一種用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒的製作方法

2023-04-24 19:07:51

一種用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒，其特徵在於，包含GP73捕獲抗體溶液、生物素標記的AAL、用於形成GP73抗體-抗原-生物素標記AAL複合物並進行ELISA檢測的AAL-ELISA檢測板和用於形成GP73抗體-抗原-生物素標抗體複合物並進行ELISA檢測的Protein-ELISA檢測板。本發明所述的方法及試劑盒具有高通量性，較高特異性，檢測快速準確等突出優點，對肝癌的診斷具有重要的臨床價值。
【專利說明】一種用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑
1111

【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫學領域，與應用性基礎醫學研宄和臨床研宄相聯繫；涵蓋腫瘤學、診斷學，糖生物學。

【背景技術】
[0002]肝細胞性肝癌(--是一種多基因、多因素、病理機制複雜的常見惡性腫瘤。在我國，B肝病毒攜帶者佔人口的7.18 %，是全世界B肝攜帶者的2/3，肝病發病率仍居全球之首，全球50%以上的年新增肝癌病例發生在我國。絕大多數患者發病隱匿，出現臨床症狀後就醫時已屬晚期，喪失了治療的良機，因此早期診斷對於提高患者的生存率至關重要。理想的肝癌標誌物需要有較高的特異性，能夠將肝癌與肝硬化、肝炎、肝臟再生結節等疾病區分開來；同時還需較高的敏感性，能夠在肝癌早期即提示診斷，同時應具有易檢測、可重複、可經非侵入性操作測定等特點。
[0003]在蛋白質不同的翻譯後修飾中，糖基化最為常見，幾乎50%的蛋白質都被認為具有糖基化修飾。糖蛋白聚糖存在著宏觀和微觀的不均一性，其結構功能變化和與疾病發生發展有著密切的聯繫。聚糖在很多關鍵的生物學過程中起到重要作用，比如細胞黏附、分子運輸和清除、受體激活、信號轉導以及內吞作用等。在生物體發育過程中，聚糖結構也在變化，在不同的分化階段，聚糖有不同的表達。在癌症的發生過程中，糖基化的改變是普遍存在的，如能關注糖基化的變化，可以提升診斷的特異性和敏感性。因此，利用檢測糖蛋白聚糖結構的異常來診斷惡性腫瘤已引起相當重視，如八---13的變化已成為檢測肝癌的重要聚糖標誌等。目前檢測糖蛋白聚糖結構變化的技術方法有生物質譜、液相色譜和植物凝集素親和印跡等，其中植物凝集素是一類存在於多數植物中的糖蛋白，其最大特點是能夠識別糖蛋白和糖脂中的聚糖，特別是細胞膜中複雜結構的聚糖即細胞膜表面決定簇，它們與聚糖的結合是非共價且可逆的。…楊樹茹凝集素)是一種親和0連接巖藻糖(161-11111181 3 ？110和土…-匕51)的植物凝集素，巖藻糖修飾能賦予聚糖很多獨特的功能特性，其在輸血反應、凝集素介導的白細胞和內皮的粘附、宿主和微生物相互作用和個體發育等方面發揮重要作用。此外，巖藻糖還參與構成某些重要粘附分子的聚糖結構，與腫瘤轉移關係密切。在癌症中發現81071[冊18 3含量增多，許多腫瘤中4和8型血型抗原丟失伴隨著0血型抗原和16*187表達升高。
[0004]高爾基體蛋白73((^73)是一種高爾基體II型膜蛋白，表達於上皮細胞，是一種糖蛋白，包含3個潛在.糖基化位點:八811109，八811144和八811398。隨著糖生物學技術的發展，已有研宄證實將⑶73的巖藻糖基化異質體在某些肝癌患者中作為標誌物進行檢測會優於⑶73。在前期工作中，發現相比於肝硬化患者，肝癌患者血清單位⑶73親和歐能力顯著降低，說明肝癌患者的單位⑶73巖藻糖基化聚糖含量降低。本發明應用對巖藻糖化聚糖的高親和性，通過…和？1~0仏111-此的製備與檢測，分別形成⑶73抗體-抗原-生物素標複合物和⑶73抗體-抗原-生物素標抗體複合物，獲得⑶73結合八八I的吸光度與⑶73蛋白的吸光度比值？11(3-⑶73，通過對臨床資料進行回顧性研宄，建立腫瘤判別診斷函數，獲得80(:曲線和0打值，同時比較八---13和[110-(^73對肝癌診斷的準確率差異。本發明適用於肝癌高發現場或者肝病人群大規模篩查，對於提高肝癌的診斷率，實現早期幹預治療，降低肝癌病死率具有非常重要的意義。


【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種具有較高準確率的用於診斷肝細胞性肝癌(--的試劑盒。
[0006]為了達到上述目的，本發明提供了一種用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒，其特徵在於，包含⑶73捕獲抗體溶液、生物素標記的?VI用於形成⑶73抗體-抗原-生物素標記歐複合物並進行此13八檢測的…檢測板和用於形成⑶73抗體-抗原-生物素標抗體複合物並進行￡[13八檢測的？1~0丨6111-211「檢測板。
[0007]優選地，所述的八從-此檢測板的預處理方法為:在八從-此檢測板中加入6？73捕獲抗體，—1-211「中即73捕獲抗體濃度為1 V 用量為100 V 1?611，室溫孵育過夜；採用？831緩衝液洗板；採用含有3 % 8「(質量-體積濃度)的？83溶液進行封閉，用量為200 V 1/^611採用？831緩衝液洗板；採用邱4.0的含有100禮版1104和50禮檸檬酸的溶液進行氧化，用量為200 V 1/^611，41:避光反應111 ；採用？831緩衝液洗板，得到預處理後的…此1「檢測板。
[0008]優選地，所述的八檢測板的預處理方法為:在？1*01:6111-1^13八檢測板中加入即73捕獲抗體，^1-0^6111-2118^中即73捕獲抗體濃度為2 V 匕用量為100 V 1/%11，室溫孵育過夜；採用？831緩衝液洗板；採用含有(質量-體積濃度)和0.05%版為(質量-體積濃度)的？83溶液進行封閉，用量為200 V 1/^611 ；採用？831緩衝液洗板；採用含有1 % 8「(質量-體積濃度)和0.05 %似吧(質量-體積濃度)的？83溶液進行氧化，用量為200 ^17冊11，41:避光反應1卜；採用？831緩衝液洗板，得到預處理後的？1~01:6111-2118^ 檢測板。
[0009]優選地，所述的6？73捕獲抗體溶液共有兩種，濃度分別為1 V 和2 V 。
[0010]優選地，所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒還包括生物素標記的⑶73抗體。
[0011]優選地，所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒還包含含有3 % 83八的？88溶液，含有1 % 83八和0.05 %版為的？88溶液，邱4.0的含有100應&10 4和50禮檸檬酸的溶液。
[0012]優選地，所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒還包括？881緩衝液。
[0013]優選地，所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒還包括辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素(冊?。
[0014]優選地，所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒還包括底物溶液和終止液。
[0015]優選地，所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒還包含採集血樣裝置及操作說明書。
[0016]本發明中提及的(^73蛋白由前期糖蛋白質組學工作確定單位(^73親和…^能力顯著降低，說明肝癌患者的單位⑶73巖藻糖基化聚糖含量減少。
[0017]本發明主要是建立並優化八從-此和方法，確定最優的捕獲抗體濃度、血清樣品的上樣量、凝集素濃度和檢測抗體濃度；並選擇合適的…封閉劑和氧化劑。排除⑶73抗體與其它抗原的交叉反應，確立八從-此和？1~0丨6111-此13八對6？73的檢測範圍和重複性，構建可用於臨床血清樣品篩查的半定量檢測系統。
[0018]如圖1所示，本發明通過八從-此13八和的製備，聯合併行分析血清中⑶73的巖藻糖和蛋白的表達水平，用於肝癌和肝硬化病人血清中單位⑶73蛋白中結合巖藻糖的含量$110-(^73)的定量檢測。並根據？1^4？73的檢測數據和臨床資料的回顧性研宄，建立腫瘤判別診斷函數可用於原發性肝細胞肝癌的早期診斷。
[0019]與現有技術相比，本發明的有益效果是:
[0020]本發明通過八從(楊樹茹凝集素)-此和的製備與檢測，分別形成抗體-抗原-生物素標複合物和抗體-抗原-生物素標抗體複合物，以6？73結合八八I的吸光度(00值)與即73蛋白的吸光度比值作為衡量單位即73蛋白中結合巖藻糖的含量$11(3-(^73),通過對臨床資料進行回顧性研宄，建立腫瘤判別診斷函數，獲得受試者工作曲線￠00以及判別⑴此0打)值，該函數對於!1(1:的診斷靈敏度和特異度分別為73.9%和65.4%，^0為0.801，優於甲胎蛋白.聚糖核心巖藻糖(他?-!^)。本發明所述的方法及試劑盒具有高通量性，較高特異性，檢測快速準確等突出優點，對肝癌的診斷具有重要的臨床價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為高通量[110-(^73檢測系統原理示意圖；
[0022]圖2為線性檢測範圍圖；
[0023]圖3為1^-(^73和他?-13檢測系統分別構建80(:曲線圖；

【具體實施方式】
[0024]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
[0025]實施例
[0026]一種用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒，其組成為:
[0027]1、？110~6？73半定量檢測此板，所述的1^-(^73半定量檢測此板由用於形成即73抗體-抗原-生物素標記複合物並進行此13八檢測的…檢測板和用於形成6？73抗體-抗原-生物素標抗體複合物並進行此13八檢測的？1~0丨6111-此13八檢測板組成。
[0028]2、6？73捕獲抗體溶液，其濃度分別為1 V 和2 V ^1(由汕腦代公司製備，？88溶液稀釋)。
[0029]4、含有 3% 83八的？88 溶液(3% 83八 111 ？83，邱7.2-7.4)。
[0030]5、含有 1 % 83八和 0.05 % 版^3的？83 溶液(1 % 88^,0.05 % 3111 ？83，邱7.2-7.4)。
[0031]6、含有 100禮似104和 50禮檸檬酸的溶液(100^ ^10 50111101^10 ￡^1(1，邱4.0)。
[0032]7、生物素標記的八從溶液，濃度為1 V ^60^01-公司，9^0(111(3^18-1395, ？881緩衝液稀釋)。
[0033]8、生物素標記的即73抗體溶液，濃度為2 V ^1(由廣州生物醫藥與健康研宄院提供
[0034]9、冊？-81^61)1:8^1(1111 (1116:0110 8016111:1^10, ^1-0(11101:^ 100)0
[0035]10、採集血樣裝置及操作說明書。
[0036]11、？881 緩衝液(0.05 % 1^66=20111 ？83，邱7.2-7.4)。
[0037]12、底物溶液:3，3 7 ,5,5 ；-四甲基聯苯胺(118)溶液，雙氧水溶液￠0嫩
0101:6011 1110.^1^0(11101:^1(0331002) 0
[0038]13、終止液；觀！！2804
[0039]上述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒的使用方法為:
[0040]( 一板和？1~0忱111-此1 「 板的預處理:
[0041]1、取兩塊乩板，分別用作八從-此板和？1~0仏111-211「板；
[0042]2、捕獲抗體:在八從-此板和板中分別加入⑶73捕獲抗體，
中 6？73 捕獲抗體濃度為 1 V 8/此，100 V 1/^611 ；？1~0^6111~2118^ 中 6？73 捕獲抗體濃度為2 V 100 V 1/^6110室溫孵育過夜。
[0043]3、洗板:採用？83丁緩衝液(0.05% 1^66=20111 ？83，邱7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡2分鐘，300 V 17*611，甩幹，並在吸水紙上輕拍將孔內液體拍幹。
[0044]4、封閉:魈[-此1 「板採用含有 3% 88^ 的？83 溶液(3% 88^ 111 ？83，邱7.2-7.4)進行封閉，室溫封閉1卜，用量為200 ^17冊11 ；？1~0仏111-此採用含有1 % 8「和0.05%關3的？88溶液(1% 88^,0.05%關「11 ？83，邱7.2-7.4)進行封閉，室溫封閉1卜，用量為
200V1/^6110
[0045]5、洗板:採用？831 緩衝液(0.05% 1^661120111 ？83，邱7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡2分鐘，300 V 17*611，甩幹，並在吸水紙上輕拍將孔內液體拍幹。
[0046]6、氧化:八從-此板採用邱4.0的含有100禮似104和50禮檸檬酸的溶液(1001111 他 104，501111 011:1-10 801(1, 1)? 4.0)進行氧化，用量為 200 V 1/^611，4。〇避光反應111 ；？1~0七6111-此13八採用含有1% 83八和0.05%版^3的？88溶液(1% 88^,0.05%關辦？83，邱7.2-7.4)進行氧化，4X:避光反應比，200 V 17冊11。
[0047]7、洗板:採用？881 (0.05% 1^661120111 ？83，邱7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡 2 分鐘，300 V 17冊11，甩幹，並在吸水紙上輕拍將孔內液體拍幹，分別得到處理後的…^4113八板和？1~01:6111-2113八板，用於下述步驟。
[0048]( 二)1^-(^73半定量檢測此檢測方法:
[0049]1、採樣:通過採集血樣裝置採集血樣，抽取靜脈血5「，每份標本均無溶血、月旨血。371:靜置一小時，3000印111離心300111後上清即為所需血清，-701:分裝凍存(10(^1/1:11)36)。
[0050]2、加樣:八從-此板加入血清樣品100 V 1/^11 ；？1~0^6111-2118^板加入稀釋後血清樣品100上1/^611 (採用？83，邱7.2-7.41.4倍稀釋至100^1)，室溫2匕。
[0051]3、洗板:採用？881 (0.05% 1^661120111 ？83，邱7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡 2 分鐘，300 V 17*611，甩幹，並在吸水紙上輕拍將孔內液體拍幹。
[0052]4、檢測試劑規-乩13八板中加入1 V邑/此生物素標記的撒(^881稀釋)；^1-0^6111-2118^板中加入生物素標記的抗體2 V ^/1111(^88稀釋)，100 V 17冊11，室溫2匕。
[0053]5、洗板:採用？881 (0.05% 1^66=20111 ？83，邱7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡 2 分鐘，300 V 17*611，甩幹，並在吸水紙上輕拍將孔內液體拍幹。
[0054]6、酶結合物工作液:八從-2113八板中加入冊?(米用3 % 83八111？88^ ^7.2-7.4,1: 12500 稀釋)；？1~0忱111-此1「 板中加入冊？-8釷6的(採用 1 %83八 111 ？88^ ^7.2-7.4,1: 12500 ^^),100 1^/^611,^^301111110
[0055]7、洗板:採用？881 (0.05% 1^66=20111 ？83，邱7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡 2 分鐘，300 V 17*611，甩幹，並在吸水紙上輕拍將孔內液體拍幹。
[0056]8、加底物溶液，所述的底物溶液由3，37，5，57 -四甲基聯苯胺(118)溶液和的雙氧水溶液按照體積比為1: 2混合而成，100 V 17^611，室溫20111111。
[0057]9、加終止液:100 V 18^0？ 3011^1011/^611，終止液的加入順序與底物溶液的加入順序相同。
[0058]10、檢測:立即用版11100皿社1200 (邛「⑷酶標儀在450咖波長測量各孔的00值。應提前打開酶標儀電源，預熱儀器，設置好檢測程序。
[0059](三)？110~6？73半定量檢測此分析方法:
[0060]1、數據:每個血清樣品的00值應減去空白孔的00值為實際00值。每個血清樣品即73結合八從的實際00值與此相同血清樣品即73蛋白的實際00值(^1-0^6111-2118^)比值即為值。
[0061]採用軟體回歸分析建立的上述預測模型進行檢測區分肝癌和肝硬化的0打值為3.9433。按照上述預測模型計算？值，將？值與0打值比較，? 3.9433為肝硬化，? 3.9433為肝癌。
[0062]採用實施例中的試劑盒和檢測方法，分析49例肝病血清樣品(肝硬化26例和肝癌患者23例，均經臨床確診)中即73的巖藻糖和蛋白的表達水平，計算得到含量。同時使用他?-13檢測試劑盒(他?-13檢測試劑盒購自汕110妨公司(01^110^1^1187)和其操作說明中的檢測方法，檢測上述49例肝病血清樣品中八---13含量，採用軟體獲得80(:曲線。比較本發明試劑盒和八---13對肝癌診斷的靈敏性和特異性，結果如圖3所示，本發明試劑盒的靈敏度為73.9%，特異度65.4%，如?0為0.801，而他?-13對的診斷靈敏度為69.6 %，特異度為69.2 %，皿為0.701。因此，本發明具有較高敏感性，對肝癌的預測具有重要臨床價值。
[0063]採用1*6(30111131的111: 6？73標準品進行倍比稀釋，確定？1~01:6111-2113八線性檢測範圍。結果如圖2所示，？1~01:6111-2118^的定量線性檢測範圍為0?500000呢加1。
【權利要求】
1.一種用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒，其特徵在於，包含GP73捕獲抗體溶液、生物素標記的AAL、用於形成GP73抗體-抗原-生物素標記AAL複合物並進行ELISA檢測的AAL-ELISA檢測板和用於形成GP73抗體-抗原-生物素標抗體複合物並進行ELISA檢測的Protein-ELISA檢測板。
2.如權利要求1所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒，其特徵在於，所述的AAL-ELISA檢測板的預處理方法為:在AAL-ELISA檢測板中加入GP73捕獲抗體，AAL-ELISA中GP73捕獲抗體濃度為lyg/mL，用量為100 μ L/well，室溫孵育過夜；採用PBST緩衝液洗板；採用含有3% BSA的PBS溶液進行封閉，用量為200 μ L/well ;採用PBST緩衝液洗板；採用pH 4.0的含有10mM似104和50mM檸檬酸的溶液進行氧化，用量為200 μ L/well，4°C避光反應Ih ;採用PBST緩衝液洗板，得到預處理後的AAL-ELISA檢測板。
3.如權利要求1所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒，其特徵在於，所述的Protein-ELISA檢測板的預處理方法為:在Protein-ELISA檢測板中加入GP73捕獲抗體，Protein-ELISA中GP73捕獲抗體濃度為2 μ g/mL，用量為100 μ L/well，室溫孵育過夜；採用PBST緩衝液洗板；採用含有1% BSA和0.05%似乂的PBS溶液進行封閉，用量為200 μ L/well ;採用PBST緩衝液洗板；採用含有I % BSA和0.05%似乂的PBS溶液進行氧化，用量為200 μ L/well，4°C避光反應Ih ;採用PBST緩衝液洗板，得到預處理後的Protein-ELISA 檢測板。
4.如權利要求1所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒，其特徵在於，所述的GP73捕獲抗體溶液共有兩種，濃度分別為I μ g/mL和2 μ g/mL。
5.如權利要求1所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒，其特徵在於，所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒還包括生物素標記的GP73抗體。
6.如權利要求1所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒，其特徵在於，所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒還包含含有3% BSA的PBS溶液，含有I % BSA和0.05 % NaN3的PBS溶液，pH 4.0的含有10mMNa1 4和50mM檸檬酸的溶液。
7.如權利要求1所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒，其特徵在於，所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒還包括PBST緩衝液。
8.如權利要求1所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒，其特徵在於，所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒還包括辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素。
9.如權利要求1所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒，其特徵在於，所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒還包括底物溶液和終止液。
10.如權利要求1所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒，其特徵在於，所述的用於肝癌血清學預測的高爾基體蛋白73異質體試劑盒還包含採集血樣裝置及操作說明書。
【文檔編號】G01N21/31GK104483484SQ201410816433
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月19日 優先權日:2014年12月19日
【發明者】張舒, 郭坤, 劉銀坤 申請人:復旦大學附屬中山醫院