快速檢測麥角生物鹼的膠體金檢測卡及其製備方法
2023-04-24 18:26:41
專利名稱：快速檢測麥角生物鹼的膠體金檢測卡及其製備方法
技術領域：
本發明涉及ー種快速檢測麥角生物鹼的膠體金檢測卡的製備方法。
背景技術：
麥角是麥角菌在寄生植物的子房中形成的紫黒色、具有真菌結構的長角形菌核，形狀像動物的角，故稱麥角(ergot)。其宿主多為禾本科植物。世界範圍內種植的小麥、玉米、大麥、水稻、穀子、燕麥、高粱、黑麥等均可被麥角菌侵染。麥角中毒是由於受麥角菌侵染穀物中的一系列有活性的生物鹼引起的。麥角菌毒素的有毒成分主要是以麥角酸為基本結構的一系列生物鹼衍生物，如麥角毒鹼(ergotoxin)、麥角胺(ergotamine)、麥角新鹼(6找0]10￥；[116)、麥角生鹼(6找08；[116)、麥角克鹼(6找001^81；[116)等。麥角鹼是ー類物質的總稱，醫學上常用來收縮子宮、促進產程、治療偏頭痛及高血壓等。另ー方面麥角也是穀類 作物的重要病害，不但能引起穀物減產，而且當人們食用了混雜有較大量的麥角穀物或麵粉所做的食品後，就可能發生麥角菌中毒。因此，對麥角的檢測顯得尤為重要。目前，有關麥角的檢測大都採用感官檢驗以及化學定性分析。但對於已經研磨或某種處理使得菌核難於或不能辨認的穀物，就必須進行麥角生物鹼含量的測定。一般情況下，通過HPLC定量測定生物鹼含量，該方法具有很好的靈敏度和特異性，但操作繁瑣、耗時長，不用適於對大批量樣品的檢測，且需要昂貴的儀器設備，檢測成本高，而且要求操作人員具有一定的專業知識才能進行操作，因此應用範圍受限；膠體金免疫層析檢測技術是ー種快速免疫診斷技木，利用膠體金作為標記物，短時間(10 min之內)便可得到直觀的結果，它不須進行未反應結合物與已反應結合物的分離，省去了繁瑣的加樣、洗滌步驟，操作過程簡便快速，特異性和靈敏度也較高，檢測成本也較其他方法低，可以實現真正的一歩法快速檢測，非專業人士也能進行操作，符合現代分析檢測技術發展的方向。
發明內容
本發明的目的在於提供一種能夠滿足現場檢測的需要，檢測快速，攜帯方便，操作簡單的快速檢測麥角生物鹼的膠體金檢測卡及其製備方法。本發明的技術解決方案是
ー種快速檢測麥角生物鹼的膠體金檢測卡，其特徵是包括試紙條，所述試紙條封裝於檢測卡殼體中，所述檢測卡殼體上開有加樣孔和觀測孔；所述試紙條包括底板，底板上依次設置有吸水紙、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜及樣品墊；玻璃纖維膜浸潰有膠體金標記的麥角生物鹼抗體，所述硝酸纖維膜上噴塗有包被抗原麥角酸-OVA和羊抗兔抗體兩條線。在硝酸纖維素膜的兩端結合處，分別有吸水紙和玻璃纖維膜的一小段重疊壓在硝酸纖維素膜上。所述吸水紙的長度為30_，所述硝酸纖維膜的長度為25_，所述玻璃纖維膜的長度為O. 5mm,所述樣品墊的長度為15mm。ー種快速檢測麥角生物鹼的膠體金檢測卡的製備方法，其特徵是包括以下步驟
(1)以幾種麥角生物鹼的共有結構——麥角酸偶聯鑰孔嘁血藍蛋白及麥角酸偶聯卵清蛋白，分別製備人工免疫抗原和包被抗原；
(2)用上述免疫抗原免疫紐西蘭大白兔，製備抗麥角生物鹼多克隆抗體；
(3)製備膠體金標記抗麥角生物鹼特異性抗體探針；
(4)麥角生物鹼膠體金檢測卡的製備將包被抗原及羊抗兔抗體分別均勻噴塗於硝酸纖維素膜上，從而形成檢測線和質控線；將玻璃纖維膜浸泡於膠體金標記的麥角生物鹼抗體中，取出，乾燥；組裝麥角生物鹼膠體金免疫試紙，該試紙條自下至上依次包括樣品墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、吸水紙四部分，最後將試紙條封裝於檢測卡殼體中，檢測卡殼 體上開有加樣孔和觀測孔。本發明中快速檢測麥角生物鹼的膠體金檢測卡，攜帯方便，操作簡便，能夠現場半定量檢測原糧及其製品中麥角生物鹼的含量，且檢測準確率高、特異性強，使麥角生物鹼的檢測不再局限於專業機構的專業人員，各個禽畜養殖場、糧食收購站、各級檢驗檢疫部門及消費者均可即時進行檢驗。
下面結合附圖和實施例對本發明作進ー步說明。圖I是本發明檢測卡檢測結果示意 圖2為試紙條的結構示意 圖3為圖2的側視圖。
具體實施例方式見圖I、圖2，ー種快速檢測麥角生物鹼的膠體金檢測卡，其包括檢測卡殼體I和試紙條2，試紙條2封裝於檢測卡殼體I中，檢測卡殼體I上開有加樣孔3和觀測孔4，試紙條2包括底板5，試紙條2的底板5上依次粘貼有吸水紙6、硝酸纖維素膜7、玻璃纖維膜8、樣品墊9，吸水紙6和玻璃纖維膜8分別粘貼在硝酸纖維素膜7兩側，在硝酸纖維素膜7的兩端結合處，吸水紙6和玻璃纖維膜8的一小段重疊壓在硝酸纖維素膜7上，樣品墊9粘貼在玻璃纖維膜8的另ー側，樣品墊9的一小段重疊在玻璃纖維膜8上；玻璃纖維膜8上噴塗有金標抗麥角生物鹼多克隆抗體；硝酸纖維素膜7上依次噴塗有材質為麥角酸-OVA的檢測線
10、材質為羊抗兔抗體的質控線11。實施例I :完全抗原的製備
麥角酸-鑰孔嘁血藍蛋白(麥角酸-KLH)及麥角酸-卵清蛋白(麥角酸-0VA)的製備①75 85 mg麥角酸溶於10 mL熱的ニ氧六環，然後加入到100 120 mg碳ニ亞胺(EDC)水溶液(5 mL)中。②2(T40mg鑰孔嘁血藍蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA)溶於10 mL PBS，逐滴加入上一歩製成的混合液中。③室溫攪拌10小時後，4°C過夜保存。再用PBS透析2天，分別得到麥角酸-鑰孔嘁血藍蛋白(麥角酸-KLH)及麥角酸-卵清蛋白(麥角酸-0VA)，冷凍乾燥後_20°C保存備用。實施例2 :抗麥角生物鹼多克隆抗體的製備及純化
用實施例I中所獲得的免疫抗原(麥角酸-KLH)免疫三隻健康雄性紐西蘭大白免。免疫前一周從兔耳緣靜脈採血作為陰性對照。稱取Img麥角酸-KLH，用2mL O. lmol/L的PBS(經高壓滅菌)溶解，然後取ImL溶解的抗原與ImL完全弗氏佐劑充分混合，乳化完全後在紐西蘭大白兔背部進行多點皮下注射。I個月後進行第I次加強免疫，採用四肢內部肌肉注射，劑量與首次免疫相同，與等量不完全弗氏佐劑混合充分乳化。共免疫5次，毎次間隔2周。毎次加強免疫前從兔耳緣靜脈採血，採用間接ELISA法測定抗血清效價。效價合格後，採用兔頸動脈放血，分離抗血清，並採用Protein A親和純化多克隆抗體,冷凍乾燥後於-20°C保存備用。實施例3 :膠體金溶液的製備
用新制雙蒸水配製100 mL 0.01%氯金酸溶液，置於錐形瓶中，用恆溫電磁攪拌器加熱至沸(110°C左右)，在100 r/min磁力攪拌下，迅速加入預先在37°C保溫的1%檸檬酸三鈉溶液4. 5 mL，保持溫度和轉速不變，繼續攪拌加熱15 min左右，直至溶液呈現清亮的酒紅色；室溫冷卻，4 °C冰箱保存備用。 實施例4 :膠體金標記抗麥角生物鹼多克隆抗體探針的製備
取30 mL膠體金溶液加於50 mL離心管中，用O. I M K2CO3或O. I M HCl調節pH至
7.5左右，用鋁箔紙包住離心管，輕輕振蕩；邊振蕩邊逐滴加入3 mL含250 μ g抗體蛋白的蛋白溶液，繼續振蕩20 min左右；逐滴加入1.5 mL 1%BSA溶液以飽和游離的膠體金，然後於4°C，9000 rpm，離心45 min ;離心後取出離心管，將上清液輕輕吸掉一部分後，用移液槍將管底沉澱小心吸至I. 5 mL離心管中，4°C保存備用。實施例5 :硝酸纖維素膜的處理
用金標點樣儀噴塗兩條平行線於硝酸纖維素膜上，麥角酸-OVA作為檢測線，羊抗兔抗體作為質控線，置37°C真空乾燥後備用。實施例6 :玻璃纖維膜的處理
將玻璃纖維膜浸泡於膠體金標記抗麥角生物鹼多克隆抗體中，取出，置37°C真空乾燥後備用。實施例7 :膠體金測試卡的組裝
取製作試紙條專用的底板，先將乾燥好的硝酸纖維素膜粘貼在相應位置，再將吸水紙和乾燥好的玻璃纖維膜粘貼在相應位置並稍微壓住硝酸纖維素膜，最後將樣品墊粘好並壓住玻璃纖維膜，用切條機切割成3 _寬的試紙條裝入檢測卡中，此時，樣品墊的位置正對檢測卡的加樣孔、硝酸纖維素膜位置正對檢測卡的觀測孔，與乾燥劑一起裝入鋁箔袋中，密封包裝。實施例7 :麥角生物鹼膠體金測試卡的使用
對樣品進行檢測時，將檢測卡平放，取100 μ L樣夜滴入加樣孔3，在15 min內觀察結果。羊抗兔抗體和麥角酸-OVA分別噴塗在硝酸纖維素膜的質控線11 (C)和檢測線10(T)，含麥角生物鹼的待側樣品經樣品墊9根據層析原理向另一端移動，井先後經過質控線11和檢測線10，固化在玻璃纖維膜8上的膠體金標記抗麥角生物鹼多克隆抗體與樣品中的麥角生物鹼起特異性反應，並競爭抑制其與檢測線10上的包被抗原結合，因此，當樣品中不含麥角生物鹼或其含量低於某ー限值時，玻璃纖維膜8上的膠體金標記抗麥角生物鹼多克隆抗體與檢測線10上的麥角酸-OVA反應呈現紅色條帯，質控線也呈現紅色條帶。反之，當樣品中的麥角生物鹼含量超過某ー限值時，則玻璃纖維膜8上的膠體金標記麥角鹼多克隆抗體位點結合完全，當膠體金顆粒層析經過檢測線10 (含麥角酸-OVA)時，將不會停留，繼續層析上行，與質控線11上噴塗的羊抗兔抗體反應，呈現出膠體金的紅色條帯。如試紙條上僅檢測線10上出現一條紅色條帶則判定為陽性；如檢測線10和質控線11均出現兩條紅色 條帶則為陰性；若質控線11不出現紅色條帶，無論檢測線10是否出現，測試結果均無效。
權利要求
1.ー種快速檢測麥角生物鹼的膠體金檢測卡，其特徵是包括試紙條，所述試紙條封裝於檢測卡殼體中，所述檢測卡殼體上開有加樣孔和觀測孔；所述試紙條包括底板，底板上依次設置有吸水紙、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜及樣品墊；玻璃纖維膜浸潰有膠體金標記的麥角生物鹼抗體，所述硝酸纖維膜上噴塗有包被抗原麥角酸-OVA和羊抗兔抗體兩條線。
2.根據權利要求I所述的ー種快速檢測麥角生物鹼的膠體金檢測卡，其特徵是在硝酸纖維素膜的兩端結合處，分別有吸水紙和玻璃纖維膜的一小段重疊壓在硝酸纖維素膜上。
3.根據權利要求I或2所述的ー種快速檢測麥角生物鹼的膠體金檢測卡，其特徵是所述吸水紙的長度為30_，所述硝酸纖維膜的長度為25_，所述玻璃纖維膜的長度為.O.5mm,所述樣品墊的長度為15mm。
4.ー種快速檢測麥角生物鹼的膠體金檢測卡的製備方法，其特徵是包括以下步驟 (O以幾種麥角生物鹼的共有結構——麥角酸偶聯鑰孔嘁血藍蛋白及麥角酸偶聯卵清蛋白，分別製備人工免疫抗原和包被抗原； (2)用上述免疫抗原免疫紐西蘭大白兔，製備抗麥角生物鹼多克隆抗體； (3)製備膠體金標記抗麥角生物鹼特異性抗體探針； (4)麥角生物鹼膠體金檢測卡的製備將包被抗原及羊抗兔抗體分別均勻噴塗於硝酸纖維素膜上，從而形成檢測線和質控線；將玻璃纖維膜浸泡於膠體金標記的麥角生物鹼抗體中，取出，乾燥；組裝麥角生物鹼膠體金免疫試紙，該試紙條自下至上依次包括樣品墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、吸水紙四部分，最後將試紙條封裝於檢測卡殼體中，檢測卡殼體上開有加樣孔和觀測孔。
全文摘要
本發明公開了一種快速檢測麥角生物鹼的膠體金檢測卡及其製備方法，試紙條封裝於檢測卡殼體中，檢測卡殼體上開有加樣孔和觀測孔；所述試紙條包括底板，底板上依次設置有吸水紙、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜及樣品墊；玻璃纖維膜浸漬有膠體金標記的麥角生物鹼抗體，所述硝酸纖維膜上噴塗有包被抗原麥角酸-OVA和羊抗兔抗體兩條線。本發明檢測卡，攜帶方便，操作簡便，能夠現場半定量檢測原糧及其製品中麥角生物鹼的含量，且檢測準確率高、特異性強，使麥角生物鹼的檢測不再局限於專業機構的專業人員，各個禽畜養殖場、糧食收購站、各級檢驗檢疫部門及消費者均可即時進行檢驗。
文檔編號G01N33/543GK102707047SQ201210182138
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月5日 優先權日2012年6月5日
發明者匡群, 周鳴鏑, 張東升, 張海濤, 楊婷婷, 邵彪, 陳剛, 黃偉東, 龔燕 申請人:南通市產品質量監督檢驗所, 江蘇省蘇微微生物研究有限公司