抑制igf－i和－ii和gh－rh拮抗性相似物的製作方法

2023-05-24 23:38:26

專利名稱：抑制igf－i和－ii和gh－rh拮抗性相似物的製作方法
技術領域：
本發明的完成部分地獲得來自老兵事務局醫學研究部的政府資助。政府對本申請具有某些權利。
本發明是關於抑制哺乳動物垂體釋放生長激素的新型合成肽，以及含有這種新型肽的治療組合物。
背景技術：
生長激素(「GH」)是一種具有191個胺基酸的肽，它刺激產生多種不同的生長因子例如胰島素樣生長因子I(IGF-I)，並因此促進多種組織(骨骼、結締組織、肌肉和內臟)生長，以及引起一些生理活性(促進核酸和蛋白質合成及脂解，但降低尿素分泌)。
GH的釋放受下丘腦分泌的釋放和抑制因子的控制。主要的釋放因子是生長激素釋放激素(「GH-RH」)，人生長激素-釋放激素(「hGH-RH」)是一種具有44個胺基酸的肽。本發明的新型肽涉及僅具有殘基1至29的hGH-RH(「hGH-RH(1-29)NH2」)的相似物，即具有如下胺基酸序列的肽相似物Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile5-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys-Val-Leu-Gly15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp25-Ile-Met-Ser-Arg29-NH2已發現GH與幾種疾病有關。一種涉及GH的疾病是肢端巨大症，是由於存在過量水平的GH。通過給予GH-RH拮抗劑可治療這種疾病中表面和肢端骨的異常增長。
另一類涉及GH的疾病是糖尿病性視網膜病和糖尿病性腎病。認為這類疾病中分別由GH引起的視網膜和腎的損傷可導致失明或腎功能障礙。通過給予有效的GH-RH拮抗劑可阻止或延緩這種損傷。
但是，GH-RH拮抗劑的主要應用是在癌症領域(A.V.Schally等，生長激素促分泌素的臨床應用。Bercu，B.B和Walker，R.F編著，Dekker，New York，pp 145-162，1998)。對於各種癌症，IGF-I和-II是強有力的促細胞分裂劑。通過抑制GH分泌，GH-RH拮抗劑可降低IGF-I在肝和其它組織中的合成。GH-RH拮抗劑還降低各種腫瘤自體分泌和旁路分泌產生IGF-I和/或IGF-II。對於幾種實驗性癌症，用GH-RH拮抗劑治療可導致IGF-I和-II減少，伴隨著對腫瘤生長的抑制。
在治療這類疾病和其它一些狀態的努力中，某些研究者試圖通過使用一種GH釋放抑制劑，生長激素釋放抑制因子來控制GH的水平。但是如果單獨給予生長激素釋放抑制因子，不能將GH或IGF-I抑制到所希望的程度。如果與GH-RH拮抗劑合併給藥，生長激素釋放抑制因子將更好地改善對IGF-I水平的抑制作用。
為了闡明GH-RH的結構與其活性的關係，科研工作者研究了GH-RH的各種修飾，致力於提供具有改進的激動劑或拮抗劑特性的人工合成同類物。因此早已確定，含有殘基1-29的GH-RH片段，或GH-RH(1-29)是生物活性所必需的最小序列。此片段保留了天然GH-RH的50％或更多的效力。
第一個被描述的GH-RH拮抗劑[Ac-Tyr1，D-Arg2]hGH-RH(1-29)NH2，在文獻中通常被稱為「標準拮抗劑」，已發現它可阻止hGH-RH(1-29)NH2對大鼠垂體前葉腺苷酸環化酶的激活作用。這種肽在垂體和下丘腦中可阻斷GH-RH對其受體的作用，並且抑制生長激素的脈動式分泌。
在已發表的文獻中有相當數量的專利和論文公開了一些GH-RH相似物，它們或者具有GH-RH激動劑的作用(即刺激GH釋放的作用)，或者具有GH-RH拮抗劑的作用(即抑制GH釋放的作用)。這些肽的大多數都來源於GH-RH(1-29)肽序列，並具有增強它們激動劑或拮抗劑特性的特定結構修飾。
例如美國專利4,659,693公開了一些GH-RH拮抗劑相似物，它們在其GH-RH(1-29)序列的位置2含有某些N，N′-二烷基-ω-胍基α-氨醯基殘基。
已公開的專利申請WO91/16923回顧了通過修飾其胺基酸序列來改變hGH-RH二級結構的早期嘗試。這些早期嘗試包括以它們的D-異構體取代Tyr1，Ala2，Asp3或Asn8；以L-或D-Ser，D-Arg，Asn，Thr，Gln或D-Lys取代Asn8；以Ala取代Ser9以便增強此區域的兩親性；以及以Ala或Aib取代Gly15。據說當此相似物中的R2是D-Arg，以及按上面的提示取代R8，R9和R15，可導致形成拮抗劑活性。據說這些拮抗性肽適合於作為藥物組合物給藥，用於治療與GH過度水平有關的疾病狀態如肢端巨大症。
美國專利5,084,555中hGH-RH相似物「[Ser9-ψ[CH2-NH]-Tyr10]hGH-RH(1-29)的拮抗劑活性據說是由於R9和R10殘基之間偽肽鍵(即被還原成[CH2-NH]鍵的肽鍵)的結果。但是，據說[Ser9-ψ[CH2-NH]-Tyr10]hGH-RH(1-29)的拮抗劑特性不如標準拮抗劑[N-Ac-Tyr1，D-Arg2]GH-RH(1-29)-NH2。
被轉讓給與本專利申請相同受讓人的美國專利5,550,212和美國專利申請08/642,472公開了幾種hGH-RH(1-29)NH2的相似物，它們具有增強的拮抗劑特性和延長的作用期。據認為這些特性是由於在GH-RH(1-29)NH2的N-末端以芳香酸或非極性酸取代多個胺基酸並醯基化的結果。應注意的是，在上述美國專利和美國專利申請中，R9通常是Ser，R16是Gln或形成內醯胺橋的胺基酸(即Glu)，R28是Ser，Asn，Asp，Ala或Abu，以及R29是Agm，Arg-NH2，Arg-OH，Cit-NH2，Cit-OH，Har-NH2，Har-OH，或形成內醯胺橋的胺基酸(即Lys或Orn)。
發明概述在此提供了一系列hGH-RH(1-29)NH2的新型合成相似物。這些相似物可抑制內源性hGH-RH的活性，因此可阻止生長激素的釋放。同以前所描述的相似物比較，此新型相似物較強的抑制能力是由於對多個胺基酸取代的結果。
具體地說，本發明是關於包含如下結構式的肽及其可藥用的鹽X-R1-R2-Asp-Ala-R5-R6-Thr-R8-R9-R10-Arg-R12-R13-R14-R15-R16-Leu-R18-R19-Arg-R21-R22-Leu-Gln-Asp-Ile-R27-R28-R29-NH2其中X是PhAc，IndAc，Ibu，Nac，1-或2-NPr，或者Fpr，R1是Tyr或His，R2是D-Arg或D-Cit，
R5是Ile或Val，R6是Phe，Nal或Phe(Y)，在此Y＝F，Cl，Br，R8是Asn，Gln，Ser，Thr，Ala，D-Asn，D-Gln，D-Ser，D-Thr，Abu，D-Abu，或Aib，R9是Arg，Har，Lys，Orn，D-Arg，D-Har，D-Lys，D-Orn，Cit，Nle，Tyr(Me)，Ser，Ala或Aib，R10是Tyr或Phe(Y)，在此Y＝H、F、Cl、Br，或OCH3，R12是Lys，D-Lys，或Orn，R13是Val或Nle，R14是Leu或Nle，R15是Gly，Ala，Abu，Nle或Gln，R16是Gln或Arg，R18是Ser或Nle，R19是Ala或Abu，R21是Lys或Orn，R22是Leu，Ala或Aib，R27是Met，Leu，Nle，Abu，或D-Arg，R28是Arg，D-Arg，Ser，Asn，Asp，Ala或Abu，R29是Arg，D-Arg，Har或D-Har。
此肽在優選的實施方案中，其中X是PhAc，IndAc或Nac，R1是Tyr或His，R2是D-Arg，R5是Ile，R6是Phe(pCl)，R8是Asn或Abu，R9是Arg或Har，Lys，Orn，D-Arg，D-Har，D-Lys，D-Orn，Cit，Nle或Tyr(Me)，R10是Tyr或Tyr(Me)，R12是Lys，R13是Val或Nle，R14是Leu或Nle，R15是Abu，Ala或Nle，R16是Gln或Arg，R18是Ser或Nle，R19是Ala或Abu，R21是Lys，R27是Nle或D-Arg，R28是D-Arg，Arg或Ser，R29是D-Arg，Har或D-Har。
要指出的是，天然GH-RH分子中的胺基酸殘基30-44看來對活性不是必不可少的，它們的具體種類也不是關鍵的。因此，看來對本發明hGH-RH(1-29)-NH2相似物的C-末端加入另外這些胺基酸殘基的某些或全部將不會影響這些相似物作為GH-RH拮抗劑的效力。如果要對此hGH-RH(1-29)-NH2相似物的C-末端加入這些胺基酸的某些或全部，則所加入的胺基酸殘基可以是與天然hGH-RH序列中殘基30-44相同的殘基，或者是適當的相等物。合成方法可通過適當的方法獲得合成肽，例如完全的固相技術，部分的固相技術，片段縮合法或經典的液相合成法。
當藉助於固相法合成本發明的相似物，先以適當的方法將其C-末端殘基(在此是R29)連接(錨定)於一種惰性支持物(樹脂)，此殘基同時支承著其α-氨基(在適當的情況下是其側鏈功能基)的保護基。完成此步驟之後，從被錨定的胺基酸殘基除去α-氨基保護基，並加入其α-氨基(以及任何適當的側鏈功能基)已被適當保護的下一個胺基酸殘基R28，然後照此繼續。加入每個殘基之後除去N-末端保護基，但是還不除去側鏈保護基。在將全部所需的胺基酸，以合適的順序連接之後，在對序列中的殘基具有最小破壞作用的條件下使肽從支持物上斷開下來，並除去所有的側鏈保護基。隨之對此合成產物小心地進行純化並作仔細的鑑定，以便確保所獲得的序列確實是所需要的結構。
在偶聯步驟中以酸或鹼敏感性保護基保護胺基酸的α-氨基功能是特別優選的。這類保護基具有在肽鍵形成的條件下是穩定的特點，同時易被除去而不破壞形成的肽鏈，不外消旋化其中包含的任何手性中心。適合的α-氨基保護基是Boc和Fmoc。醫學應用可將這種hGH-RH拮抗劑肽或這種肽的鹽配製成含有其有效量的藥物製劑形式，用於為治療或診斷的目的對人或動物給藥。這種肽可被用於抑制GH水平，治療與過量GH水平有關的疾病，例如糖尿病患者的視網膜病和腎病，以及肢端巨大症。還可以通過對需要這種治療的個人給予本發明的組合物，提供治療這類疾病的方法。但是，GH-RH拮抗劑的主要用途是在癌症領域，例如人類的乳腺癌，肺癌，結腸癌，腦癌，胰腺癌和前列腺癌，這些癌症都存在對於IGF-I或IGF-II的受體。
附圖簡述圖I是在用某些GH-RH拮抗劑治療的過程中，相對於治療天數MXT小鼠乳腺癌體積改變的曲線圖。
圖II是在用某些GH-RH拮抗劑治療過程中，相對於治療天數在裸鼠MDA-MB-468人乳腺癌體積改變的曲線圖。
圖III是在用某些GH-RH拮抗劑治療過程中，相對於治療天數在裸鼠HT-29人結腸癌體積改變的曲線圖。
圖IV是在用一種GH-RH拮抗劑治療過程中，相對於治療天數在裸鼠U87MG人神經膠質瘤(glioblastomas)體積改變的曲線圖。
圖V是在用某些GH-RH拮抗劑治療過程中，相對於治療天數在裸鼠PC-3人前列腺癌體積改變的曲線圖。
對優選實施方案的詳述A.縮寫用於定義這些肽的專門術語是由生物化學術語IUPAC-IUB委員會規定的術語，其中根據常規的表示法，在N-末端其氨基出現在左側，在C-末端其羧基出現在右側。在此使用的名詞「天然胺基酸」意指如下一種在天然存在的蛋白質中發現的天然存在的L-胺基酸Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Lys、Arg、Asp、Asn、Glu、Gln、Cys、Met、Phe、Tyr、Pro、Trp和His。當天然的胺基酸殘基具有異構體形式時，在此表示的是此胺基酸的L-構型，除非另有特定的指示。
非編碼胺基酸，或胺基酸相似物也被摻入GH-RH拮抗劑中(非編碼胺基酸是不在天然存在的肽中發現的大約20種天然胺基酸中的那些胺基酸)。如下胺基酸包括在可能用於hGH-RH拮抗性肽的非編碼胺基酸或胺基酸相似物中以Abu表示α-氨基丁酸，以Aib表示α-氨基異丁酸，以Har表示高精氨酸，以Nal表示2-萘基-丙氨酸，以Nle表示正亮氨酸，以及以Orn表示鳥氨酸。當這些非編碼胺基酸或胺基酸相似物具有異構體形式時，所表示的是此胺基酸的L-構型，除非另有特定的指示。
在此所採用的縮寫有Abu α-氨基丁酸Ac 乙醯基AcOH乙酸Ac2O乙酸酐Aib α-氨基異丁酸Boc 叔丁氧羰基Bom 苄氧甲基2BrZ2-溴-苄氧羰基cHx 環己基Cit 瓜氨酸(2-氨基-5-脲基戊酸)2CIZ2-氯-苄氧羰基DCM 二氯甲烷DIC N，N′-二異丙基碳化二亞胺DIEA二異丙基乙胺DMF 二甲基甲醯胺Fmoc芴基甲氧羰基Fpr 3-苯丙醯基GH 生長激素GH-RH GH釋放激素Har 高精氨酸HBTU2-(1H-苯併疊氮-1-基)-1，1，3，3-四甲基uronium六氟磷酸鹽hGH-RH 人GH-RHHOBt1-羥基苯並三唑HPLC高效液相色譜Ibu 異丁醯基IndAc 吲哚-3-乙醯基MBHA對-甲基二苯甲基胺MeOH甲醇MeCN乙腈Nac 1-萘基乙醯基Nal 2-萘基丙氨酸NMM N-甲基嗎啡Npr 萘基丙醯基PAM 苯乙醯氨甲基Phe(pCl)對-氯-苯丙氨酸PhAc苯乙醯基rGH-RH 大鼠GH-RHRP-HPLC 反相HPLCTFA 三氟乙酸Tos 對甲苯磺醯基Tyr(Me) 酪氨酸甲基醚Z 苄氧羰基B.GH-RH相似物本發明的hGH-RH相似物被設計成對受體具有增高的肽親和性，具有改進的代謝穩定性，以及具有最大的雙親性分子二級結構。這些相似物中的許多在體外和體內對由hGH-RH(1-29)NH2刺激的GH釋放可引起非常有效的和長時間持續的抑制作用。
因為具有顯著的生物活性，如下實施方案是特別優選的[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽1[IndAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽2[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽3[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Abu16，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽4[Nac0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽5[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽6[PhAc0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu16，Nle27，D-Arg28，Har29)hGH-RH(1-29)NH2肽7[Nac0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽8[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽9[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，Arg16，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29]NH2肽10[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽11[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Nle9，Abu15，Nle27，D-Arg28]hGH-RH(1-29)NH2肽12[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Nle13，Nle14，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽13[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Nle15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽14[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，Nle18，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽15[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽16[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽17[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽18[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Tyr(Me)10，Abu15， D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-缺席RH(1-29)NH， 肽19[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Tyr(Me)9， Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽20[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽21[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽22[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽23[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Lys9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽24[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Orn9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽25[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽26[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Har9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽27[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Lys9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽28[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Orn9，Abu115，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽29[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Cit9，Abu16，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽30六個非常優選的實施方案具有如下的結構式
PhAo0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val11-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2肽1IndAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln10-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2肽2PhAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Har9-Tyr(Me)10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2肽3PhAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr(Me)10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2肽6PhAc0-His1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2肽7Nac0-His1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2肽8按照已確定的慣例，這些肽可簡寫成如下形式[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽1[IndAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽2[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽3[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽6[PhAc0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽7[Nac0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽8C.製備方法1.合成法概述可藉助於適當的方法合成這種肽，例如完全的固相技術，部分的固相技術，片段縮合法或經典的液相合成法。例如在教科書「肽固相合成法」，J.M.Stewart和J.D.Young，Pierce化學公司，Rockford，111，1984(第二版)，以及M.Bodanszky，「肽合成原理」，Springer Verlag，1984中闡述了完全的固相合成技術。優選地可應用固相合成法製備這種hGH-RH拮抗性肽，例如由Merrifield，美國化學學會雜誌85 p.2149(1963)所概述的方法，雖然如前面所述還可以應用本領域已知的其它等效的化學合成法。
以在其α-氨基被保護的胺基酸進行這種合成。尿烷型保護基(Boc或Fmoc)優選地被用於保護α-氨基。優選的保護基是Boc。
按照固相合成法，是藉助於化學鍵將在C-末端形成最終肽氨醯基的N-α-保護胺基酸部分附著在多聚樹脂支持物上。在偶聯反應完成之後，選擇性地除去此α-氨基保護基，以便能在氨基末端進行後續的偶聯反應，當N-α-保護基是Boc時優選地可用在DCM中配製的50％TFA。逐步將具有相同Boc-保護α-氨基的其餘胺基酸偶聯於樹脂上前面胺基酸的自由氨基，以便獲得所需的肽序列。因為胺基酸殘基是偶聯於C-末端殘基的α-氨基，所以合成hGH-RH相似肽的延長是在C-末端開始並向N-末端延伸。當獲得了所需的序列，在N-末端將此肽醯化，並從多聚支持物上分離下來。
過量地使用每種被保護的胺基酸(2.5或3當量)，並通常在DCM，DMF或它們的混合物中進行偶聯反應。藉助於茚三酮反應在每個階段監測偶聯反應完成的程度。在被確定為不完全偶聯的情況下重複此偶聯步驟，或者在除去α-氨基保護基，然後偶聯下一個胺基酸之前，通過乙醯化未反應的氨基進行封端。
表1中顯示了一個典型的合成周期。
表1用於應用Boc-法的典型合成周期方案步驟試劑混合時間(分鐘)1.保護 DCM配製的50％TFA5＋25DCM洗滌液 12-丙醇洗滌液12.中和 DCM配製的5％DIEA1DCM洗滌液 1MeOH洗滌液 1DCM配製的5％DIEA3MeOH洗滌液 1DCM洗滌液(3次) 1-13.偶聯 DCM配製的3當量Boc-胺基酸或者DMF＋3當量DIC或預先形成的Boc胺基酸的HOBt酯60MeOH洗滌液 2DCM洗滌液 24.乙醯化DCM配製的Ac2O(30％)10＋20(如果適當時)MeOH洗滌液(3次) 2DCM洗滌液(3次) 2合成完成之後，應用熟知的肽化學方法可使肽從樹脂上斷開。
此肽的某些胺基酸殘基具有與用於偶聯或去保護的試劑易反應的側鏈功能基。當存在這種側鏈功能基時，為了防止在用於形成肽的反應過程中發生不希望有的化學反應，可使適合的保護基與這些功能基接合。在選擇特定的側鏈保護基時應遵守如下一般性規則(a)在偶聯反應條件下此保護基可優選地保持其保護特性，並不會被斷開，(b)在每一合成步驟除去α-氨基保護基的條件下這種保護基應該是穩定的，(c)當所需胺基酸序列的合成完成時，在不使肽鏈發生不良改變的反應條件下這種側鏈保護基必須可被除去。
優選地可按如下保護反應性側鏈功能基苄基用於保護Thr和Ser，2-溴-苄氧羰基用於保護Tyr，對-甲苯磺醯基或硝基用於保護Arg和Har，2-氯苄氧羰基或芴基甲氧羰基用於保護Lys和Orn，苄氧甲基用於保護His，以及環己基或芴基甲基用於保護Asp和Glu。Asn和Gln側鏈不需保護。
3.使胺基酸殘基逐步偶聯於多聚體支持物可以在多種多聚體支持物即MBHA，Merrifield，PAM或Wang樹脂上合成這種hGH-RH拮抗性肽。當N-α-Boc保護的胺基酸被用於合成時，優選的樹脂是MBHA。在此情況下，當從此支持相斷開時可獲得具有醯胺化C-末端的肽。
首先將此C-末端胺基酸附著於被中和的MBHA樹脂，然後進行隨後的胺基酸偶聯。以相對於樹脂-結合的自由氨基殘基大約3倍克分子量的過剩量偶聯每種被保護的胺基酸，可在介質如DMFCH2Cl2(1∶1)中，或者單獨在DMF或CH2Cl2中進行偶聯反應。選擇適合的偶聯劑是本領域技術人員熟知的。特別適合作為偶聯劑的是N，N′-二異丙基碳化二亞胺(DIC)，或者是與HOBt組合的HBTU。在合成的每個階段，優選地可藉助於茚三酮反應監測偶聯反應的結果。在發生不完全偶聯的情況下，重複此偶聯步驟，或者用Ac2O/DCM乙醯化樹脂-結合的未反應的氨基殘基，然後除去α-氨基保護基。
以同前面偶聯步驟相同的方式對肽的N-末端作最後的醯基化，不同之處是用適當的羧酸而不是胺基酸。
4.使肽與多聚體支持物分離合成完成之後使肽與支持相分離。通過用試劑如液體氟化氫處理可使肽與樹脂分離，同時還斷開其餘所有的側鏈保護基。
適合的方法是，用間甲酚和無水氟化氫組成的混合物處理乾燥的和被保護的肽-樹脂，每克肽-樹脂用1.0ml間甲酚和10ml無水氟化氫在0℃處理60分鐘，使肽與樹脂斷開並且分離所有的側鏈保護基。在氮氣流和真空條件下除去氟化氫之後，用乙醚沉澱游離的肽，過濾，用乙醚和乙酸乙酯洗，用50％乙酸提取並冷凍乾燥。
5.純化可應用肽化學領域熟知的程序純化此粗製肽。例如，可在MacRabbit HPLC系統(Rainin儀器公司，Woburn.MA)上進行純化，此系統帶有Knauer UV光度檢測器和Kipp及Zonen BD40記錄儀，使用Vydac 218TP5010反相柱(10×250mm，裝填300孔徑，5μm顆粒尺寸的C18矽膠)(Separations集團公司，Hesperia，CA)。用由(A)0.1％TFA水溶液和(B)在70％MeCN水溶液中配製的0.1％TFA組成的溶劑系統，按線性梯度方式(例如在120分鐘內30-55％B)對柱進行洗脫。在220nm監測洗出液，藉助於應用Hewlett-Packard型HP-1090液相層析的分析HPLC對組分進行檢測，並合併獲得最高的純度。以由上述的(A)和(B)組成的溶劑系統，應用等度洗脫在Vydac 218TP52反相柱(2×250mm，C18，300，5μm)上實施分析HPLC。在220和280nm監測洗脫峰。通過分析HPLC可斷定此肽基本上是純的(＞95％)。還可通過胺基酸分析證實預期的胺基酸組成。D.藥物組合物可將本發明的肽以可藥用的無毒性鹽的形式給藥，例如以酸式加成鹽的形式。作為這種酸式加成鹽的例證有如下多種鹽氫氯化物、氫溴化物、硫酸鹽、磷酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、單寧酸鹽、馬來酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、藻酸鹽、雙羥萘酸鹽、蘋果酸鹽、抗壞血酸鹽和酒石酸鹽等。特別優選的拮抗劑是低溶解度的鹽，例如Pamoate鹽等。這些鹽表現出較長的活性持續時間。
本發明的化合物適合對受試的人或動物給藥，通過皮下注射，肌肉注射或靜脈注射；鼻內給藥或通過肺吸入，或者由可生物降解的適合多聚體(如D，L-丙交酯-共乙交酯)製成的儲囊形式(例如微膠囊，微粒或圓柱棒樣植入物)，前二種儲囊方式是優選的。其它等效的給藥方式也屬於本發明的範疇，即連續滴注，depot注射，輸注泵給藥和延遲釋放的方式如微膠囊等。可在任何一種生物學允許的注射載體中給藥，生理鹽水是可接受的，雖然還可以使用本領域已知的其它載體。
這種肽優選地是通過注射給藥，隨同藥劑學允許的載體如等滲鹽水作肌內注射，皮下注射或靜脈內注射。另外，這種肽還可用適當的載體作為鼻內噴霧劑給藥或通過肺內吸入給藥。一種適合的給藥途徑是儲囊形式(depot form)，是由生物可降解的適合多聚體如聚D，L-丙交酯-共乙交酯製備成含有分散的拮抗性化合物的微膠囊，微粒或圓柱形植入物。
所需肽的劑量取決於給藥方式和預期的結果。一般來說其劑量範圍是每天每公斤體重1-100μg。E.GH-RH拮抗劑的治療用途hGH-RH拮抗劑可用於治療由過量的生長激素引起的疾病，例如肢端巨大症，表現為表面和肢端骨的異常增長。此GH-RH拮抗劑還可以用於治療糖尿病患者的腎病(是糖尿病患者失明的主要原因)和糖尿病患者的視網膜病，認為其中是由於GH分別引起了眼和腎的損傷。
這種hGH-RH拮抗劑被設計成能阻斷GH-RH的結合，因此阻斷GH-RH的作用，GH-RH刺激GH的分泌，GH又刺激產生IGF-I。GH-RH拮抗劑可被單獨給藥，或者與生長激素釋放抑制因子相似物一同給藥，後者是一種可更有效地抑制IGF-I水平的組合形式。給予GH-RH拮抗劑而不是生長激素釋放抑制因子是有利的，因為GH-RH拮抗劑可能被用在其靶標位點沒有生長激素釋放抑制因子受體的部位。
但是，GH-RH拮抗劑的主要應用是在癌症範圍內。這是基於如下的考慮GH-RH拮抗劑是被設計成能阻斷GH-RH的結合，因此阻斷GH-RH的作用，GH-RH刺激GH的分泌，GH又刺激產生胰島素樣生長因子I(IGF-I)，也被稱為促生長因子-C。已充分地證實IGF-I(促生長因子-C)與乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、骨腫瘤和其它一些惡性腫瘤有關，並且生長激素釋放抑制因子相似物單獨不能充分地抑制GH和IGF-I的水平。為了更好地抑制腫瘤生長需要完全抑制IGF-I的水平或分泌。多種腫瘤自體分泌產生IGF-I也可能是在GH-RH的控制之下，因此可被GH-RH拮抗劑抑制。GH-RH拮抗劑還可抑制IGF-I的產生。GH-RH在腫瘤學(癌症)領域內應用的更精確的理論基礎是在人原發性乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結腸癌、腦癌、胰腺癌以及在腎細胞癌症中都存在對IGF-I的受體。
這些腫瘤中IGF-I受體的存在看來與這些癌症的惡性轉移的增殖有關。對於多種人類癌症，IGF-I可起內分泌、旁路分泌或自體分泌生長因子的作用，也就是說，這些腫瘤的生長取決於IGF-I。GH-RH拮抗劑通過抑制GH分泌而減少IGF-I的產生。因為IGF-l刺激多種腫瘤(癌)的生長，所以降低血液循環中IGF-I的水平將導致腫瘤生長的抑制。GH-RH拮抗劑還可能降低腫瘤旁路分泌或自體分泌產生IGF-I，這也應該導致癌腫增殖的抑制。這些觀點符合臨床腫瘤學和現代概念。GH-RH拮抗劑可單獨給藥或與生長激素釋放抑制因子相似物一同給藥，這種組合將導致對IGF-I水平更完全的抑制，更完全地降低組織中的IGF-I水平，例如排除人骨肉瘤中的，以及乳癌、結腸癌、前列腺癌和非-小細胞肺癌(非-SCLC)中的IGF-I。
GH-RH拮抗劑優於生長激素釋放抑制因子相似物是基於如下事實GH-RH拮抗劑可用於抑制沒有生長激素釋放抑制因子受體的腫瘤，例如人骨原性肉瘤。
已表明GH-RH的拮抗性相似物在體內可抑制多種腫瘤的生長。部分地是通過抑制GHRH-GH-IGF-I軸心來行使這種作用。儘管如此，IGF-II對增殖的自體分泌/旁路分泌控制在許多腫瘤也是主要的因素。幹擾這種自體分泌性生長-刺激途徑提供了一種控制腫瘤的方法。如通過比色測定和[3H]-胸苷摻入試驗所顯示的，在體外GH-RH的拮抗性相似物MZ-4-71{[Ibu0，Tyr1，D-Arg2，Abu15，Nle27]hGH-RH(1-28)Agm}和MZ-5-156{[PhAc0，D-Arg2，Abu15，Nle27]hGH-RH(1-28)Agm}顯著地抑制了乳腺癌(MDA-MB-468，ZR-75-1)、前列腺癌(PC-3和DU-145)和胰腺癌(MiaPaCa-2，SW-1990和Capan-2)細胞系增殖的速度，降低了這些細胞中IGF-II mRNA的表達和lGF-II分泌進入培養基的濃度。同樣這二種GH-RH拮抗劑在體內對前列腺腫瘤(PC-3，DU-145)，腎臟腺癌(Caki-1)和非-小細胞肺癌(H157)也產生了類似的結果(抑制增殖和減少IGF-II產生)。這些發現提示，GH-RH和拮抗性相似物不但可以通過抑制GHRH-GH-IGF-I軸心，而且可以通過減少某些腫瘤細胞中IGF-II的產生從而中斷它的自體分泌調節途徑來抑制腫瘤生長。
將結合下面的實施例對本發明進行論述，提出這些實施例僅僅是為了說明的目的。在這些實施例中，所使用的都是被保護的L-構型旋光活性胺基酸，除非另有特別註明。
下面的實施例提供了通過固相技術合成這種新型GH-RH拮抗劑的適當方法。
實施例IPhAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2(肽1){[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2}應用手工操縱的固相肽合成裝置，以逐步進行的方式實施此肽的合成。簡單地說，按照表1中所述的方案以CH2Cl2配製的5％DIEA中和對-甲基二苯甲基胺(MBHA)樹脂(Bachem，California)(720mg，0.50mmole)並洗滌。在手工操縱的固相肽合成儀中，將DMF-CH2Cl2(1∶1)配製的Boc-Har(NO2)-OH(500mg，1.5mmole)溶液與中和的樹脂和DIC(235μl，1.5mmole)一起震搖1小時。通過陰性茚三酮試驗證明偶聯反應完成之後，以CH2Cl2配製的50％TFA去保護基，並用CH2Cl2配製的5％DIEA中和，通過在樹脂上按所指明的順序偶聯下面的被保護胺基酸以便獲得所需的肽序列，逐步構成了此肽鏈Boc-D-Arg(Tos)-OH，Boc-Nle-OH，Boc-Ile-OH，Boc-Asp(OcHx)-OH，Boc-Gln-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Lys(2CIZ)-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Ala-OH，Boc-Ser(Bzl)-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Gln-OH，Boc-Abu-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Val-OH，Boc-Lys(2CIZ)-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Tyr(2Brz)-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Asn-OH，Boc-Thr(Bzl)-OH，Boc-Phe(pCl)-OH，Boc-Ile-OH，Boc-Ala-OH，Boc-Asp(OcHx)-OH，Boc-D-Arg(Tos)-OH，Boc-Tyr(2BrZ)-OH 。
上面按照普遍接受的慣例提供了這些被保護的胺基酸殘基(通常也可從Bachem公司購得)。對於特定胺基酸的側鏈功能基的適當保護基顯示在圓括弧中。上面結構式中的OH基表明每個殘基的羧基末端是自由的。
除了以它們預先形成的HOBt酯偶聯的Boc-Asn-OH和Boc-Gln-OH之外，其餘被保護的胺基酸(各1.5mmole)都是以DIC(235μl，1.5mmole)偶聯。在從Tyr1除去N″-Boc保護基之後，用DIC(313μl，2mmole)，以苯乙酸(PhAc)(272mg，2mmole)醯化此肽。
為了使此肽從樹脂上斷開並使它去保護基，在0℃將乾燥的肽樹脂(2.18g)與2ml間-甲酚和20ml氟化氫(HF)一起攪拌1小時。在真空下蒸發HF之後，用無水二乙醚和乙酸乙酯洗此殘留物。將被斷開和去保護的肽溶解於50％乙酸中，藉助於過濾使其與樹脂分離。用水稀釋並冷凍乾燥後得到1.51g粗製產品。
通過分析性HPLC審核此粗製肽應用Hewlett Packed HP-1090液相色譜儀，以Vydac 218TP52反相柱(2×250mm，裝填C18矽膠，矽膠孔徑300，顆粒大小5μm)(The Separations集團公司，Hesperia，CA)進行層析，並用由(A)0.1％TFA水溶液和(B)在70％MeCN水溶液中配製的0.1％TFA組成的溶劑系統作線性梯度洗脫(例如40-70％B)。將500mg粗製肽溶解於AcOH/H2O中，攪拌、過濾後施加於Beckman Vltraprep ODS柱(21.1×150mm，裝填C18矽膠，此矽膠孔徑300，顆粒大小10μm)上。用上述的溶劑系統以線性梯度方式(例如30-55％B，120分鐘)洗脫此柱，流速6ml/分鐘。在220nm監測洗出液，通過分析性HPLC對組分進行檢測。合併純度高於95％的組分，冷凍乾燥獲得98mg結晶。此分析性HPLC是在上述的Vydac C18反相柱上進行，用上述的溶劑系統作等度洗脫，流速0.2ml/分鐘。在220和280nm監測洗脫峰。通過分析性HPLC斷定此產品基本上是純的(＞95％)。藉助於電噴射質譜法檢查分子量，並通過胺基酸分析證實預期的胺基酸組成。
實施例IIPhAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Har9-Tyr(Me)10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2(肽3){[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2}應用手工操縱的固相肽合成裝置，以逐步進行的方式實施此肽的合成。簡單地說，按照表1中所述的方案以CH2Cl2配製的5％DIEA中和對-甲基二苯甲基胺(MBHA)樹脂(Bachem，California)(100mg，0.070mmole)並洗滌。在手工操縱的固相肽合成裝置中，將DMF-CH2Cl2(1∶1)配製的Boc-Har(NO2)-OH(83mg，0.25mmole)溶液與中和的樹脂和DIC(44μl，0.275mmole)一起震搖1小時。通過陰性茚三酮試驗證明偶聯反應完成之後，以CH2Cl2配製的50％TFA去保護基，並用CH2Cl2配製的5％DIEA中和，通過在樹脂上按所指明的順序偶聯下面的被保護胺基酸以便獲得所需的肽序列，逐步構成了此肽鏈Boc-D-Arg(Tos)-OH，Boc-Nle-OH，Boc-Ile-OH，Boc-Asp(OcHx)-OH，Boc-Gln-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Lys(2CIZ)-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Ala-OH，Boc-Ser(Bzl)-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Gln-OH，Boc-Abu-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Val-OH，Boc-Lys(2CIZ)-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Tyr(Me)-OH，Boc-Har(NO2)-OH，Boc-Asn-OH，Boc-Thr(Bzl)-OH，Boc-Phe(pCl)-OH，Boc-Ile-OH，Boc-Ala-OH，Boc-Asp(OcHx)-OH，Boc-D-Arg(Tos)-OH，Boc-Tyr(2BrZ)-OH。
上面按照普遍接受的慣例提供這些被保護的胺基酸殘基(通常也可從Bachem公司購得)。對於特定胺基酸的側鏈功能基的適當保護基顯示在圓括弧中。上面結構式中的OH基表明每個殘基的羧基末端是自由的。
除了以它們預先形成的HOBt酯偶聯的Boc-Asn-OH和Boc-Gln-OH之外，其餘被保護的胺基酸(各0.25mmolr)都是以DIC(44μl，0.275mmole)偶聯。在從Tyr1除去N″-Boc保護基之後，使用DIC(70μl，0.44mmole)以苯乙酸(PhAc)(54mg，0.4mmole)醯化此肽。
為了使此肽從樹脂上斷開並使它去保護基，在0℃將乾燥的肽樹脂(206mg)與0.5ml間-甲酚和5ml氟化氫(HF)一起攪拌1小時。在真空下蒸發HF之後，用無水二乙醚和乙酸乙酯洗此殘留物。將此被斷開和去保護的肽溶解於50％乙酸中，藉助於過濾使其與樹脂分離。用水稀釋並冷凍乾燥後得到112mg粗製產品。
通過分析性HPLC審核此粗製肽應用Hewlett Packed HP-1090液相層析儀，以Vydac 218TP52反相柱(2×250mm，裝填孔徑300，顆粒大小5μm的C18矽膠)(The Separations集團公司，Hesperia，CA)進行層析，並用由(A)0.1％TFA水溶液和(B)在70％MeCN水溶液中配製的0.1％TFA組成的溶劑系統作線性梯度洗脫(例如40-70％B)。將80mg粗製肽溶解於AcOH/H2O中，攪拌、過濾後施加於以C8矽膠裝填的Vydac 218TP5010柱(10×250mm)上。用上述的溶劑系統以線性梯度方式(例如30-55％B，120分鐘)洗脫此柱，流速2ml/分鐘。在220nm監測洗出液，並通過分析性HPLC對組分進行檢測。合併純度高於95％的組分，冷凍乾燥獲得9.6mg結晶。此分析性HPLC是在上述Vydac C18反相柱上進行，用上述的溶劑系統以0.2ml/分鐘的流速作等度洗脫。在220和280nm監測洗脫峰。通過分析性HPLC斷定此產品基本上是純的(＞95％)。藉助於電噴射質譜法檢查分子量並通過胺基酸分析證實預期的胺基酸組成。
以同肽1和肽3相同的方式合成肽2和肽4至肽30，不同的是這些肽還含有其它取代基，將產生下列肽[IndAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽2[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽4[Nac0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽5[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽6[PhAc0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽7[Nac0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)8，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽8[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽9[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，Arg16，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽10[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽11[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Nle9，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽12[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)0，Nie13，Nle14，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽13[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Nle15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽14[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，Nle18，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽15[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽16[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽17[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽18[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Tyr(Me)10，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽19[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Tyr(Me)9，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽20[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽21[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29[hGH-RH(1-29)NH2肽22[PhAc0，D.Arg2，Phe(pCl)6，D-Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29[hGH-RH(1-29)NH2肽23[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Lys9，Abu16，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽24[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Orn9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽25[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2， 肽26[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Har9，Abu16，Nle27，D-Arg28，Har29[hGH-RH(1-29)NH2肽27[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，D-Lys9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-
29)NH2肽28[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Orn9，Abu16，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH[1-29)NH2肽29[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Cit9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽30實施例III生物活性以體外和體內測定法測定了本發明的肽，測定它們抑制hGH-RH(1-29)NH2誘發的GH釋放的能力。過冷大鼠垂體系統按照以前描述的一種測定法(S.Vigh和A.V.Schally，肽5241-347，1984)的修改形式(Z.Rekasi和A.V.Schally，P.N.A.S.902146-2148，1993)對這些肽相似物進行了體外測定。
簡單地說，細胞與多種濃度的肽(3ml)預溫育9分鐘。溫育後立即加入1nM hGH-RH(1-29)NH2(1ml)作用3分鐘
。為了檢測此相似物拮抗性作用的持續時間，在30、60、90和120分鐘後加入1nM hGH-RH(1-29)NH2，作用3分鐘[30、60、90、120分鐘的應答]。估算GH應答的淨整數值。將GH應答與1nM hGH-RH(1-29)NH2誘發的最初GH應答相比較，並以最初應答的百分數表示。將新拮抗劑的作用與「標準拮抗劑」[Ac-Tyr1，D-Arg2]hGH-RH(1-29)NH2的作用相比較。生長激素放射免疫測定法採用由National Hormone and Pituitary Program，Baltimore，Maryland供給的材料，通過雙抗體放射免疫測定法測定了等分量未稀釋的和稀釋的過冷樣品(Superfusion Samples)中大鼠GH的含量。用我們研究所建立的電腦程式分析此RIA結果(V.Csernus和A.V.Schally，神經分泌研究方法，Harwood(Greenstein，B.D.編著，London，pp 71-109，1991。特此引入作為參考)。每次檢測間的差異小於15％，一次檢測內的差異小於10％。GH-RH結合測定法為了測定GH-RH拮抗劑的結合特徵建立了靈敏的放射受體結合測定法(G.Halmos，A.V.Schall等，受體3，87-97(1993))，特此引入作為參考。此測定法是基於標記的[His1，Nle27] hGH-RH(1-32)NH2與大鼠垂體前葉膜勻漿的結合。通過氯胺-T法(F.C.Greenwood等，生物化學89114-123，1963，特此引入作為參考)製備[His1，Nle27]hGH-RH(1-32)NH2的碘化衍生物。用來自雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300g)的垂體製備粗製膜。為了進行飽和結合分析，在存在和不存在過量未標記肽(1μM)時，將膜勻漿與0.005-0.35 nM範圍內的至少6個濃度的[His1，125I-Tyr10，Nle27]hGH-RH(1-32)NH2共溫育。
在γ-計數器內對沉澱作放射活性計數。以競爭性結合實驗測定待測拮抗性肽對大鼠垂體GH-RH受體的親和性。以Ki(抑制劑-受體複合物解離常數)評估最終的結合親和性，並可藉助於Munson和Rodbard的Ligand PC和McPherson電腦程式(P.J.Munson和D.Rodbard，分析生物化學，107，220-239，1980)測定。與標準拮抗劑[Ac-Tyr1，D-Arg2]hGH-RH(1-29)NH2相比較的相對親和性被計算為所測定GH-RH拮抗劑的Ki對標準拮抗劑的Ki之比。體內試驗對Sprague-Dawley雄性幼大鼠(200-250g)試驗了這些相似物的GH-RH拮抗作用。每次實驗用5組動物，每組7隻動物。將這些化合物(80μg/kg)和GH-RH(1-29)NH2(3μg/kg)溶解於5.5％甘露醇，在戊巴比妥鈉麻醉下對大鼠頸靜脈作靜脈內注射。根據如下方案，不同組之間給予拮抗劑和給予GH-RH之間的時間間隔不同。第一組動物在給予拮抗劑之後5分鐘接受GH-RH注射；對於第二、第三和第四組動物，注射拮抗劑和注射GH-RH之間的時間間隔分別是15、30和60分鐘。對照組先只注射溶劑不注射拮抗劑，5分鐘之後注射GH-RH。
給予拮抗劑之前(「血液0」)，以及注射GH-RH之後5分鐘(「血液1」)各採血樣0.4ml用於GH RIA測定。每組中的GH應答被計算為rGH＝(GH血液1/GH血液0)，以個體差異的平均數±S.E.M表示。每個處理組中對GH應答的相對抑制作用被計算為100×(rGH處理組-1)/(rGH對照組-1)。體外試驗結果對過冷的大鼠垂體系統測定的拮抗活性和結合測定的體外試驗結果分別被概括在表II和表III中。從這些數據可以看到，當與標準拮抗劑相比較，分子中存在取代基可導致巨大地增加體外試驗中的受體結合以及對GH釋放的抑制作用。體外試驗中最強有力的拮抗劑肽1，在標準試驗條件下導致對GH-RH誘發的GH釋放的完全抑制達90分鐘。在暴露於此相似物之後120分鐘檢測到GH-RH響應性恢復的第一個信號。
表II在過冷的大鼠垂體系統中對GH釋放的抑制作用拮抗劑 劑量對GH釋放的抑制作用(％)(nM) 0分鐘 30分鐘 60分鐘 90分鐘 120分鐘標準拮抗劑100 62.1 2.519肽1 30100100100100 94肽2 30100100100100 91肽3 3085 98 91 92 87肽4 3083 86 80 79 68肽5 3079 77 59 58 50肽6 3093 93 97 95 90肽7 3097 92 82 77 65肽8 3010010098 97 90肽9 3091 87 79 72 59肽103075 69 46 24 22肽113096 89 80 56 42肽123068 75 48 52 52肽163065 87 83 56 65肽193058 47 59 23 39
表IIIhGH-RH拮抗劑的Ki值和相對親和性(R.A)肽 Ki(nM) R.A.標準拮抗劑 2.94 1肽10.00467肽20.04664肽30.06843肽40.08734肽50.03682肽90.05851肽10 0.10727肽11 0.07141肽12 0.07042肽16 0.07042體內試驗結果表IV顯示對於用GH-RH拮抗劑預先處理的大鼠其血清GH應答和它們的相對抑制作用。所有被測定的相似物(肽1、肽2、肽3、肽4、肽8、肽9、肽11和肽16)對由hGH-RH(1-29)NH2激發的GH釋放可產生很強的和長時間持續的抑制作用。在短期肽1和肽2是最強有力的，當在給予hGH-RH(1-29)NH2之前5分鐘給予肽1和肽2抑制GH應答達95％和91％。這二個肽的作用持續至少30分鐘。另一方面，在短期作用稍微弱點的肽11和肽3具有非常長時間的作用它們的作用持續至少60分鐘。
表IV在給予hGH-RH(1-29)NH2之前不同的時間間隔用GH-RH拮抗劑預處理的大鼠血清GH的應答和對GH應答的相對抑制作用拮抗劑 時間間隔 GH應答相對抑制作用(分鐘)平均數±S.E.M ％肽1 5 1.13±0.139515 1.87±0.136830 1.97±0.166460 3.89±0.65-8對照 3.68±0.78 0肽2 5 1.40±0.299115 3.45±0.134530 3.64±0.714160 5.41±1.35 2對照 5.47±0.97 0肽3 5 3.01±0.416815 3.63±0.806130 4.89±0.954160 5.36±0.6334對照 7.65±0.66 0肽4 5 3.08±0.588215 7.73±1.12433012.00±2.54 76011.88±0.90 8對照12.82±1.38 0肽8 5 2.3±0.3 7415 3.6±0.4 4630 5.5±0.6 860 5.8±0.7 1對照 5.8±0.5 0肽95 2.75±0.757515 3.85±0.505930 3.34±0.306760 7.32±1.1610肽11 5 5.15±1.11841513.64±1.41503016.04±4.36406016.61±6.0238對照26.17±3.92 0肽16 5 2.89±0.657715 3.44±0.627030 5.24±1.364860 9.19±1.89 0對照 9.13±1.69 0實施例IV腫瘤學試驗對多種癌症模型試驗了本發明肽的抗腫瘤活性。將這些新型的抗腫瘤作用同以前的相似物(MZ-4-71和MZ-5-156，屬於美國專利5,550,212和美國專利申請08/642,472)進行比較。GH-RH拮抗劑對MXT小鼠乳腺腫瘤的作用對雌性BDF小鼠皮下移植雌激素非依賴性MXT腫瘤。移植後的第一天將小鼠分組，每組10隻動物，並開始治療。第1、2、3和4組小鼠以每天20μg的劑量接受不同GH-RH拮抗劑的皮下注射，每日一次持續18天。第5和6組小鼠以每日20μg肽的劑量通過Alzet滲透泵釋放給予這二種肽。定期測量腫瘤，計算腫瘤的體積。在第18天處死這些小鼠，測定腫瘤的重量。結果肽1和肽3對MXT小鼠乳腺癌具有相似的強抑制作用。以MZ-5-156治療也導致腫瘤生長的顯著抑制，但是它的作用比肽1和肽3的作用弱(見表V和

圖1)。
表V用GH-RH拮抗劑對MXT小鼠乳腺腫瘤的治療作用分組 腫瘤體積(mm3) 腫瘤重量殘活小鼠第14天第18天 (mg) 的數目1.對照 4051±1007 7040±646 7269±29252.MZ-5-156 2717±773 5368±408*4885±480*43.肽1每日注射2924±6544373±381**6964±67664.肽3每日注射1902±349**3465±607**5266±90685.肽1泵 1329±327**3403±584**4810±645*76.肽3泵 1688±220**4272±295**5939±4538*p＜0.05**p＜0.01GH-RH拮抗劑對裸小鼠中MDA-MB-468人乳腺癌異種移植物的作用將帶有MDA-MB-468激素非依賴性人乳腺癌異種移植物的裸小鼠分成每10隻動物一組。治療組接受每日一次皮下注射20μg GH-RH拮抗劑。第一組用肽1治療，第二組用MZ-5-156治療作為比較。對照組注射賦形劑溶劑。治療持續5周。每周測量腫瘤一次，計算腫瘤體積。實驗結束時處死小鼠，測量腫瘤的重量。結果二種肽都對MDA-MB-468異種移植物發揮了顯著的腫瘤抑制作用。在注射肽1的組，在實驗過程中4個腫瘤顯著出持續的退化。同樣MZ-5-156導致3個腫瘤退化。治療5周之後，這些癌症退化成小的疤痕狀組織殘餘物。對這些組織的組織學檢查揭示出具有廣泛壞死的未分化上皮腫瘤，只有狹窄的活腫瘤組織邊緣線。相反，在對照動物的所有腫瘤都穩定地發展了。在治療組最後的腫瘤體積和重量都顯著減少了(見表VI和圖II)，肽1具有較強的作用。
表VI用GH-RH拮抗劑對裸小鼠中MDA-MB-468人乳腺癌異種移植物的治療作用分組 腫瘤的最後體積腫瘤重量 退化腫瘤(mm3) (mg) 的數目對照 477.5±41.2440.7±37.70肽1 82.4±29.1**64.0±28.7**4MZ-5-156 104.4±32.2**77.7±31.7**3*p＜0.05**p＜0.01GH-RH拮抗劑對裸小鼠中HT-29人結腸癌異種移植物的作用將HT-29人結腸癌皮下注射移植進入雄性裸小鼠。移植後19天將小鼠分組，每組10隻動物，並開始治療。小鼠以每天20μg的劑量每天接受一次不同GH-RH拮抗劑皮下注射，持續6周。定時測量腫瘤，計算腫瘤的體積。實驗最後處死小鼠，測量腫瘤的重量。結果肽1和MZ-5-156對HT-29人結腸癌具有同等強度的抑制作用。用肽9治療導致了較小但仍有顯著性的腫瘤生長抑制作用。肽11和MZ-4-71隻具有很小的非顯著性作用。(結果概括在表VII和圖III中)。
表VII用GH-RH拮抗劑對裸小鼠中HT-29人結腸癌異種移植物的治療作用分組 腫瘤最後的體積(mm3) 腫瘤重量(mg)對照2117±751 2364±835MZ-4-71 1953±400 2189±458MZ-5-156 908±195*1012±174*肽111663±610 1849±681肽9 1194±506*1383±576*肽1 890±322*1354±480**p＜0.05GH-RH拮抗劑肽1對裸小鼠內U87MG人神經膠質瘤異種移植物的作用以U87MG神經膠質瘤植入小鼠皮下，當腫瘤達到大約70mm3體積時將小鼠隨機分成2個實驗組。一組用肽1治療，每日皮下注射一次20μg，持續28天，而另一組作為對照。結果與對照組比較，用肽1治療4周後抑制腫瘤生長達77％(見表VIII和圖IV)。
表VIII用GH-RH拮抗劑肽1對裸小鼠內U87MG人神經膠質瘤異種移植物的治療作用分組腫瘤的最後體積(mm3) 腫瘤重量(g)對照 3425±7234.7±1.3肽1 817±323**1.4±0.7****p＜0.01GH-RH拮抗劑對裸小鼠內PC-3人前列腺癌異種移植物的作用以3mm3小片PC-3人激素-非依賴性前列腺癌組織皮下植入雄性裸小鼠的腹部二側。當腫瘤達到大約40-50mm3體積時將小鼠分成3個實驗組。第一組和第二組分別用肽3和MZ-5-156治療，每日皮下注射一次20μg，持續21天，而第三組用作對照組。每隔一周測量腫瘤的體積，在實驗結束時測量腫瘤重量。結果二種GH-RH拮抗劑都抑制PC-3腫瘤生長(見表IX和圖V)。肽3具有較強的生長抑制作用(抑制腫瘤體積65％，腫瘤重量62)，MZ-5-156較弱(分別為52％和46％)。
表IX用GH-RH拮抗劑對裸小鼠內PC-3人前列腺癌異種移植物的治療作用分組腫瘤最後體積(mm3) 腫瘤的重量(mg)對照 307.9±64.5 191.8±42.6肽3 107.9±12.5*73.7±11.9*MZ-5-156 148.9±41 104.3±27.2*p＜0.0權利要求
1.一種選自具有如下結構式的肽及其可藥用的鹽X-R1-R2-Asp-Ala-R5-R6-Thr-R8-R9-R10-Arg-R12-R13-R14-R15-R16-Leu-R18-R19-Arg-R21-R22-Leu-Gln-Asp-Ile-R27-R28-R29-NH2其中X是PhAc、IndAc、Ibu、Nac、1-或2-NPr、或者Fpr，R1是Tyr或His，R2是D-Arg或D-Cit，R5是Ile或Val，R6是Phe、Nal或Phe(Y)、在此Y＝F、Cl、Br，R8是Asn、Gln、Ser、Thr、Ala、D-Asn、D-Gln、D-Ser、D-Thr、Abu、D-Abu或Aib，R9是Arg、Har、Lys、Orn、D-Arg、D-Har、D-Lys、D-Orn、Cit、Nle、Tyr(Me)、Ser、Ala或Aib，R10是Tyr或Phe(Y)，在此Y＝H、F、Cl、Br或OCH3，R12是Lys、D-Lys或Orn，R13是Val或Nle，R14是Leu或Nle，R15是Gly、Ala、Abu、Nle或Gln，R16是Gln或Arg，R18是Ser或Nle，R19是Ala或Abu，R21是Lys或Orn，R22是Leu、Ala或Aib，R27是Met、Leu、Nle、Abu或D-Arg，R28是Arg、D-Arg、Ser、Asn、Asp、Ala或Abu，R29是Arg、D-Arg、Har或D-Har。
2.權利要求1的化合物，是選自下列的肽[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽1[IndAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽2[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽3[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽6[PhAc0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽7[Nac0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽8。
3.權利要求1的化合物，具有如下結構式[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽1。
4.權利要求1的化合物，具有如下結構式[IndAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽2。
5.權利要求1的化合物，具有如下結構式[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽3。
6.權利要求1的化合物，具有如下結構式[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽6。
7.權利要求1的化合物，具有如下結構式[PhAc0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽7。
8.權利要求1的化合物，具有如下結構式[Nac0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽8。
9.一種對需要抑制過量GH水平的病人抑制過量GH水平的方法，包括給予該病人有效劑量權利要求1的化合物。
10.一種治療患有癌症病人的方法，其癌症攜帶有對IGF-1或-II的受體，此方法包括給予該病人有效劑量權利要求1的化合物。
11.一種抑制腫瘤(癌)中IGF-II水平和這種腫瘤中IGF-IImRNA表達的方法，此方法包括給予該病人有效劑量權利要求1的化合物。
全文摘要
在此提供了一系列新型的hGH－RH(1－29)NH
文檔編號C07K14/60GK1328570SQ99813735
公開日2001年12月26日 申請日期1999年11月23日 優先權日1998年11月25日
發明者A·V·沙利, J·瓦格加, M·扎蘭蒂 申請人:圖蘭恩教育基金管理人