microRNA檢測探針組與microRNA的檢測方法與流程
2023-04-24 20:02:56 4
本發明涉及分子檢測
技術領域：
，尤其涉及microRNA檢測探針組與microRNA的檢測方法。
背景技術：
：MicroRNA(miRNA)是一類內生的、長度約為19-24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。由於miRNA能夠很好的識別並配對後轉錄基因進而調控蛋白的表達，所以它與動物體內的生物過程息息相關。目前已經有研究表明：miRNA的異常行為會導致疾病的出現，包括心血管疾病，神經發育失常，甚至癌症[Nature,2012,482,347.]。例如miRNA-32的過表達是前列腺癌的基礎的重要標誌物[Oncogene2012,31,4460.]，miRNA-122也被作為肝癌細胞發病的一個基礎標誌物[J.Am.Chem.Soc.2010,132,7976.]。所以在癌症的診斷以及治療過程中miRNA的濃度都是一個重要的生物指標。目前，通用的miRNA檢測方法有qRT-PCR，Northernblot，寡核苷酸微陣列[Chem.Rev.,2013,113,6207.]，其中NorthernBlotting是最經典的miRNA檢測手段，但是它本身檢測靈敏度較低，並且需要大量的樣品。而微陣列具有高通量檢測的優勢，但是檢測需要的時間很長，並且精度不高。qRT-PCR檢測手段具有高精度，高靈敏度的特點，但是需要長時間的擴增步驟並且對操作人員具有一定的技能要求，這在實時檢測中是一個很大的問題。但是上述方法最大的一個問題是所有的實驗都是基於細胞裂解處理，無法實時的反映出腫瘤組織及腫瘤細胞內部真實的miRNA的作用機制。因此為了能更加深入了解miRNA在細胞內調控基因表達的真實信息以及探索miRNA在細胞內的反應的動態過程，實現細胞內的miRNA的檢測則尤為重要。現如今體內miRNA檢測手段主要分為原位雜交技術和動態成像技術。在動態成像技術中基於分子信標成像是一個非常重要的手段。藉助特殊的轉染技術將螢光標記的分子信標導入細胞內，分子信標與目標miRNA分子配對後發生結構的轉變會導致螢光信號的出現，最終實現miRNA的檢測。[Biomaterials,2012,33,6430.]但是這些技術中存在一個明顯的問題就是每次的信號分子的輸出都伴隨著目標分子的消耗。而在腫瘤細胞或腫瘤組織中的miRNA分子表達非常的有限，所以上述的技術在實現腫瘤組織活細胞內miRNA分子的檢測具有很大的限制。因此，為了克服現有技術中細胞內miRNA分子檢測的困難，本發明人進行了深入研究，發現利用級聯的DNA鏈替換反應實現腫瘤細胞或組織內microRNA檢測具有簡單操作，可以實現低濃度檢測等特點，但是，如何避免級聯DNA鏈替換反應過程中發生的螢光信號的洩露現象，仍是本領域亟待解決的問題。技術實現要素：有鑑於此，本發明要解決的技術問題在於提供microRNA檢測探針組與microRNA的檢測方法，本發明提供的探針設置合理，能夠有效避免螢光信號的洩露，提高檢測的特異性。本發明提供的檢測microRNA的探針組，由4條DNA探針組成，分別為：基底鏈、信號鏈、主導燃料鏈和保護燃料鏈；所述基底鏈包括順序連接的淬滅基團、準粘性末端和待測microRNA的互補序列；所述信號鏈與基底鏈互補，所述信號鏈一端修飾有螢光基團；所述保護燃料鏈與待測microRNA互補；所述主導燃料鏈包括順序連接的待測microRNA序列一致的DNA序列和互補準粘性末端。本發明的探針組中，淬滅基團位於基底鏈的3』端，則螢光基團位於信號鏈的5』端；淬滅基團位於基底鏈的5』端，則螢光基團位於信號鏈的3』端。本發明實施例中，淬滅基團位於基底鏈的5』端，而螢光基團位於信號鏈的3』端。本發明提供的探針組根據待測microRNA的序列設計。其中基底鏈與信號鏈部分互補、保護燃料鏈與主導燃料鏈部分互補。以本發明提供的探針組對待測miRNA進行檢測的原理如圖1：首先，將基底鏈與信號鏈雜交，使基底鏈與信號鏈形成雙鏈A。形成雙鏈後，信號鏈末端的螢光基團會與基底鏈末端的淬滅基團非常的靠近，螢光基團被淬滅，沒有螢光信號的輸出。然後，將主導燃料鏈和保護燃料鏈雜交，形成雙鏈B。然後，將雙鏈A和雙鏈B在轉染劑的作用下，轉染入動物體(或人體)、組織或細胞中。當雙鏈A和雙鏈B進入生物體(或人體)、組織或細胞中，在鹽離子的作用下，發生鏈替換反應，反應步驟為：一、待測miRNA首先與雙鏈A上的裸露的一端作用，進而發生鏈替換反應，其中，待測miRNA與基底鏈形成中間體1；而信號鏈則被釋放，螢光基團與淬滅基團分離，發出螢光信號；二、中間體1與雙鏈B發生鏈替換反應，其中，miRNA與保護燃料鏈形成中間體2；而主導燃料鏈和基底鏈結合形成雙鏈C，不再發光；三、中間體2與雙鏈A發生鏈替換反應，其中，miRNA與基底鏈結合形成中間體1，而保護燃料鏈則與信號鏈結合，形成雙鏈的信號鏈，螢光基團與淬滅基團分離，發出螢光。在上述過程中，DNA鏈替換反應使得，信號鏈被釋放為單鏈或者和與保護燃料鏈結合形成雙鏈信號鏈，從而使得螢光基團得以發出螢光。而由於miRNA與保護燃料鏈形成中間體2後，仍然能夠用於觸發與雙鏈A的反應，從而使得級聯的DNA鏈替換反應不斷發生，實現了螢光基團不斷被釋放，進而實現了螢光信號不斷被放大。本發明充分利用了級聯的DNA鏈替換反應在信號放大上的能力，最終實現了細胞內miRNA分子的檢測。本發明提供的方法不再需要將miRNA從樣品中分離，而是通過將探針轉染入動物體(或人體)、組織或細胞中，通過對螢光信號的檢測，實現了對體內，或細胞內miRNA分子的檢測，從而能夠更加深入了解miRNA在細胞內調控基因表達的真實信息以及探索miRNA在細胞內的反應的動態過程。為了避免探針在體外就發生鏈替換反應，本發明對4條探針的長度、準粘性末端的長度、互補序列的長度、螢光基團或淬滅基團的位置和種類進行了研究。本發明中，基底鏈順序連接的淬滅基團、準粘性末端和待測microRNA的互補序列；信號鏈與基底鏈互補，信號鏈一端修飾有螢光基團。本發明中，基底鏈上準粘性末端的長度為4bp～5bp。優選的，基底鏈上準粘性末端的長度為5bp。本發明中，信號鏈未修飾螢光基團的一端比基底鏈短5bp～6bp。優選的，信號鏈未修飾螢光基團的一端比基底鏈短6bp。本發明中，淬滅基團為BHQ-1，Dabcyl或BHQ-2；所述螢光基團為FAM或Cy3，Cy-5。基底鏈上比信號鏈長出的部分是待測microRNA的互補序列。以互補序列形成裸露端，有利於鏈替換反應的發生，而實驗表明，6bp的裸露端更有利於發生鏈替換反應，產生螢光的時間短且螢光值較高。在一些實施例中，基底鏈的5』端至3』端依次連接淬滅基團，準粘性末端、與待測microRNA的互補序列。其中，淬滅基團為BHQ-2；準粘性末端的長度為5bp，所述與待測microRNA的互補序列為與待測microRNA全長完全互補的DNA序列。所述準粘性末端的序列不使基底鏈產生二級結構，如髮夾結構。在一些實施例中，信號鏈3』端至5』端依次連接螢光基團、互補準粘性末端和與待測miRNA序列一致的DNA序列。其中，螢光基團為Cy-5；互補準粘性末端的長度為5bp，互補準粘性末端與基底鏈上的準粘性末端完全互補；與待測miRNA序列一致的DNA序列與基底鏈上的相應片段部分互補，該片段與miRNA相比5』端缺少6bp。當待測miRNA與信號鏈和基底鏈形成的雙鏈A發生鏈替換反應後，由miRNA與基底鏈形成的中間體1中，基底鏈上準粘性末端被暴露出來，形成裸露端。本發明實施例中，中間體1中的裸露端的長度為5bp。本發明中，所述保護燃料鏈與待測microRNA互補；所述主導燃料鏈的包括順序連接的待測microRNA序列一致的DNA序列和互補準粘性末端。本發明中，保護燃料鏈的長度為14bp～15bp。優選的，保護燃料鏈的長度為14bp。優選的，保護燃料鏈上與待測microRNA互補的序列長度為13bp，在該序列的5』端添加一個鹼基，以促使鏈替換反應的發生。本發明中，主導燃料鏈上的互補準粘性末端與所述基底鏈上的準粘性末端互補；所述主導燃料鏈上與待測microRNA序列一致的DNA序列長度為17bp～19bp。優選的，所述主導燃料鏈上與待測microRNA序列一致的DNA序列長度為18bp。本發明中，主導燃料鏈與保護燃料鏈形成雙鏈B後，主導燃料鏈的3』端上的互補準粘性末端被裸露出來，該末端與基底鏈上的準粘性末端互補；主導燃料鏈的5』端裸露4bp。在反應過程中，中間體1中基底鏈裸露的準粘性末端與雙鏈B中主導燃料鏈上裸露的互補準粘性末端結合，從而引導鏈替換反應的發生，基底鏈與主導燃料鏈結合形成雙鏈C不再發光。而miRNA和保護燃料鏈則結合，形成中間體2。中間體2中，miRNA的5』端裸露9bp，該裸露部分可以與雙鏈A中基底鏈裸露的部分互補，從而引導鏈替換反應繼續進行。本發明通過合理設計DNA分子探針，使細胞內的待測miRNA能夠觸發級聯的DNA鏈替換反應的發生，進而有效的釋放具有螢光基團修飾的信號鏈，在有限的目標鏈的條件下，兩條燃料鏈組成的雙鏈B的存在能夠最大限度的放大所釋放的具有螢光基團修飾的信號鏈的數目，進而通過雷射共聚焦顯微鏡或者小動物成像儀最終實現在細胞內或者腫瘤組織內miRNA的檢測。且通過合理探針的設計，有效避免了螢光信號的洩露。且探針的設計巧妙的避免了鏈替換反應逆向發生，從而使得鏈替換反應一旦發生，便不再可逆，被釋放出的信號鏈不會再與基底鏈結合。本發明提供的探針依靠鏈替換反應實現螢光信號的級聯放大，由於鏈替換反應的發生條件並不複雜，在細胞、組織或生物體內廣泛的發生。只要引物設計合理，鏈替換反應即可發生。因此，按照本發明提供探針組的形式設計探針，對不同序列的microRNA皆能夠實現檢測。該探針組能夠廣泛的應用於各種microRNA的檢測。但探針中準粘性末端的長度、裸露端的長度、互補序列的長度可能影響螢光信號的產生。本發明提供的探針組基於級聯的DNA鏈替換反應實現細胞內或者腫瘤組織內miRNA檢測，特別是在miRNA分子低表達的細胞或者組織中具有非常好的優勢。解決了在之前的檢測技術中存在檢測體系中信號分子輸出中伴隨著目標鏈損失的巨大困難。檢測的範圍也適用於其他類型的非編碼RNA分子。同樣該技術也是細胞以及其他組織成像中的一種重要手段。本發明提供的探針組能夠用於活體動物體內microRNA的檢測，也可用於培養的細胞內的microRNA的檢測，也可用與離體組織中microRNA的檢測。通過本發明提供的探針，根據轉染後螢光產生的情況，能夠實現對microRNA的絕對定量檢測或相對定量檢測，從而判斷待測品中microRNA的表達情況。根據轉染後螢光產生的位置，也可實現對microRNA分布情況的檢測。並能夠通過多次檢測，實現對miRNA表達隨時間的變化情況的檢測。本發明提供的探針組在製備microRNA的細胞內檢測的產品中的應用。由於現有技術中研究結果表明，多種miRNA的異常表達與癌症相關，故而本申請提供的探針組能夠實現對腫瘤組織的成像，且能夠根據成像情況、位置判斷腫瘤發生的程度和位置。本發明提供的探針組在製備腫瘤組織成像的產品的應用。本發明還提供了一種microRNA的檢測試劑盒，包括本發明提供的探針組。本發明提供的microRNA檢測試劑盒中，還包括轉染試劑。所述轉染試劑為Lipofectamine2000。本發明提供的microRNA檢測試劑盒中，還包括雜交緩衝液。所述雜交緩衝液為濃度為10mmol/L的Tris-HCl緩衝液。Tris-HCl中包括0.3mol/LNaCl和5mmol/LMgCl2，pH值為7.5。本發明提供的microRNA檢測試劑盒中，基底鏈、信號鏈、主導燃料鏈和保護燃料鏈的摩爾比為(0.8～1.2):(0.8～1.2):(2～4):(2～4)。本發明還提供了一種檢測細胞內microRNA的方法，包括：步驟1：將本發明提供的探針組中，所述基底鏈與所述信號鏈雜交形成雙鏈A；所述主導燃料鏈和保護燃料鏈雜交形成雙鏈B；步驟2：將所述雙鏈A與所述雙鏈B轉染待測細胞、組織或動物體後，成像。本發明提供方法中，基底鏈與信號鏈雜交的摩爾比為1∶1。雜交的緩衝液為濃度為10mmol/L的Tris-HCl緩衝液。Tris-HCl中包括0.3mol/LNaCl和5mmol/LMgCl2，pH值為7.5。基底鏈與信號鏈雜交的條件為：90℃保持15min，然後降溫至室溫，室溫下保持不少於2h。優選的，室溫為18℃～30℃。保持時間為2h。雜交後的雙鏈A保存在4℃待用。本發明提供方法中，主導燃料鏈和保護燃料鏈雜交的摩爾比為1∶1。主導燃料鏈和保護燃料鏈雜交的條件為：90℃保持15min，然後降溫至室溫，室溫下保持不少於2h。優選的，室溫為18℃～30℃。保持時間為2h。雜交後的雙鏈A保存在4℃待用。雜交獲得雙鏈A的濃度為10μmol/L；雜交獲得雙鏈B的濃度為20μmol/L。將雜交獲得的雙鏈A溶液和雙鏈B溶液以體積比1:2混合後，加入轉染試劑，然後以雜交緩衝液定容後，複合20min，製得轉染溶液。轉染溶液用於轉染待測樣品。其中，所述轉染試劑為Lipofectamine2000。轉染試劑的用量為雙鏈B溶液體積的1/5。定容至終體積為雙鏈B溶液體積的2倍。最終製得的轉染溶液中，雙鏈A的濃度為2.5μmol/L；雙鏈B的濃度為10μmol/L。轉染後，間隔0.5h～24h檢測螢光信號。對於體外測試實驗，轉染後0.5h～2h螢光信號強度即可達到峰值。而對於注射轉染的動物體，螢光信號需24h左右的時間，在腫瘤組織內富集達到峰值。轉染動物體後，探針組一方面富集於腫瘤組織內，一方面經腎臟和肝臟代謝排出體外。主要經腎臟排出體外。本發明實施例中提供給了一種檢測miRNA-21的探針組，由SEQIDNO：1～4所示核苷酸序列的4條DNA探針組成；其中，SEQIDNO:1所示核苷酸序列的探針的5』端修飾淬滅基團；SEQIDNO:2所示核苷酸序列的探針的3』端修飾螢光基團。其中，SEQIDNO:1所示核苷酸序列的探針為基底鏈；SEQIDNO:2所示核苷酸序列的探針為信號鏈；SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探針為主導燃料鏈；SEQIDNO:4所示核苷酸序列的探針為保護燃料鏈。本發明實施例證明，本發明提供的探針組合相對於其他設計方案而言，能夠在較短時間內使螢光信號達到峰值，且螢光強度更強，螢光信號洩露現象被降低。miRNA-21的過表達與腫瘤密切相關，如乳腺癌、宮頸癌等。由SEQIDNO：1～4所示核苷酸序列的4條DNA探針組成探針組在製備腫瘤組織成像的產品的應用。所述腫瘤為乳腺癌。由MCF-7細胞系構建小鼠乳腺癌模型。miRNA-21檢測試劑盒中包括由SEQIDNO：1～4所示核苷酸序列的4條DNA探針組成探針組、轉染試劑和雜交緩衝液。所述轉染試劑為所述轉染試劑為Lipofectamine2000。所述雜交緩衝液為濃度為10mmol/L的Tris-HCl緩衝液。miRNA-21檢測試劑盒中，基底鏈、信號鏈、主導燃料鏈和保護燃料鏈的摩爾比為(0.8～1.2):(0.8～1.2):(2～4):(2～4)。本發明實施例還提供了一種腫瘤組織成像的方法，包括：步驟a：將SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的探針雜交形成雙鏈A；將SEQIDNO:3～4所示核苷酸序列的探針雜交形成雙鏈B；步驟b：將所述雙鏈A與所述雙鏈B轉染待測組織或動物體後，成像。該實施例中，SEQIDNO:1所示基底鏈與SEQIDNO:2所示信號鏈雜交的摩爾比為1∶1。雜交的緩衝液為濃度為10mmol/L的Tris-HCl緩衝液。Tris-HCl中包括0.3mol/LNaCl和5mmol/LMgCl2，pH值為7.5。SEQIDNO:1所示基底鏈與SEQIDNO:2所示信號鏈雜交的條件為：90℃保持15min，然後降溫至室溫，室溫下保持不少於2h。優選的，室溫為18℃～30℃。保持時間為2h。雜交後的雙鏈A保存在4℃待用。本發明提供方法中，SEQIDNO:3所示主導燃料鏈和SEQIDNO:4所示保護燃料鏈雜交的摩爾比為1∶1。SEQIDNO:3所示主導燃料鏈和SEQIDNO:4所示保護燃料鏈雜交的條件為：90℃保持15min，然後降溫至室溫，室溫下保持不少於2h。優選的，室溫為18℃～30℃。保持時間為2h。雜交後的雙鏈A保存在4℃待用。雜交獲得雙鏈A的濃度為10μmol/L；雜交獲得雙鏈B的濃度為20μmol/L。將雜交獲得的雙鏈A溶液和雙鏈B溶液以體積比1:2混合後，加入轉染試劑，然後以雜交緩衝液定容後，複合20min，製得轉染溶液。轉染溶液用於轉染待測樣品。其中，所述轉染試劑為Lipofectamine2000。所述轉染試劑的用量與雙鏈A的摩爾數或雙鏈B的摩爾數相關。對於小鼠而言，定容體積(總溶液體積)為300μL時，雙鏈A的體積為75μL(濃度為10μmol/L)，則轉染試劑的用量為30μL。最終製得的轉染溶液中，雙鏈A的濃度為2.5μmol/L；雙鏈B的濃度為10μmol/L。所述轉染具體為將轉染溶液通過小鼠尾靜脈注射到小鼠體內。轉染後，間隔24h檢測螢光信號。本發明提供了用於microRNA檢測探針組與microRNA的檢測方法，該探針組設計合理，利用鏈替換反應使得螢光信號得到級聯放大，從而實現了對細胞內miRNA的檢測。該方法無需嚴格的操作條件，操作簡單，特別是在miRNA分子低表達的細胞或者組織中具有非常好的優勢。解決了在之前的檢測技術中存在檢測體系中信號分子輸出中伴隨著目標鏈損失的巨大困難。實驗表明，採用本發明提供的探針對miRNA進行檢測，能夠使螢光信號在1h左右達到最高，且最大程度避免了螢光信號洩露現象的產生。附圖說明圖1示本發明提供探針組的檢測方法原理；圖2示實施例1的實驗結果；圖3示實施例2的實驗結果；圖4示DNA分子探針在MCF-7腫瘤模型中的miRNA-21實施檢測的小鼠組織器官成像圖，其中，雙鏈A濃度為2.5μM，雙鏈B濃度為10μM；圖5示DNA分子探針在MCF-7腫瘤模型中的miRNA-21實施檢測的小鼠組織器官成像圖；雙鏈A濃度為2.5μM，雙鏈B濃度為0μM；圖6示DNA分子探針在MCF-7腫瘤模型中的miRNA-21實施檢測的小鼠組織器官成像圖；雙鏈A濃度為0μM，雙鏈B濃度為0μM；圖7示DNA分子探針在MCF-7腫瘤模型中的miRNA-21實施檢測綜合圖2、圖3和圖4中的小鼠腫瘤組織成像圖。具體實施方式本發明提供了microRNA檢測探針組與microRNA的檢測方法，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和範圍內對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。所述完全互補是指兩條鏈上的鹼基數目相同，其中一條鏈由3』端至5』端與另一條鏈由5』端至3』端能夠全部互補。所述部分互補是指除去末端多出的鹼基，其餘部分完全互補。所述序列一致是指除將U替換為T外，RNA的序列與DNA的序列一致。鏈替換反應即DNA鏈替換反應(stranddisplacementreaction)是指兩條DNA鏈通過完全或者部分配對將先前已雜交的一條或者多條DNA鏈替換掉的過程。在鏈替換反應過程中，複合物(complex)上的單鏈DNA部分與侵入鏈(invadingDNA)上的單鏈DNA區域，通過鹼基配對先結合在一起，然後經由分支遷移(branchmigration)向前無規行走從而將複合物上先前雜交的DNA鏈替換下來。本發明採用的試材皆為普通市售品，皆可於市場購得。本實驗中所使用到的MCF-7的細胞購買於上海中科院細胞庫。所有的初始原料，DNA都從生工(上海)生物工程股份有限公司或者Adamas公司購買，試劑除非說明都沒有再次提純。所有的化學試劑都是分析純或者更高純度的，使用的轉染試劑是Lipofectamine2000(ThermoFisher)，胎牛血清購於ExCell公司。紫外可見分光光度計：Cary300。螢光分光光度計：F-7000(HitachiHigh-TechonologiesCorporationJapan)。螢光顯微鏡：IX71(OlymapusJapan)。雷射共聚焦螢光顯微鏡：LeicaTCSSP5。下面結合實施例，進一步闡述本發明：實施例11、螢光信號檢測實驗分為6組，其中：實驗組1～3採用4條探針進行實驗，而對照組1～3中僅含有3條探針(缺少保護燃料鏈)。實驗探針設計如表1：各組探針中，信號鏈上的螢光基團位於3』端是FAM；基底鏈上的猝滅基團位於5』端是BHQ1。表1各組探針序列基底鏈信號鏈主導燃料鏈保護燃料鏈實驗組1SEQIDNO:1SEQIDNO:2SEQIDNO:3SEQIDNO:4對照組1SEQIDNO:1SEQIDNO:2SEQIDNO:3--實驗組2SEQIDNO:5SEQIDNO:6SEQIDNO:7SEQIDNO:8對照組2SEQIDNO:5SEQIDNO:6SEQIDNO:7--實驗組3SEQIDNO:9SEQIDNO:10SEQIDNO:11SEQIDNO:12對照組3SEQIDNO:9SEQIDNO:10SEQIDNO:11--2、DNA探針的準備：1)、各探針分別溶解在10mMTris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩衝液中，溶液中單鏈的濃度利用260nm波長紫外吸收值進行標定；2)、基底鏈與信號鏈等摩爾濃度混合，在90℃下保持15分鐘，然後再逐漸降溫至室溫，保持室溫進行退火，退火過程超過2小時。獲得雙鏈A，在4℃保存，濃度為100nM；3)、主導燃料鏈和保護燃料鏈等摩爾濃度混合，在90℃下保持15分鐘，然後再逐漸降溫至室溫，保持室溫進行退火，退火過程超過2小時。獲得雙鏈B，在4℃保存，濃度為400nM。4)、以10mMTris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)配製主導燃料鏈的溶液，濃度是20μM待用。3、反應動力學測試實驗組：將4微升濃度為10μM的雙鏈A，8微升濃度為20μM雙鏈燃料鏈(雙鏈B)，溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩衝液至總體積400微升。混合液雜交鏈濃度為100nM，燃料鏈濃度為400nM。對照組：將4微升濃度為10μM的雙鏈A，8微升濃度為20μM單鏈的主導燃料鏈，溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩衝液至總體積400微升。混合液雜交鏈濃度為100nM，燃料鏈濃度為400nM。37℃，反應過程中，每隔一段時間用螢光分光光度儀掃描溶液螢光信號。選取FAM的吸收峰在518nm處的發射波長的螢光強度值為縱坐標，以時間為橫坐標，繪製各組螢光強度隨時間變化曲線。結果如圖2，說明4條探針的組合更有利於降低螢光洩露情況的產生。實施例21、體外模擬miRNA-21的檢測。配置miRNA-21(與miRNA-21序列相同的DNA單鏈)的標準液作為待測樣品，濃度為10μmol/L。實驗分為6組，其中：實驗組1～3採用4條探針進行實驗，而對照組1～3中僅含有3條探針(缺少保護燃料鏈)。實驗探針設計如實施例1中表1：各組探針中，信號鏈上的螢光基團位於3』端是FAM；基底鏈上的猝滅基團位於5』端是BHQ1。2、DNA探針的準備：1)、各探針分別溶解在10mMTris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩衝液中，溶液中單鏈的濃度利用260nm波長紫外吸收值進行標定；2)、基底鏈與信號鏈等摩爾濃度混合，在90℃下保持15分鐘，然後再逐漸降溫至室溫，保持室溫進行退火，退火過程超過2小時。獲得雙鏈A，在4℃保存，濃度為100nM；3)、主導燃料鏈和保護燃料鏈等摩爾濃度混合，在90℃下保持15分鐘，然後再逐漸降溫至室溫，保持室溫進行退火，退火過程超過2小時。獲得雙鏈B，在4℃保存，濃度為400nM。4)、以10mMTris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)配製主導燃料鏈的溶液，濃度是20μM待用。3、反應動力學測試實驗組：將4微升miRNA-21標準液、4微升濃度為10μM的雙鏈A，8微升濃度為20μM雙鏈燃料鏈(雙鏈B)，溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩衝液至總體積400微升。混合液雜交鏈濃度為100nM，燃料鏈濃度為400nM。對照組：將將4微升miRNA-21標準液、4微升濃度為10μM的雙鏈A，8微升濃度為20μM單鏈的主導燃料鏈，溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩衝液至總體積400微升。混合液雜交鏈濃度為100nM，燃料鏈濃度為400nM。反應過程中，每隔一段時間用螢光分光光度儀掃描溶液螢光信號。選取FAM的吸收峰在518nm處的發射波長的螢光強度值為縱坐標，以時間為橫坐標，繪製各組螢光強度隨時間變化曲線。結果如圖3，結果表明，SEQIDNO:1～4的探針組合能夠在更短的時間內獲得更高的螢光值。實施例31、腫瘤模型的建立：將MCF-7(5×106cells/50μL)移植到小鼠左邊腋下(小鼠為母鼠，約4周大小，重約20克)。大約移植2到3周時間可以進行實驗。對模型小鼠體內miRNA-21進行檢測，基底鏈序列(從左到右為5'—3')為：BHQ-2-CACAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA(SEQIDNO：1)；信號鏈的序列(從左到右為5'—3')為：ATCAGACTGATGTTGATTGTG-Cy5(SEQIDNO：2)；主導燃料鏈的序列(從左到右為5'—3')為：TTATCAGACTGATGTTGATTGTG(SEQIDNO：3)；保護燃料鏈的序列(從左到右為5'—3')為：ATCAACATCAGTCT(SEQIDNO：4)。2、DNA探針的準備：1)、各探針分別溶解在10mMTris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩衝液中，溶液中單鏈的濃度利用260nm波長紫外吸收值進行標定；2)、基底鏈與信號鏈等摩爾濃度混合，在90℃下保持15分鐘，然後再逐漸降溫至室溫，保持室溫進行退火，退火過程超過2小時。獲得雙鏈A，在4℃保存；3)、主導燃料鏈和保護燃料鏈等摩爾濃度混合，在90℃下保持15分鐘，然後再逐漸降溫至室溫，保持室溫進行退火，退火過程超過2小時。獲得雙鏈B，在4℃保存；所得雙鏈A濃度為10μM，雙鏈燃料鏈(雙鏈B)DNA濃度為20μM。3、利用商業轉染劑將DNA探針通過小鼠尾靜脈注射到小鼠體內：1)、轉染混合液的準備：實驗組：將75微升濃度為10μM的雙鏈A，150微升濃度為20μM雙鏈燃料鏈(雙鏈B)和30微升商業轉染劑Lipofectamine2000(ThermoFisher)溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩衝液中，最後補加Tris-HCl緩衝液至總體積300微升，複合20分鐘，待用。混合液雜交鏈濃度為2.5μM，燃料鏈濃度為10μM。對照組：將75微升雙鏈A，和30微升商業轉染劑Lipofectamine2000(ThermoFisher)溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩衝液中，最後補加Tris-HCl緩衝液至總體積300微升，複合20分鐘，待用。混合液雜交鏈濃度為2.5μM，燃料鏈濃度為10μM。2)、將複合好的DNA探針通過小鼠尾靜脈注射到小鼠體內。3)、將小鼠正常飼養24小時。4、腫瘤組織成像：將安樂死小鼠，解剖小鼠對小鼠器官以及腫瘤組織成像觀察，選擇被掃描區域，拍攝腫瘤組織圖像。結果如圖4。對比例11、腫瘤模型的建立：將MCF-7(5×106cells/50μL)移植到小鼠左邊腋下(小鼠為母鼠，約4周大小，重約20克)。大約移植2到3周時間可以進行實驗。對模型小鼠體內miRNA-21進行檢測，基底鏈序列(從左到右為5'—3')為BHQ-2-CACAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA(SEQIDNO：1)，信號鏈的序列(從左到右為5'—3')為ATCAGACTGATGTTGATTGTG-Cy5(SEQIDNO：2)，2、DNA探針的準備：1)、各探針分別溶解在10mMTris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩衝液中，溶液中單鏈的濃度利用260nm波長紫外吸收值進行標定；2)、基底鏈與信號鏈等摩爾濃度混合，在90℃下保持15分鐘，然後再逐漸降溫至室溫，保持室溫進行退火，退火過程超過2小時。獲得雙鏈A，在4℃保存；所得雙鏈A濃度為10μM。3、利用商業轉染劑將DNA探針通過小鼠尾靜脈注射到小鼠體內：1)、轉染混合液的準備：將75微升雙鏈A，和30微升商業轉染劑Lipofectamine2000(ThermoFisher)溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩衝液中，最後補加Tris-HCl緩衝液至總體積300微升，複合20分鐘，待用。混合液雜交鏈濃度為2.5μM。2)、將複合好的DNA探針通過小鼠尾靜脈注射到小鼠體內。3)、將小鼠正常飼養24小時。4、腫瘤組織成像：將安樂死小鼠，解剖小鼠對小鼠器官以及腫瘤組織成像觀察，選擇被掃描區域，拍攝腫瘤組織圖像。結果如圖5。對比例21、腫瘤模型的建立：將MCF-7(5×106cells/50μL)移植到小鼠左邊腋下(小鼠為母鼠，約4周大小，重約20克)。大約移植2到3周時間可以進行實驗。對模型小鼠體內miRNA-21進行檢測，2、利用商業轉染劑通過小鼠尾靜脈注射到小鼠體內：1)、轉染混合液的準備：將30微升商業轉染劑Lipofectamine2000(ThermoFisher)溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩衝液中，最後補加Tris-HCl緩衝液至總體積300微升，複合20分鐘，待用。2)、將轉染混合液通過小鼠尾靜脈注射到小鼠體內。3)、將小鼠正常飼養24小時。3、腫瘤組織成像：將安樂死小鼠，解剖小鼠對小鼠器官以及腫瘤組織成像觀察，選擇被掃描區域，拍攝腫瘤組織圖像。結果如圖6。以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。SEQUENCELISTING中國科學技術大學microRNA檢測探針組與microRNA的檢測方法MP162083912PatentInversion3.3127DNA人工序列1cacaatcaacatcagtctgataagcta27221DNA人工序列2atcagactgatgttgattgtg21323DNA人工序列3ttatcagactgatgttgattgtg23414DNA人工序列4atcaacatcagtct14527DNA人工序列5cacaatcaacatcagtctgataagcta27621DNA人工序列6atcagactgatgttgattgtg21722DNA人工序列7tatcagactgatgttgattgtg22814DNA人工序列8atcaacatcagtct14926DNA人工序列9ccaatcaacatcagtctgataagcta261021DNA人工序列10tatcagactgatgttgattgg211123DNA人工序列11cttatcagactgatgttgattgg231215DNA人工序列12tcaacatcagtctga15當前第1頁1 2 3