後位在前的成員的編號上的一個或多個寫在下角的字母表示。
例如，以在17位由穀氨醯胺替代精氨酸的特徵的突變按如下命名Arg 17 Glu或R17E。假設在精氨酸後面插入一個其他的胺基酸殘基如脯氨酸，可以表示為Arg 17 Arg Pro或R17RP，或者表示為＊17aP，其中將插入的殘基的位置編號命名為17a。假設在同一位點上缺失精氨酸，可以表示為Arg17＊或R17＊。星號表示在所命名的位置上缺失或錯過一個胺基酸殘基，對於「錯過」可認為是真正缺失或僅與在該位點有一個殘基的另一個序列或參照序列相比有差異或同源。
用加號將多個突變分隔開，例如，R17E+S54I+A128F表示一個攜帶了替代突變的蛋白質，如其中指出的，胺基酸序列中三個所提及的每一個點發生了突變。如果必要，合併下面給出的突變。
下面顯示的表Ⅲ表示本發明的角質酶變異體的具體實例，這些變異體基於茄病鐮孢和Magnaporthe grisea的角質酶的序列得到的。
表Ⅲ茄病鐮孢角質酶變異體R17L,R17K,R17E,L51A,L51S,R78L,T80D,R88E,R96N,R96Q,R156L,A195S,R196A,R196K,R196E。
Magnaporthe grisea角質酶變異體A80D,A88E,R156L。
根據本發明的另一方面，提供了一種製備本發明角質變異體的方法。通常植物病原菌是天然存在的產生角質酶的微生物，並且這些微生物非常不適於用作為改進酶基因的宿主細胞。因此，將改進(原)角質酶的編碼基因整合到重組DNA載體中，利用重組DNA技術可將該載體轉移到優選的宿主微生物中。為了上述目的可以使用基本上相同於WO-A-90/09446中描述的重組DNA載體。
由微生物產生的天然形式的角質酶並不十分適合於發酵方法。為了提高發酵過程的產量。應將編碼改進角質酶的基因轉移至能在便宜培養上快速生長的微生物中，並且該微生物能合成和分泌大量的角質酶。本發明所述的經改進的合適重組DNA(宿主微生物)是在不同的芽孢桿菌，棒狀桿菌，葡萄球菌以及鏈黴菌中的細菌，或低等真核生物如啤酒酵母以及其相關的種，馬克斯克魯維氏酵母及其相關種，多形以遜氏酵母及其相關種，以及麴黴屬內的種。優選宿主微生物是低等真核生物，因為這些微生物在發酵過程中可以很好地產生和分泌酶，並能夠糖酵解角質酶分子。糖酵解作用可使角質酶穩定地存在於洗滌劑系統中。
本發明還提供了通過將改進的真核角質酶基因(例如，源於茄病鐮孢的基因)導入到克隆重組DNA載體中而產生的遺傳物質，以及使用該遺傳物質轉化新的宿主細胞，並用於在新的宿主細胞中表達角質酶變異體基因。
本發明還提供了由重組DNA技術製備或改進的能編碼所述角質酶變異體的多聚核苷酸，提供了含有該多核苷酸的重組DNA載體，以及含有多核苷酸和/或該重組DNA載體的重組DNA修飾的微生物。本發明還提供了相應的編碼改進的真核角質酶的多核苷酸，例如，具有編碼成熟角質酶變異體的鹼基序列的多核苷酸，其中多核苷酸的最後一個轉譯密碼子後跟隨一個終止密碼子，並且選擇性地在編碼成熟角質酶變異體的核苷酸序列的相連的上遊具有編碼該角質酶變異體的前原或原序列的核苷酸序列。
在上述多核苷酸中，可以一定方式改進源於該有機源的編碼角質酶的核苷酸序列，該方式是指製備至少一個，最好是儘可能多的遭受「靜止」突變的編碼子，以形成編碼等價胺基酸殘基的密碼子，並且這些形成的密碼子是新宿主優選選用的密碼子，從而在所述宿主細胞內提供了具有改進穩定性的所導入基因的一種信使RNA。
在為原-或成熟角質酶編碼的核苷酸序列的上遊，可以定位一個核苷酸序列，該序列為適合於所選擇的宿主的信號或分泌序列編碼。因此，本發明的一個實例是指一種重組DNA載體，在該載體中插入了一個為角質酶變異體或其一種前體編碼的核苷酸序列。
例如從下列來源得到的核苷酸序列(a)天然形式的核苷酸序列(例如，編碼由茄病鐮孢產生的前原或原角質酶的原始胺基酸序列);
(b)由新宿主優選的密碼子組成的化學合成的核苷酸序列，並且在新的宿主中該核苷酸序列產生穩定的信使RNA，該核苷酸序列仍編碼原始的胺基酸序列;
(c)採用遺傳工程手段從上面(a)或(b)中介紹的核苷酸序列之一衍生到的核苷酸序列，該序列編碼有不同胺基酸序列但其在洗滌劑系統中有更優選的穩定性和/或活性的茄病鐮孢角質酶。
概括地講，能指導為上文中描述的角質酶基因編碼的核苷酸序列在優選的一種宿主中表達的重組DNA載體優選包括下列成分(a)為成熟角質酶或前角質酶或一種相應的前角質酶編碼的雙鏈(ds)DNA，其中在已直接從分泌信號(為選定的宿主細胞優選)的下遊移走了至少部分前序列。假如應該被轉譯的部分基因沒有以ATG密碼子作為起始密碼子，則應在前面放置一個ATG密碼子。轉譯的基因部分應總是以合適的終止密碼子終止;
(b)一種定位於編碼角質酶的ds DNA的正鏈(成分(a))的上遊的表達調節子(適合於選定的宿主微生物);
(c)一種定位於編碼角質酶的ds DNA的正鏈(成分(a))的下遊的終止子序列(適合於選定的宿主有機體);
(d1)促進ds RNA整合到選定的宿主的基因組中的核苷酸序列或，(d2)適合於所選定宿主的複製源;
(e1)非強制性地含有一個(營養缺陷型)選擇標記。該自養型標記由營養缺陷型標記的編碼區以及一個缺陷型啟動子組成;
(e2)非強制性地含有為與宿主細胞中的角質酶的一種前體形式的成熟和/或分泌有關的蛋白質編碼的ds DNA序列。
上述的重組DNA載體還可以在以前定義的多核苷酸的上遊和/或下遊攜帶促進角質酶功能性質表達的其他序列。該營養缺陷型標記可以由該營養缺陷型標記的編碼區以及一人缺陷型啟動子區組成。
本發明的另一個實施例是發酵生產上面所述的各種角質酶變異體之一。這種發酵可以是一般的間歇發酵，分批補料發酵或連續發酵。選擇使用那種方法根據宿主菌株以及優選的以及優選的後處理方法(本領域已知)決定。因此，本發明還提供了生產如本文定義的角質酶變異體的方法，其中包括發酵培養一種重組DNA修飾的微生物的步驟，該微生物含有採用重組DNA技術製備的至少攜帶一個突變的基因，這種突變影響了所述角質酶的胺基酸序列;從而使之與相應的親本酶相比具有改進的角質酶活性，通過從發酵液中分離出由微生物產生的角質酶，或通過從發酵液中分離出微生物細胞並破碎分離到的細胞而分離出該酶，再採用物理或化學濃縮或純化方法將從所說發酵液或從所說細胞得到的角質酶變異體濃縮或部分純化，從而得到了角質酶變異體製劑。優選選擇的條件是能使微生物將角質酶變異體分泌到發酵液中，並採用過濾或離心法移走後可從發酵液中回收該酶。或者還採用，後將角質酶變異體濃縮並純化到所需的程度。基於已知的發酵技術以及普通使用的發酵和後處理設備得到其本身並不考慮微生物特性的發酵方法。
本發明還提供了採用重組DNA技術製備一種能產生角質酶變異體的改進微生物的方法，其特徵在於將導入到微生物中並為角質酶變異體編碼的基因的5′-末端與為一種(改進的)前功能序列編碼的基因片段相融合，其中的功能前序列作為宿主微生物的信號或分泌序列。
根據本發明的另一方面，提供了一種含有一個角質酶變異體基因的重組DNA修飾的微生物並且它能產生由所說基因編碼的角質酶變異體。在一種重組DNA修飾的微生物中，優選除去編碼天然角質酶的基因(如果原始存在)，例如由另一種結構基因替代。
根據本發明的另一個方面，提供了含有本發明角質酶變異體的酶促洗滌劑組合物。該組合物是由角質酶變異體與通常用於洗滌劑系統中的其他成分結合得到，這些其它成分包括在如本領域內已知的和在EP-A-258 068中例舉的那些洗滌劑組合物和全料配製的洗滌劑和清潔組合物類型中使用的添加劑。
該洗滌組合物中的其他成分可以是許多已知種類中的任何一種，例如在GB-A-1 372034(Unilever)，US-A-3 950 277，US-A-4 011 169，EP-A-179533(Procter Gamble)，EP-A-205 208以及EP-A-206 390(Unilever)，JP-A-63-078000(1988)，以及Research Disclosure 29056 of June 1988，以及本文提到的幾種說明書的公開的組合物，上述文獻引入本文作為參考。
本發明的角質變異體適用於加入到任何合適形式的洗滌劑組合物中，即粒狀組合物形式，該酶的溶液或漿液或添加了載體物質。
(例如，EP-A-258 068中公開的以及Novo Nordisk的Savinase(TM)以及Lipolase(TM)產品)。
所加入的角質酶變異體的量可以在很寬範圍內選擇，例如在每克洗滌劑組合物為10-20，000LU，並且優選的是在50-2，000LU的範圍內。在本說明書中，LU或脂酶單位的定義是相同於在EP-A-258 068(Novo Nordisk)中的定義。
同樣可以考慮應用(細節略作改變)其他酶，如蛋白酶，澱粉酶，也可以存在纖維素酶。通過容具有PI值低於10的蛋白酶中選出一種，與該角質酶變體一起加入該洗滌組合物中時有優點。EP-A-271 154(Unilever)描述了許多種這樣的蛋白酶。與角質酶變異體一起使用的蛋白酶包括如BPN型的枯草桿菌蛋白酶或在文獻中公開的此類型的多種枯草菌蛋白酶中任何一種，例如在EP-A-130 756或EP-A-251 446(兩個均屬Genentech);US-A-4 760 025(Genencor);EP-A-214 435(Henkel);WO-A-87/04661(Amgen);WO-A-87/05050(Genex);Thomas et al.J.Mol.Biol.(1987)193，803-813;Russel et al.Nature(1987)328，496-500中描述的突變體蛋白酶。
在下面的實施例中將對本發明作進一步描述。除非另有說明，在核酸物質的操作及分析中使用的所有技術基本上按照Sambrook et al.(1989)的描述進行。
附圖描述如下圖1A.合成的茄病鐮孢角質酶基因的盒1和含有的寡核苷酸的核苷酸序列。在盒序列中標出了寡核苷酸變化。小寫字母是指開放式閱讀框架外的核苷酸位置。
圖1B.合成的茄病鐮孢角質酶基因的盒2和含有的寡核酸的核苷酸序列。在盒序列中標出了寡核酸的變化。
圖1C.合成的茄病鐮孢角質酶基因的盒3和其含有的寡核酸的核苷酸序列。在盒序列中標出了寡核酸的變化。小與字母是指該開放式閱讀框架以外的核苷酸位。
圖1D.編碼茄病鐮孢前原角質酶的合成角質酶基因的核苷酸序列。標出了角質酶前序列，原序列以及成熟序列。也標出了用於克隆的位點以及寡核苷酸的變化。小寫字母是指開放式閱讀框架外的核苷酸位點。
圖2.用於將茄病鐮孢原角質酶的編碼序列連接到大腸桿菌PhoA前序列的衍生物的編碼序列上的合成DNA片段的核苷酸序列。標出了核糖體結合位點(RBS)以及用於克隆的限制性酶位點。還用一個字母密碼子標出了所編碼的Pho信號序列以及部分角質酶基因的胺基酸序列。
圖3.盒8，一個SacⅠ-BclⅠ片段的核苷酸序列，該序列編碼轉化酶前序列和成熟茄病鐮孢角質酶兩者的編碼序列之間的融合位點。
圖4.通過從pUR 2740中缺失0.2Kb SalⅠ-NruⅠ而獲得的pUR 2741質粒，它是一種大腸桿菌-啤酒酵母穿梭載體，它包含有部分PBR 322，源於2μm質粒的在酵母細胞中起作用的複製源點，一種酵母Leu2D基因，以及酵母轉化酶信號序列編碼區與受酵母gal 7啟動子控制的一種植物α-半乳糖苷酶基因的融合體。
圖5，質粒pUR 7219是一種大腸桿菌-啤酒酵母穿梭載體，它含有部分pBR 322，源於2μm質粒的在酵母細胞中起作用的複製源點，一種酵母Leu 2D基因以及酵母轉化酶信號序列編碼區與受酵母gal 7啟動子控制的成熟茄病鐮孢角質酶的編碼區的融合體。
圖6.質粒pUR 2740是大腸桿菌-啤酒酵母穿梭載體，它含有部分pBR 322，源於2μm質粒的在酵母細胞中起作用的複製源點，一個酵母Leu 2D基因，以及酵母轉化酶信號序列編碼區與受酵母gal 7啟動子控制的一個植物α-半乳糖苷酶基因的融合體。
圖7.盒5，6和7的核苷酸序列，包括exlA前序列和成熟茄病鐮孢角質酶的編碼序列的不同類型的連接體。
圖8.將黑麴黴awamori變種基因組DNA的5.3Kb SalⅠ片段插入到pUC 19的Sal Ⅰ位點獲得的pAW 14B質粒。
圖9.用含有茄病鐮孢前原角質酶編碼序列的BspHⅠ-AflⅡ片段替代pAW 14B中包括exlA開放式框架的BspHⅠ-AflⅡ片段而獲得的pUR 7280質粒。因此pUR 7280質粒含有受黑麴黴awamori變種啟動子和終止子控制的茄病鐮孢前原角質酶基因。
圖10.將構巢麴黴amdS和黑麴黴awamori變種pyrG選擇標記導入pUR 7280中獲得的pUR 7281質粒。
圖11.來自於茄病鐮孢，Colletotrichum capsici，盤長孢狀毛盤孢以及Magnaporthe grisea的角質酶的部分胺基酸序列，表示在3D結構中殘基的位置。
圖12.茄病鐮孢角質酶和角質酶變異體與基於LAS的洗滌劑組合物具相容性。
圖13.茄病鐮孢角質酶和角質酶變異體與基於PAS的洗滌劑組合物具相容性。
圖14.茄病鐮孢角質酶和角質酶變異體與一種強非離子洗滌劑組合物具相容性。
圖15.茄病鐮孢角質酶和角質酶變異體與SDS具相容性。
圖16.茄病鐮孢角質酶和角質酶變異體R17E的洗滌用效果。
參考文獻附於此
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實施例1構建編碼茄病鐮孢前原角質酶的合成基因。
基本上按照EP-A-407225(Unilever)描述的方法構建編碼茄病鐮孢前原角質酶的合成基因。基於公開的茄病鐮孢基因的核苷酸序列(Soliday et al.(1984)和WO-A-90/09446，Plant Genetic Systems)，設計一種全部合成的DNA片段，使之含有編碼茄病鐮孢前原角質酶多肽的一個區域。與原始的茄病鐮孢基因的核苷酸序列相比，該合成的角質酶基因含有幾個核苷酸變化，通過這些變化在該基因的便利位置上導入限制性酶識別位點但並不影響所編碼的胺基酸序列。在圖1D中列出了整個合成角質酶基因的核苷酸序列。
將從合成的DNA寡核苷酸開始將三個分隔的盒裝配在一起而構建成合成的角質酶基因。在各個合成DNA盒的起始點上裝配一個EcoRⅠ位點，並在末端裝配一個HindⅢ位點。使用一個Applied Biosystem 380A，DNA合成儀合成寡核苷酸，並用聚丙烯醯胺凝膠電泳進行純化。為了構建每一個盒，下面概括地描述操作步驟。將構成一個給定盒的等摩爾量(50 pmol)的寡核酸混合，根據標準技術，使其5′末端磷酸化，退火併連接。用EcoRⅠ和HindⅢ切割得到的雙鏈DNA分子的混合物，通過瓊脂糖凝膠電泳按分子大小分級分離，通過電洗脫從凝膠上回收分子。將得到的合成DNA盒與2.7Kb的pUC9的EcoRⅠ-HindⅢ片段相連接並將其轉移至大腸桿菌上。利用合適的寡核苷酸引物從兩個方向對許多克隆中的EcoRⅠ-HindⅢ插入片段全面測序，以驗證合成盒的序列。使用該步驟，構建pUR 7207(含有盒1，圖1A)，pUR7208(含有盒2，圖1B)，以及pUR7209(含有盒3，圖1C)。最後，通過將2.9Kb的pUR7207的EcoRⅠ-ApaⅠ片段與0.2Kb的pUR 7208ApaⅠ-NheⅠ片段以及pUR7209的0.3Kb的NheⅠ-HindⅢ片段結合在一起產生pUR 7210，從而裝配成合成角質酶基因。該質粒含有編碼整個茄病鐮孢的前原角質酶的開放式閱讀框架(圖1D)。
實施例2在大腸桿菌中表達茄病鐮孢(原)角質酶。
構建帶有合成角質酶基因的用在大腸桿菌中表達載體，該載體功能相似於在WO-A-90/09446(Plant Genetic Systems)中描述的載體。設計一種構建體，其中編碼茄病鐮孢原-角質酶的合成基因部分由合適的大腸桿菌表達信號引導，這些信號是(ⅰ)一種誘導型啟動子，(ⅱ)一個核糖體結合位點以及(ⅲ)一種提供一個轉譯起始密碼子並提供使原角質酶穿過細胞質膜輸出所需的信息的信號序列。
設計一種用於將大腸桿菌phoA信號序列衍生物(Michaelis et al.，1983)融合到合成角質酶基因的原序列上的合成接頭(見圖2)。為了最大程度地切割信號肽並分泌原-角質酶，在該接頭的核苷酸序列中，將phoA信號序列的三個C-末端胺基酸殘基(Thr-Lys-Ala)改變為Ala-Asn-Ala以及角質酶原序列的N-末端胺基酸殘基(Leu 1，參見圖1D)改變為Ala。該構建形式可確保角質酶分泌到胞外空間(參見WO-A-90/09446，Plant Genetic Systems)。
為了獲得這樣一種構建體，從pUR 7210上移走含有角質酶前序列和部分原序列的69bp的EcoRⅠ-SpeⅠ片段，並用合成的DNA接頭序列(EcoRⅠ-SpeⅠ片段)替代，該接頭序列提供了大腸桿菌phoA前序列以及經改變的角質酶原序列的N-末端胺基酸殘基的衍生物(圖2)。將得到的質粒命名為pUR 7250，並用於分離0.7Kb BamHⅠ-HindⅢ片段，該片段含有一個核糖體結合位點以及與phoA信號序列編碼區相融合的原角質酶編碼區。將該片段與pMMB67EH(Furste et al.，1986)的8.9Kb BamHⅠ-HindⅢ片段連接，以產生pUR7220。在該質粒中將編碼合成基因的原角質酶融合到phoA信號序列的變化變體上並置於誘導型tac啟動子控制下。
將攜帶pUR7220的大腸桿菌菌株WK6在含有0.5升IXTB培養基(Tartof and Hobbs，1988)的2升搖瓶中培養，該培養基組成如下0.017M KH2PO40.017M K2HPO412克/升 細菌用胰蛋白腖24克/升 細菌用酵母抽提物0.4% 甘油(V/V)在100μg/ml氨苄黴素存在下，25℃-30℃，將培養物進行劇烈振蕩(150rpm)培養過夜，生長到在610nm處的OD值為10-12。加入IPTG(異丙基-β-D-吡喃半乳硫苷)到終濃度為10μm，並繼續培養12-16小時。如果沒有觀察到所產生的脂解活性量進一步顯著增加(通過分析從培養物回收的樣品判斷)，則通過離心而收集細胞並且重懸於原始培養物體積的含20%蔗糖的0℃緩衝液中。通過離心收集細胞，並重懸於原培養物體積的冰水中，以引起滲透休克而導致細胞溶解，通過離心除去細胞碎片，並用乙酸將該無細胞提取物酸化至PH 4.8，置於4℃過夜，並除去得到沉澱。通過超濾在該階段獲得純度高於75%的基本上無內源脂酶的純化角質酶製劑並冷凍乾燥該無細胞提取物。換種方法，通過將酸化的無細胞提取物加樣到SP-Sephadex上，用PH8.0的緩衝液洗脫該酶，將該濃縮的鹼溶液傳遞過適當體積的DEAE-纖維素(Whatman DE-52)並直接將該流過DEAE的溶液加到Q-Sepharose HP(Pharmacia)柱上純化，從而將該角質酶純化到勻質(即純度高於95%)。用鹽梯度洗脫後產生均勻的角質酶製劑，通常該製劑的總產量在75%以上。
實施例3編碼茄病鐮孢角質酶變體的基因的構建。
利用實施例1中描述的編碼茄病鐮孢前原角質酶的合成基因，構建在其編碼的胺基酸序列中有變化的變異體基因。為了完成該構建過程，基本上按照實施例1中描述的相同方法，構建組成整個合成基因的三個盒。例如，使用相同於實施例1描述的寡核苷酸(Oligos)裝配新的盒1變異體，不同之處在於將覆蓋該位點三聯體密碼的兩Oligos進行突變。代替該方法，可用兩個新的Oligos，它們含有突變序列組同樣也與它們取代的原始Oligos相同。
實施例3A利用摻入了CUTⅠ1C ⅠG的變異體(含有替代AGA的GAG)以及CUTⅠ1Ⅰ ⅠG的變異體(含有替代TCT的CTC)以替代CUTⅠ1C ⅠG以及CUTⅠ1 ⅠG(參見圖1A)的盒1變異體構建為茄病鐮孢角質酶變異體R17E編碼的基因。基本上按照實施例1中描述將新盒1克隆和測序，並用含有R17E突變的約120bp的EcoRⅠ/NruⅠ DNA片段與pUR 7210中相應片段進行交換，產生pUR7240(R17E)。用來自該質粒的0.6KbSpeⅠ-HindⅢ片段代替PUR 7220中的相應片段，以產生大腸桿菌表達質粒pUR 7222(R17E)。將該大腸桿菌表達質粒轉化到大腸桿菌WK6菌株中。按實施例2概括的方法培養該轉化體，並基本上按照實施例2的描述回收和純化該變異的原角質酶。同樣用Lys或Leu替代Arg17。
實施例3B利用摻入了CUTⅠ 3F MH變異體(含代替CGG的GAG)，以及CUTⅠ 3M MH變異體(含代替CCG的CTC)以代替CUTⅠ 3F MH和CUTⅠ 3M MH(見圖3A)的盒3變異體構建為茄病鐮孢角質酶變異體R196E編碼的基因，基本上按實施例1中描述的方法將新盒3進行克隆和測序並用R196E突變約120bp EcoRⅠ/Nru Ⅰ DNA片段與pUR 7210中相應片段進行變換產生pUR 7241(R196E)。用該質粒的0.6Kb SpeⅠ-HindⅢ片段代替pUR 7220中的相應片段，產生大腸桿菌表達質粒pUR 7225(R196E)。將該大腸桿菌表達質粒轉化到大腸桿菌WK6菌株上。按實施例2是概括的方法培養轉化體，並基本上按實施例2中描述的方法回收和純化變異的原角質酶。基於相同方法，CCUTⅠ 3F MH變異體(含代替CGG的AAG)以及CUTⅠ 3M MH變異體(含代替CCG的CTT)代替CUTⅠ 3F MH和CUTⅠ 3M MH，從而由Lys(R196K)代替Arg 196。同樣，用CUTⅠ 3F MH變異體(含代替CGG的CTT)以及CUTⅠ 3F MH的變異體(含代替CCG的AAG)代替CUTⅠ 3F MH和CUTⅠ 3M MH，而由Leu(R196L)代替Arg196。基於同樣方法由Ala代替Arg 196(R196A)。
實施例3C用摻入了CUTⅠ1F ⅠG的變異體(含有替代CTC的GCT)以及CUTⅠ1L ⅠG的變異體(含有替代GAG和AGC)以替代CUTⅠ1F ⅠG和CUTⅠ1L ⅠG(參見圖1A)的盒1變異體構建為茄病鐮孢角質酶變異體L51A編碼的基因。基本上按照實施例1中描述將新盒1進行克隆和測序，並用含有L51A突變的約120bp的EcoRⅠ/NruⅠ DNA片段與pUR7210中相應片段進行交換，以產生pUR7242(L51A)。用該質粒的0.6Kb SpeⅠ-HindⅢ片段代替pUR 7220中的相應片段，產。生大腸桿菌表達質粒pUR 7245(L51A)。將該大腸桿菌表達質粒轉化到大腸桿菌WK6菌株。按實施例2概述的方法培養該轉化體，並基本上按實施例2的描述方法回收和純化該變異的原角質酶。同樣用Ser替代Leu 51。
實施例3D利用實施例3A和3B中構建的盒，構建帶有兩個修飾的角質酶變異體。在實施例3A中已經描述了pUR 7240(R17E)的構建過程。在實施例3B中已經描述了含有R196E突變的EagⅠ/HindⅢDNA片段的構建過程。用pUR 7241的ApaⅠ/HindⅢ DNA片段替代pUR 7240(R17E)的ApaⅠ/HindⅢ DNA片段，產生pUR 7243(R17E+R196E)。用該質粒的0.6Kb SpeⅠ-HindⅢ片段替代pUR 7220中的相應片段，產生大腸桿菌表達質粒pUR 7226(R17E+R196E)。用該大腸桿菌表達質粒轉化大腸桿菌WK6菌株。按實施例2概述的方法培養轉化體，並基本上按實施例2描述的方法回收和純化變異原角質酶。
實施例3E用實施例3A和3C中構建的盒，構建帶有兩個修飾的角質酶變體。在實施例3A中已經描述了pUR 7240(R17E)的構建。在實施例3C中已經描述了含有L51A突變的DNA片段的構建。用pUR 7242的BclⅠ/ApaⅠ片段與pUR 7240的相應片段進行交換，以產生pUR 7244(R17E+L51A)。用該質粒的0.6Kb SpeⅠ-HindⅢ片段替代pUR 7220中的相應片段，產生大腸桿菌表達質粒pUR 7246(R17E+L51A)。用該大腸桿菌表達質粒轉化大腸桿菌WK6菌株。按實施例2概述的方法培養轉化體，並基本上按實施例2描述的方法回收和純化變異原角質酶。
實施例4在啤酒酵母中表達茄病鐮孢角質酶為了在啤酒酵母中表達合成的茄病鐮孢角質酶基因，構建一個表達載體，其中把啤酒酵母轉化酶前序列(Taussig and Carlsson，1983)和誘導型gal 7強啟動子(Nogi and Fukasawa，1983)置於編碼成熟角質酶的合成基因前面。為了製備該融合體的合成角質酶基因，合成一個銜接頭片段，其中將轉化酶前序列的編碼序列融合到編碼成熟角質酶的N-末端的序列上。基本上按實施例1中描述的方法(盒8，見圖3)，將該片段裝配作為pUC9中的EcoRⅠ-HindⅢ盒，產生pUR 7217。將pUR 7210和pUR 7217質粒轉化大腸桿菌JM 110(該菌株喪失了dam甲基化酶活性)，並將pUR 7217的2.8Kb BclⅠ-HindⅢ片段與pUR 7210的0.6Kb的BclⅠ-HindⅢ片段連接。產生pUR 7218，其中將為成熟角質酶多肽的核苷酸序列與啤酒酵母轉化酶前序列的編碼區部分融合。
通過分離pUR 2740中的8.9Kb NruⅠ-SalⅠ片段，用Klenow多聚酶填充SalⅠ伸出末端，以及使片段重新形成環狀而從pUR 2740(Verba kel，1991，見圖6)衍生出表達載體pUR 2741(見圖4)。將pUR 2741的7.3Kb SacⅠ-HindⅢ片段與pUR 7218的0.7Kb SacⅠ-HindⅢ片段相連接，產生pUR 7219(參見圖5)。或者還可使用，將啤酒酵母pol.Ⅱ終止子置於角質酶基因後面的HindⅢ位點，該終止子不是角質酶基因有效表達所必需的。大腸桿菌-啤酒酵母穿梭質粒pUR 7219含有在含有2μ質粒的啤酒酵母菌株(Cir+菌株)起作用的複製源點，一種便於在啤酒酒酵母Leu 2-菌株中選擇高拷貝數轉化體的啤酒酵母Leu 2基因的啟動子缺陷型變體，以及編碼茄病鐮孢角質酶的成熟部分的合成基因，該基因已通過操作後連接到受誘導型啤酒酵母gal 7強啟動子調節的啤酒酵母轉化酶前序列上。
根據電擊穿酵母細胞的標準方案，將相同於YT6-2-1L菌株(Erhart and Hollenberg，1981)的啤酒酵母SU 50菌株(a，Cir°，Leu 2，his4，can1)與2μ啤酒酵母質粒與pUR 7219的等摩爾混合物共轉化。選擇亮氨酸原養型轉化體，從許多個轉化體中分離總DNA。所有轉化子表現出含有2μ質粒以及pUR 7219，舉例如下，當以高拷貝數存在百，由於自發地產生2μ酵母質粒，因而pUR 7219中含有的Leu 2基因的啟動子缺陷型變異體僅能在功能上與Leu 2缺陷型菌株互補。通過在完全培養基上培養40代以上，然後影印至選擇性的完全固體培養基上平板培養，產生啤酒酵母菌株SU51(a，Cir+，Leu2，his4，can1)，從而使一種轉化體中的pUR 7219質粒穩定。
在含有0.2升基本培養基的1升搖瓶中培養含有pUR 7219的啤酒酵母SU 51菌株，該培養基含有無胺基酸的酵母氮劑 6.7g/l組氨酸 20mg/l-葡萄糖 20g/l在劇烈振蕩(150rpm)，30℃的條件下，將培養物培養過夜生長至610nm處OD值為2-4。通過離心收集細胞，並重懸於2升搖瓶中的1升YPGAL培養基中，該培養基含有
-酵母抽提物 10克/升-細菌用蛋白腖 20克/升-半乳糖 50克/升並繼續培養12-16小時。在有規律的時間間隔點，從培養物中回收樣品，離心移走生物質。利用橄欖油作底物，進行滴定分析以分析上清液中的角質酶活性。對於每一個樣品，將100至200μl之間的濾液加到5.0ml的脂酶底物(Sigma，含有作為脂酶底物的橄欖油)以及25.0ml的緩衝液(5mM Tris-HCl PH9.0，40mM NaCl，20mM CaCl2)的振蕩混合物中。上述滴定，分析是在30℃完成的，用Mettler DL25滴定儀用0.05M NaOH自動滴定至PH9.0而測定脂肪酸的釋放。獲得一條滴定劑量相對時間的曲線。從該曲線的最大斜率計算出樣品中含有的脂酶活性的量。1個脂酶活性單位的定義是在上面限定的條件下在1分鐘內使橄欖油釋入出1μmol脂肪酸所需的酶的量。上述測定方法是本領域內技術人員已知的。
當產生的角質酶活性不再增加時，可通過離心移走細胞，並用乙酸將無細胞提取物酸化至PH4.8，按實施例1所述回收角質酶。
實施例5在啤酒酵母中表達茄病鐮孢角質酶變異體用pUR7241(R196E)的0.5Kb ApaⅠ-HindⅢ片段替代pUR7218的類似片段，產生pUR7229(R196E)，其中編碼突變的基因可操作地融合到啤酒酵母信號序列的編碼序列上。將pUR 2741的7.0Kb SacⅠ-HindⅢ片段與pUR 7229(R196E)的0.7Kb SacⅠ-HindⅢ片段相連接，產生pUR 7235(R196E)。用該質粒轉化啤酒酵母SU51菌株。按實施例4中描述培養得到的轉化體，按實施例4和1描述從培養液中回收產生的變異酶。
實施例6在麴黴中表達茄病鐮孢角質酶為了在黑麴黴awamori變種中表達合成的茄病鐮孢角質酶基因，構建一個表達載體，其中將編碼茄病鐮孢前原角質酶的合成基因置於黑麴黴awamori變種的誘導型exl A強啟動子(Maat et al.，1992 de Graaff et al.，1992)控制下。
從pAW 14B質粒開始構建前原角質酶表達質粒(pUR 7280)，於1990年5月31日，由大腸桿菌JM 109菌株攜帶該質粒，一起寄存於Centraalbureau voor Schimmelcultures，Baarn，The Netherlands，N°CBS 237.90，並且該質粒含有一個約5.3Kb SalⅠ片段，在該片段上定位了0.7Kb內切木聚糖酶Ⅱ(exl A)基因，以及2.5Kb的5′側端序列和2.0Kb的3′一側端序列(圖8)。在pAW 14B中由前原角質酶編碼區替代了exl A編碼區。含有exl A基因的第一個密碼子(ATG)的Bsp HⅠ位點(5′-TCATGA-3′)以及含有exlA基因的終止密碼子(TAA)的AF 1Ⅱ位點(5′-CTTAAG-3′)有利於構建pUR 7280。
按如下所述進行構建用Bsp HⅠ部分切割pAW 14B(7.9Kb)，並以瓊脂糖凝膠上分離線性化的質粒(7.9Kb)隨後用BsmⅠ切割分離到的7.9Kb片段，該酶能切割處於所BspHⅠ位點下遊的幾個核苷酸，從而移走另一BspHⅠ位點處的線性化質粒。在瓊脂糖凝膠上分離這些片段，分離出7.9Kb BspHⅠ-BsmⅠ片段。用AflⅡ部分切割該片段，分離得到的7.2Kb的BspHⅠ-AflⅡ片段。
將含有編碼茄病鐮孢前角質酶的整個開放閱讀框架的pUR 7210的0.7Kb BspHⅠ-AflⅡ片段與pAW 14B的7.2Kb BspHⅠ-AflⅡ片段相連接，產生pUR 7280。隨後採常規的共轉化技術將構建的載體(pUR 7280)轉移到黴菌(例如黑麴黴，黑麴黴awamori變種等)中，通過誘導內切木聚糖酶Ⅱ啟動子而使前原角質酶基因表達。還可以提供帶常規選擇性標記(例如amdS或pyrG，潮黴素等)的構建型重組DNA載體。用得到的重組DNA載體轉化黴菌以產生所需的蛋白質。作為一個例子，在表達載體中導入amd S和pyr G選擇標記，以產生pUR 7281(圖10)。為了達到上述目的，通過用一個合成的寡核苷酸(5′-AATTGCGGCCGC-3′)將EcoRⅠ位點(存在於前原角質酶基因ATG密碼子上遊的1.2Kb)轉變為NotⅠ位點，產生pUR 7282，而產生了一個NotⅠ位點。在含有整個構巢麴黴amd S基因，黑麴黴awamori變種pyr G基因以及它們各自的啟動子和終止子的合適DNA片段上裝配側端NotⅠ位點，並導入到pUR 7282的Not Ⅰ位點，產生pUR 7281(圖10)。
在黑麴黴awamori變種內表達合成的茄病鐮孢角質酶基因的另一種可選擇方法是，構建一個表達載體，其中在編碼成熟角質酶的合成基因前並不加上其自身的前原序列而是加是黑麴黴awamori變種exlA的前序列。
為了製備上述融合體的合成角質酶基因，合成幾個銜接片段，其中以不同方式將exlA前序列的編碼序列連接到編碼成熟角質酶N-末端的序列上。在盒5中，這種連接是通過將exlA前序列與角質酶的原序列相融合而完成的。在盒6中，將exlA前序列與成熟角質酶的N-末端相融合。盒7與盒6相同，但其中為了更好地適合切除信號肽的要求，將所編碼的成熟角質酶多肽的N-末端殘基從原始的甘氨酸轉變為絲氨酸殘基。基本上按實施例1中描述從合成的寡核苷酸裝配盒5，6和7(參見圖7)。用盒5替代pUR 7210中的0.1Kb EcoRⅠ-SpeⅠ片段，產生pUR 7287。分別用盒6和7替代pUR 7210中的0.1Kb EcoRⅠ-BclⅠ片段，以產生pUR 7288和pUR 7289。對於質粒pUR 7287，pUR 7288以及pUR7289中每一個，將0.7Kb的BspHⅠ-AflⅡ片段與pAW 14B的7.2Kb BspHⅠ-AflⅡ片段相連接，分別產生pUR7290，pUR7291以及pUR7292。
隨後採用常規共轉化技術將構建的重組DNA載體轉移至黴菌(黑麴黴，黑麴黴awamori變種)，通過誘導內切木聚糖酶Ⅱ啟動子表達前-(原)-角質酶基因。還可以給構建的重組DNA載體提供常規選擇標記(例如，amd S或pyr G，潮黴素)，如在實施例中描述的用於pUR7280(見上文)的方法，將得到的重組DNA載體轉化黴菌，以產生所需的蛋白質。
在下列條件下培養用表達載體pUR7280，pUR7281，pUR7290，pUR7291，pUR7282(含有帶有或沒有相應原序列以及角質酶信號序列或受黑麴黴awamori變種exlA啟動子和終止子控制的exlA信號序列的茄病鐮孢成熟角質酶編碼區)中任一種轉化的黑麴黴菌株用孢子接種多個含400ml合成培養基(PH6.5)的1升搖瓶(終濃度為10E6/ml)。該培養基有下列組份(AW培養基)蔗糖 10克/升NaNO36.0克/升KCl 0.52克/升KH2PO41.52克/升MgSO4·7H2O 0.49克/升酵母抽提物 1.0克/升ZnSO4·7H2O 22mg/升H3BO311mg/升MnCl2·H2O 5mg/升FeSO4·7H2O 5mg/升CaCl·6H2O 1.7mg/升CaSO4·5H2O 1.6mg/升NaH2MoO4·2H2O 1.5mg/升Na2EDTA 50mg/升在MK X培養搖床上30℃以200rpm轉速培養24小時，在生長後通過過濾(0.45μm濾器)收集細胞，用無蔗糖和酵母抽提物(鹽液)的AW培養基洗二次，重懸於50ml鹽溶液中，並轉移至含有50ml鹽溶液的300ml搖瓶中，該鹽溶液中加入了終濃度為10克/升的木聚糖(誘導培養基)。在與上面所述相同條件下繼續培養過夜。用miracloth過濾得到的培養物以除去生物質，基本上按上面實施例2描述方法回收角質酶。
實施例7在麴黴中表達茄病鐮孢角質酶變異體基本上按照實施例6中提及的途經，但現在用質粒pUR 7240(R17E)或pUR 7241(R196E)或pUR7242(L51A)代替pUR7210，用於構建真菌表達載體，在黑麴黴awamori變種內製備含有上述提到突變的茄病鐮孢角質酶變異體。
實施例8鑑定和分離與茄病鐮孢角質酶基因相關的基因從不同真菌中分離與茄病鐮孢角質酶有不同程度同源性的角質酶的編碼基因。在含有200ml培養基的500ml搖瓶中培養真菌培養物，該培養基是在Hankin和Kolattukudy(1968)描述的培養基中添加了0.25%葡萄糖，並在MKX培養搖床(100rpm)上28℃培養4天。在此時，消耗葡萄糖並加入基本上由Ettinger等人(1987)描述的角質素水解液而誘導角質酶產生。根據標準技術(參見實施例4)，以有規律的時間間隔從培養液中回收樣品並分析脂解酶活性的存在。正常情況，在誘導後約2天就顯示有脂解活性，並在那時利用標準技術通過過濾收集細胞。根據標準技術，洗滌菌絲體，冷凍於液氮中並凍幹。基本上按照Sambrook et al.(1989)的描述，利用硫氰酸胍法分離細胞的總RNA製劑，並採用氯化銫密度梯度離心進行純化。利用多聚AT系統mRNA分離藥盒(Promga)分離多A(+)mRNA部分。根據標準技術，用茄病鐮孢角質酶基因的cDNA片段作為探針將多A(+)mRNA部分進行Northern雜交分析，以驗證角質酶相關基因的表達。根據供應商的說明，用一個ZAP cDNA合成藥盒(Stratagene，La Jolla)將含有能與探針雜交的物質的mRNA製劑用於合成cDNA，產生cDNA片段，該片段帶有側端為多聚A區域的Xho Ⅰ粘性末端以及在另一末端為一個EcoRⅠ接頭。通過以有意義方向將得到的cDNA片段直接克隆到λZAPⅡ載體(Stratagene，La Jolla)中，並允許表達β-半乳糖苷酶融合蛋白(Huse et al.，1988)，而構建到了表達文庫。利用針對茄病鐮孢角質酶的抗血清篩選這些文庫。
另一種可選擇方法是，用角質酶特異性引物(見表2)，將合成的cDNA部分進行PCR篩選。這些引物是從將幾個真菌角質酶基因的胺基酸序列(ettinger et al.，1987)相比較得到的。對於每一套引物，都使用最佳的PCR反應條件，並用茄病鐮孢角質酶的cDNA作為對照。對於(合成的)即些cDNA製劑，由他們產生的一個特定PCR片段其長度相似於(或大於)在同樣條件下用茄病鐮孢角質酶的cDNA產生的PCR片段的長度，通過凝膠電泳純化該PCR片段並從該凝膠上分離該片段。
另一種可選擇方法是，利用角質酶特異性引物的PCR篩選技術也可以直接應用到一些真菌菌株的基因組DNA，用茄病鐮孢的基因組DNA作為陽性對照。對於這些真菌基因組DNA製劑。用它們製備的一個特異性PCR片段具有相似於(或大於)在同樣條件用來自茄病鐮孢角質酶的cDNA製備的PCR片段的長度，通過凝膠電泳純化該PCR片段並從該凝膠上分離該片段。
對於在表達文庫方法或PCR篩選方法(用cDNA或基因組DNA)中評為陽性的菌株以及許多其他菌株，分離到了高分子量基因組DNA。菌株的培養基本上按照Ettinger等人(1987)的描述進行。基因組DNA的分離按照de Graaff等人(1988)描述進行。用各種不同的限制性酶消化基因組DNA，並利用類似的cDNA插入片段(在表達文庫方法中)或PCR片段(PCR篩選方法)或茄病鐮孢角質酶基因(其他菌株)作為探針進行Southern雜交分析，並繪製該角質酶基因的物理圖譜。通過凝膠電泳適當消化的基因組DNA按大小分級分離並從凝膠上分離合適大小的片段，亞克隆到pUC19中。用相應的cDNA插入片段(表達文庫方法)或PCR片段(PCR篩選方法)篩選這些基因組文庫，產生含有角質酶基因的基因組拷貝的克隆。以兩個方向對該基因進行測序。通過分析相應cDNA的序列或通過其他角質酶序列(Ettinger et al.，1987)比較可鑑別內含子。也可以從這種比較中推導出成熟角質酶多肽的N-末端。利用標準的PCR技術。移走內含子。通過遺傳操作法將開放式閱讀框架的下遊緊接一個HindⅢ位點，將啤酒酵母轉化酶基因的原序列的編碼序列(其前為Sac Ⅰ位點，與盒8對照，圖3)融合到編碼成熟角質酶的N-末端的序列上。將得到的SacⅠ-HindⅢ片段與pUR7241的7.3Kb Sac Ⅰ-HindⅢ片段(圖4)相連接並轉化至啤酒酵母SU51菌株，其中的Sac Ⅰ-HindⅢ片段含有可操作地連接到編碼啤酒酵母轉化酶前序列的序列上的角質酶基因。基本上按照實施例4描述，表達真菌角質酶以及從培養液中回收該酶。
實施例9茄病鐮孢角質酶變異體R17E，R196E和R17E+R196E與各種陰離子表面活性劑的相容性按如下所述檢測茄病鐮孢角質以及茄病鐮孢角質酶變異體R17E，R196E和R17E+R196E與各種陰離子表面活性劑的相容性，製備含酶的各種洗滌劑產品溶液。將溶液在40℃保溫，並間隔地取樣。然後按照實施例4描述的方法測定酶活性。使用下列的洗滌產品A-C產品A
產品B
產品C
組合物A-C的結果列於圖12-14中。從該結果看出，尤其是在富含陰離子的組合物A中，角質酶變異體比野生型茄病鐮孢角質酶更穩定。
實施例10茄病鐮孢角質酶變異體R196K和R196L與十二烷基硫酸鈉的相容性按如下所述檢測茄病鐮孢角質酶以及茄病鐮孢角質酶變異體R196K和R196L與十二烷基硫酸鈉(SDS)的相容性。在0°FH製備0.4mMSDS和10mM Tris中的酶溶液。將該溶液在40℃保溫並間隔地取樣，按實施例4描述的方法測定殘留的酶活性。結果顯示於圖15中。可以看出兩種角質酶變異體比野生型茄病鐮孢角質酶更能穩定地與陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)相容。
實施例11檢測茄病鐮孢角質酶變異體R17E的洗滌活性用純化的橄欖油將由機織聚酯/棉花製成的檢測布弄髒。然後在100ml聚乙烯瓶的30ml洗液中保溫每塊檢測布。在裝有水的Miele TMT洗衣機中，用正常的40℃洗滌主程序振蕩這些瓶子。該洗滌由每升中2克實施例9的洗衣粉A和B(在27°FH)組成。
結果顯示於圖16中。已證明，在各種洗滌條件下相對於野生型茄病鐮孢角質酶而言，角質酶變異體R17E的洗滌功能(除去油性汙漬)有提高。為了比較，用Lipolase(TM)也進行相同實驗。在所有條件下，角質酶變異體R17E都有優勢。
權利要求
1.一種親本角質酶的角質酶變異體，已將其胺基酸序列以提高與陰離子表面活性劑的相容性的方式進行改變。
2.根據權利要求1的角質酶變異體，其中通過降低陰離子表面活性劑與酶的結合力而提高其與陰離子表面活性劑的相容性。
3.根據前面的任何一項權利要求所述的角質酶變異體，其中通過降低陰離子表面活性劑與酶之間的靜電作用而提高其與陰離子表面活性劑的相容性。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的角質酶變異體。其中通過用賴氨酸殘基替代一個或多個帶正電的精氨酸殘基而降低陰離子表面活性劑與酶之間的靜電作用，其中的精氨酸的定位接近於能結合陰離子表面活性劑的非極性尾的疏水片。
5.根據權利要求1-3中任一項所述的角質酶變異體。其中通過用未帶電荷的胺基酸殘基替代一個或多個帶陽性電荷的精氨酸殘基而降低陰離子表面活性劑與酶之間的靜電作用，其中的精氨酸的位置接近於能結合陰離子表面活性劑的非極性尾的疏水片。
6.根據權利要求1-3中任一項所述的角質酶變異體。其中通過用帶負電荷的胺基酸殘基替代一個或多個帶正電荷的精氨酸殘基而降低陰離子表面活性劑與酶之間的靜電作用，其中精氨酸的位置接近於能結合陰離子表面活性劑的非極性尾的疏水片。
7.根據權利要求1-3中任一項所述的角質酶變異體。其中通過用疏水性小的胺基酸殘基替代一個或多個的胺基酸殘基而降低陰離子表面活性劑與酶的結合，其中胺基酸定位於能結合陰離子表面活性的非極性尾的疏水片上。
8.根據權利要求7所述的角質酶變異體。其中的疏水性小的胺基酸殘基選自於由甘氨酸，絲氨酸，丙氨酸，天冬氨酸和蘇氨酸組成的組中。
9.根據前面的權利要求任一項所述的角質酶變異體。其中親本角質酶是一種真核角質酶。
10.根據前面的權利要求任一項所述的角質酶變異體，其中親本酶是一種與針對茄病鐮孢的角質酶抗體發生免疫交叉反應的角質酶。
11.根據前面的權利要求任一項所述的角質酶變異體，它是由與編碼茄病鐮孢，Colletrichum capsici，盤長孢狀毛盤孢，Magnaporthe grisea的角質酶的編碼基因的5′和/或3′-末端以及/或與角質酶的保守序列有巨大同源的基因編碼的。
12.根據前面的權利要求任一項所述的角質酶變異體，修飾的殘基定位於茄病鐮孢角質酶的胺基酸序列，或不同角質酶相應胺基酸的一個或多個下列位點上17，51，78，80，88，96，156，195，和196。
13.根據前面的權利要求任一項所述的角質酶變異體，修飾的殘基定位於茄病鐮孢角質酶的胺基酸51和195周圍，或不同角質酶的相應胺基酸周圍的疏水片上。
14.根據前面的權利要求任一項所述的角質酶變異體，它是Magnoporthe grisiea角質酶的變異體，並且含有一個或多個下列突變A80D，A88E，R156L。
15.製備前面任一項所述的角質酶變異體的方法，包括下列步驟發酵培養含有由重組DNA技術製備的基因的一種重組DNA修飾的微生物，其中的基因編碼角質酶變異體，以及通過從發酵液中分離由該微生物產生的角質酶變異體，或通過從發酵液中分離微生物細胞，破碎分離的細胞，並且採用物理或化學濃縮和純化方法從所說發酵液或從所說細胞中濃縮或部分純化出角質酶，從而製備角質酶變異體製劑。
16.一種重組DNA修飾的微生物，該微生物已由攜帶編碼權利要求1-14中任一項的角質酶變異體的基因的一個重組DNA載體轉化，從而該微生物能表達所說的角質酶變異體。
17.根據權利要求16所述的重組DNA修飾的微生物，它攜帶的角質酶變異體編碼基因是通過在其5′-末端與一個基因片段融合而導入到所述微生物，所述基因片段編碼具有作為宿主微生物的信號或分泌序列功能的一個(改進的)前序列。
18.根據權利要求16或17所述的重組DNA修飾的微生物，其中宿主微生物是一種真核生物，例如酵母屬或克魯維氏酵母屬或漢遜氏酵母，或麴黴屬的真菌。
19.根據權利要求16-18所述的重組DNA修飾的微生物，包攜帶有為權利要求1-14任一項的角質酶變異體編碼的重組DNA載體，所說微生物是通過將其一種祖先細胞中營養缺陷型標記的編碼基因進行替代而製備的一個自養型突變體。
20.一種多核苷核酸，它具有為權利要求1-14任一項的成熟角質酶變異體或一種功能等同物或其突變異體編碼的鹼基序列，其中聚核苷酸的最後轉譯密碼子後跟隨一個終止密碼子，或者還具有為緊接著在成熟酶的核苷酸序列的上遊的該角質酶的前序列的核苷酸編碼序列。
21.一種具有為權利要求1-14中任一項所說的角質酶變異體編碼的鹼基序列的多核苷酸，其中多核苷酸的最後轉譯密碼子後面跟隨一個終止密碼並且該多核苷酸在其編碼成熟酶的核苷酸序列的上遊選擇性地緊接一個為至少部分相應前序列，和/或適應於選定的宿主有機體的信號或分泌序列編碼的一個核苷酸序列。
22.一種具有為權利要求1-14中任一項所述的成熟角質酶變異體編碼的一種多核苷酸或一種功能等同物或其突變體，其中已以某種方式對來源生物源的角質酶變異體的核苷酸編碼序列進行了改進，該方式是至少使一個密碼子並且優選的是儘可能多的密碼子遭受「靜止」突變以形成為等同的胺基酸殘基編碼的密碼子，並且是在權利要求16-19中限定的新宿主優選的密碼子，從而在上述宿主細胞內提供了具有改進的穩定性的所導入基因的信使RNA。
23.根據權利要求20-22任一項所說的多核苷酸，其中在編碼原或成熟角質酶變異體的核苷酸的上遊定位了一個核苷酸序列，該序列編碼適合於權利要求16-19中任一項限定的宿主的信號或分泌序列。
24.一種能指導編碼角質酶變體基因的核苷酸序列表達的重組DNA載體，它包括下列成分a)為成熟角質酶變異體或前角質酶或一種相應的角質酶(其中至少將緊接分泌信號(對於選定的宿主細胞是優選的)下遊的部分前序列移走)編碼的雙鏈(ds)DNA，如果應轉譯的基因部分沒有以ATG作為起始密碼子，則在該基因前面加一個ATG密碼子，並且要轉譯的基因部分以合適的終止密碼子終止或已加上了這樣一個終止密碼子。b)一種定位於編碼角質酶變異體的ds DNA(成分(a))的正鏈的上遊的表達調節子(適合於選定的宿主微生物);c)一種定位編碼角質酶變體的ds DNA(成分(a))的正鏈的下遊的終止序列(適合於選定的宿主微生物);d1)一種促進該ds DNA整合到選定的宿主的基因組中核苷酸序列或，d2)一種適合於選定的宿主的複製源點;e1)選擇性地含的一種(營養缺陷型)選擇標記;e2)選擇性地含有一個為與選定的宿主中角質酶變異體的前體形式之一的成熟和/或分泌有關的蛋白質編碼的ds DNA序列。
25.根據權利要求24所述的重組DNA載體，在前面定義的多核苷酸的上遊和/或下遊進一步有促進角質酶功能性表達的序列。
26.根據權利要求24-25任一項所述的重組DNA載體，它攜帶由營養缺陷型標記的編碼區和一個缺陷型啟動區組成的營養缺陷型標記。
27.一種加酶洗滌劑組合物，含有權利要求1至14中任一項所述的角質酶變異體。
全文摘要
本發明提供了一種親本角質酶的角質酶變異體，該變異體的胺基酸序列已以提高其與陰離子表面活性劑的方式進行改變。具體講，通過減少陰離子表面活性劑與酶的結合而提高與陰離子表面活性劑的相容性。
文檔編號C12R1/865GK1090329SQ93121760
公開日1994年8月3日 申請日期1993年12月23日 優先權日1992年12月23日
發明者M·R·艾格蒙德, H·T·W·M·范德希登, W·穆斯特斯, H·彼得斯, C·T·韋裡斯, J·迪弗力格 申請人:尤尼利弗公司