門冬胰島素前體基因的優化及其高效表達的製作方法
2023-04-25 05:58:06
專利名稱：門冬胰島素前體基因的優化及其高效表達的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因改造與蛋白表達。通過優化密碼子，獲得可以用於高表達的門冬胰島素前體基因序列。應用分子生物學技術進行目的基因合成和表達載體構建，並對目的蛋白的表達進行評價。
背景技術：
胰島素(insulin，Ins)是主要應用於所有I型糖尿病和大多數II型糖尿病患者的治療藥物。胰島素的理想應用模式是模擬生理性胰島素分泌的情況來滿足能量代謝的需要。對於糖尿病(diabetes mellitus, DM)來說,通過胰島素的治療能有效的減少或緩解I型和II型糖尿病症狀的發生和發展，因此，胰島素已成為較為理想的治療方法。雖然普通的短效人胰島素應用比較廣泛，但也存在一些缺點，特別是在是皮下注射之後，吸收和達到峰值速度與正常個體餐後胰島素的分泌狀態不同，進而使得藥物濃度的峰值不能與餐後血糖高峰吻合，因此容易導致餐後高血糖和藥物吸收後低血糖的發生。為了使胰島素對糖尿病的治療更為安全有效，新的短效胰島素類似物不斷得以開發。門冬胰島素(insulinaspart, IAsp)便是其中一種快速作用的重組胰島素類似物。「諾和銳」是由丹麥諾和諾德公司研製的重組門冬胰島素注射液。1999年9月得到歐盟批准；同年8月，9月和10月分別在瑞士、英國和德國上市。2000年6月得到美國食品藥品監督管理局(FDA)批准，2002年8月獲得中國國家醫藥管理局(SFDA)的批准，應用於I型和II型糖尿病患者的臨床治療。目前，門冬胰島素作為一種常見的速效胰島素類似物已經得到廣泛應用。與普通人胰島素相比，門冬胰島素由於B鏈28位的脯氨酸被門冬氨酸替代，減弱了溶液中胰島素分子間的結合強度[Osterberg O, Erichsen L, Ingwersen S H,etal. Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of insulin aspart andhuman insulin. JPharmacokinet Pharmacodyn, 2003, 30 (3) :221-235],從而導致其迅速角軍離為二聚體或單體[Lindholm A, Jacobsen L V. Clinical pharmacokinetics andpharmacodynamics of insulin aspart. Clin Pharmacokinet,2001,40(9) :641-659]。皮下給藥吸收快於以同樣方式給藥的普通人胰島素，因此可以更快達到最大血藥濃度而且迅速回復到基線水平。而血漿清除率和生物利用度等參數與可溶性人胰島素相比沒有明顯差異。主要通過胰島素蛋白酶途徑進行代謝，其代謝產物胺基酸和多肽隨後用於合成其他蛋白質。目前門冬胰島素主要利用釀酒酵母來表達生產，該系統並不是十分理想。雖然釀酒酵母的產物的後期處理相對簡單，但表達量較低[Zhang Y S. Hu H M. Cai R R. Secretoryexpression of a single-chain insulin precursor in yeast and its conversionintohuman insulin. Science in China, 1996, 39 :225-233.]。相比之下，畢赤酵母可將甲醇作為唯一碳源進行高密度發酵，其乙醇氧化酶的啟動子(A0X1)可控制異源蛋白大量表達，且其表達可通過甲醇供給進行嚴格調控。同時外源蛋白大都以分泌形式釋放到胞外，產物後期處理同樣簡單。因此畢赤酵母是目前最為理想的真核表達系統之胰島素密碼子優化的相關文獻很多，如Gurramkonda等人優化的人胰島素前體基因序列並在畢赤酵母的表達研究[Application of simple fed-batch technique tohigh-1eveI secretory production of insulin precursor using Pichia pastoriswith subsequentpurification and conversion to human insulin. Microbial CellFactories 2010，9:31]。門冬胰島素前體基因序列很少報導，我們在以往的研究中參照了Gurramkonda等人優化胰島素序列，並將其用於門冬胰島素前體基因序列的優化，但是在畢赤酵母的表達效果仍然欠佳。因此，優化門冬胰島素前體基因序列以提高目前門冬胰島素前體的表達量，在產業化需求上具有重要的現實意義。本發明的目的在於優化門冬胰島素前體基因序列，構建表達效率高、表達產物便於加工的產門冬胰島素前體的畢赤酵母工程菌株，為低成本生產門冬胰島素探索一條新的途徑。
發明內容
本發明公開了密碼子優化的門冬胰島素前體基因序列，所述優化的門冬胰島素前體基因為 Sequence NO. 2> Sequence NO. 3 > Sequence NO. 4、Sequence NO. 5 > Sequence NO·6、Sequence NO. 7、Sequence NO. 8、Sequence NO. 9 或 equence NO. 10。所述優化的門冬膜島素前體基因可用於生產治療糖尿病相關疾病藥物。本發明公開了一種表達載體與一種宿主細胞，所述載體含有門冬胰島素前體基因序列 Sequence NO. 2、Sequence NO. 3、Sequence NO. 4、Sequence NO. 5、Sequence NO. 6、Sequence NO. 7、Sequence NO. 8、Sequence NO. 9 或 equence NO. 10。所述宿主細胞為畢赤酵母菌，如X33、GS115、 SDMl 168、SMD1165等，且被該表達載體所轉化。本發明的門冬胰島素前體基因序列優化方案第一組實驗將Sequence NO.1中的B鏈4位胺基酸密碼子進行替換得到SequenceNO. 2 ;替換Sequence NO. 2序列中B鏈12位胺基酸密碼子得到Sequence NO. 3 ；替換Sequence NO. 2序列中B鏈13位胺基酸密碼子得到Sequence NO. 4。第二組實驗將Sequence NO.1中的B鏈5位胺基酸密碼子進行替換得到SequenceNO. 5 ;替換Sequence NO. 5序列中B鏈12位胺基酸密碼子得到Sequence NO. 6 ；替換Sequence NO. 2序列中B鏈13位胺基酸密碼子得到Sequence NO. 7。第三組實驗將Sequence NO.1中的B鏈4位和5位胺基酸密碼子進行替換得到SequenceNO. 8 ;替換SequenceNO. 8序列中B12位胺基酸密碼子得到SequenceNO. 9 ;替換Sequence NO. 8序列中B鏈13位胺基酸密碼子得到Sequence NO. 10。SequenceNO.1 NO. 10所對應的胺基酸序列為Sequence NO. 11。本發明還公開了一種門冬胰島素前體基因的改造方法，其特徵在於包括以下步驟I)根據畢赤酵母偏好密碼子和相關研究結果對原基因序列進行優化，獲得經過優化的門冬膜島素如體基因序列；2)利用PCR技術合成經過優化的門冬胰島素前體基因；3)對門冬胰島素前體基因的進行鑑定；
4)經過優化的門冬胰島素前體基因向酵母的轉化及高效表達。下面參照上述步驟詳細描述經過優化的門冬胰島素前體基因設計及製備過程。設計及製備本發明基因的方法僅僅是說明相關方法，並非是限制性的；也可以採用其他已知的方法，或者採用修改的方法。I)根據畢赤酵母偏好密碼子對原基因序列進行優化，獲得經過優化的門冬胰島素iu體基因序列；根據原門冬胰島素前體基因序列，將其中個別胺基酸的密碼子替換為畢赤酵母中偏愛的密碼子，通過生物信息學技術合理優化，增加基因的穩定性及其在畢赤酵母中的表達水平，獲得相應的經過優化的門冬胰島素前體基因序列。2)利用PCR技術合成經過優化的門冬胰島素前體基因；設計兩條包括突變位點密碼子的引物。以含有原門冬胰島素前體基因序列的表達載體為模板，分別以Primer NO. 5(5』 AOX通用引物)和下遊引物，上遊引物和PrimerN0.6(3』AOX通用引物)為引物擴增出兩條具有互補序列的片段。再以這兩個片段互為模板和引物進行擴增得到含有經過優化的門冬胰島素前體基因的目的片段。最後以次片段為模板，以5』 AOX和3』 AOX為引物得到足夠濃度的目的片段。3)含有經過優化的門冬胰島素前體基因表達載體構建和鑑定；a)含有經過優化的門冬胰島素前體基因表達載體的構建將PCR擴增得到的目的片段用限制性內切酶PstI和SalI進行雙酶切，回收目的片段。將原表達載體用限制性內切酶PstI和SalI進行雙酶切， 回收目的片段。將兩個目的片段用Solution I DNA連接酶於16°C連接，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α，在含有一定濃度的zeocin抗性的平板上過夜培養，篩選重組子。b)含有經過優化的門冬島素原的基因表達載體的鑑定將長出的重組子劃線培養後，進行快抽質粒鑑定，質粒大小為3724bp的重組子定義為陽性重組子。用限制性內切酶XhoI和notl進行質粒酶切鑑定，送樣測序。4)經過優化的門冬胰島素前體基因向畢赤酵母的轉化及表達。a)經過優化的門冬胰島素前體基因向畢赤酵母的轉化將陽性重組質粒用限制性內切酶SacI線性化後，電擊轉化畢赤酵母，在含有zeocin抗性的YPD平板上篩選重組子，並對重組子進行菌落PCR鑑定。b)經過優化的門冬胰島素前體基因在搖瓶培養基中的誘導表達將菌落PCR鑑定為陽性的重組子接種於50ml搖瓶培養基中培養24h後，每天補加1%無水甲醇進行誘導表達，120h後結束培養。將Iml菌液離心後取上清對目的蛋白進行液相檢測。
圖1重組質粒XhoI，NotI酶切圖。M 5000bpMaker ;1:含有門冬胰島素前體SequenceNO. 2的質粒酶切結果；2 :含有門冬胰島素前體Sequence NO. 3的質粒酶切結果；3 :含有門冬胰島素前體Sequence NO. 4的質粒酶切結果。 圖2重組質粒XhoI，NotI酶切圖。M 5000bpMaker ;1:含有門冬胰島素前體SequenceNO. 5的質粒酶切結果；2 :含有門冬胰島素前體Sequence NO. 6的質粒酶切結果；
3:含有門冬胰島素前體Sequence NO. 7的質粒酶切結果。
圖3重組質粒XhoI，NotI酶切圖。M 5000bpMaker ;1:含有門冬胰島素前體SequenceNO. 8的質粒酶切結果；2 :含有門冬胰島素前體Sequence NO. 9的質粒酶切結果；
3:含有門冬胰島素前體Sequence NO. 10的質粒酶切結果。圖4門冬胰島素前體質粒電轉化畢赤酵母后菌落PCR鑑定重組子(用5』 AOX上遊引物和門冬胰島素前體基因下遊引物Primer NO. 7鑑定)。M 5000bpMaker ;1 5 :Sequence NO. 2 陽性重組子；6 10 Sequence NO. 3 陽性重組子;11 15 Sequence NO. 4
陽性重組子。圖5門冬胰島素前體質粒電轉化畢赤酵母后菌落PCR鑑定重組子(用5』 AOX上遊引物和門冬胰島素前體基因下遊引物Primer NO. 7鑑定)。M 5000bpMaker ;1 5 :Sequence NO. 5 陽性重組子；6 10 Sequence NO. 6 陽性重組子;11 15 Sequence NO. 7
陽性重組子。圖6門冬胰島素前體質粒電轉化畢赤酵母后菌落PCR鑑定重組子(用5』 AOX上遊引物和門冬胰島素前體基因下遊引物Primer NO. 7鑑定)。M 5000bpMaker ;1 5 :Sequence NO. 8 陽性重組子;6 10 Sequence NO. 9 陽性重組子;11 15 Sequence NO. 10
陽性重組子。圖7搖瓶實驗誘導前液相圖譜。進樣量100 μ 1，36分鐘左右並沒有目的峰出現。圖8門冬胰島素前體原始菌株Sequence NO.1搖瓶實驗誘導120h液相圖譜。進樣量100 μ 1，出峰時間為36. 768分鐘，峰面積為2510. 7，表達量為O. 03g/L。圖9門冬胰島素前體Sequence NO. 2菌株搖瓶實驗誘導120h液相圖譜。進樣量100 μ 1，出峰時間為 36. 598分鐘，峰面積為4379. 5，表達量為O. 053g/L。圖10門冬胰島素前體Sequence NO. 3菌株搖瓶實驗誘導120h液相圖譜。進樣量100 μ 1，出峰時間為36. 541分鐘，峰面積為5657，表達量為O. 068g/L。圖11門冬胰島素前體Sequence NO. 4菌株搖瓶實驗誘導120h液相圖譜。進樣量100 μ 1，出峰時間為36. 772分鐘，峰面積為5924. 4，表達量為O. 071g/L。圖12門冬胰島素前體Sequence NO. 5菌株搖瓶實驗誘導120h液相圖譜。進樣量100 μ 1，出峰時間為36. 620分鐘，峰面積為4777. 8，表達量為O. 058g/L。圖13門冬胰島素前體Sequence NO. 6菌株搖瓶實驗誘導120h液相圖譜。進樣量100 μ 1，出峰時間為36. 900分鐘，峰面積為8249. 5，表達量為O. 099g/L。圖14門冬胰島素前體Sequence NO. 7菌株搖瓶實驗誘導120h液相圖譜。進樣量100 μ 1，出峰時間為36. 382分鐘，峰面積為9044. 6，表達量為O. 101g/L。圖15門冬胰島素前體Sequence NO. 8菌株搖瓶實驗誘導120h液相圖譜。進樣量100 μ 1，出峰時間為36. 926分鐘，峰面積為11164. 6，表達量為O. 135g/L。圖16門冬胰島素前體Sequence NO. 9菌株搖瓶實驗誘導120h液相圖譜。進樣量100 μ 1，出峰時間為36. 800分鐘，峰面積為17926. 3，表達量為O. 216g/L。圖17門冬胰島素前體Sequence NO. 10菌株搖瓶實驗誘導120h液相圖譜。進樣量100 μ 1，出峰時間為36. 863分鐘，峰面積為18625，表達量為O. 224g/L。圖18門冬胰島素前體Sequence NO.1菌株30L發酵培養200h放罐樣品液相圖譜。進樣量20 μ 1，出峰時間為37. 506分鐘，峰面積為6106. 5，表達量為O. 37g/L。圖19門冬胰島素前體Sequence NO. 10菌株30L發酵培養200h放罐樣品液相圖譜。進樣量5 μ 1，出峰時間為37. 321分鐘，峰面積為16517，表達量為3. 98g/L。圖20pPICZ a A載體質粒圖譜。圖21門冬膜島素如體基因序列優化如後蛋白表達情況。
圖22門冬胰島素前體基因序列優化前後門冬胰島素前體Sequence NO.1菌株與Sequence NO. 10菌株30L發酵的表達情況。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用於限制本發明的範圍。實施例1優化的門冬胰島素前體基因的合理設計及載體構建第一組實驗一實驗材料引物設計軟體為DNASTAR軟體，引物由上海博尚生物技術有限公司合成；實驗中所用到的DNA聚合酶、DNA連接酶和限制性內切酶均為TAKARA公司產品；pPICZ a A載體購自Invitrogen公司；質粒抽提試劑盒與膠回收試劑盒均為杭州愛思進生物技術有限公司產品；基因測序由上海博尚生物技術有限公司完成；其他相關試劑均為市購。二方法結果I經過優化的門冬胰島素前體基因獲得以 Gurramkonda 等人[Application of simple fed-batch technique tohigh-1eveI secretory production of insulin precursor using Pichia pastoriswith subsequentpurification and conversion to human insulin. Microbial CellFactories 2010，9 :31]報導的人胰島素前體基因序列(Sequence NO. 12)為基礎(其對應的人胰島素前體胺基酸序列為Sequence NO. 13)，將其中B鏈28位的脯氨酸改變為天門冬氨酸後得到門冬胰島素前體原始基因序列(Sequence NO.1)，將其中個別胺基酸的密碼子替換為畢赤酵母中偏好的密碼子，並適當組合，通過生物信息學技術合理優化，增加基因的穩定性及其在畢赤酵母中的表達水平，獲得3種經過優化的門冬胰島素前體基因序列(Sequence NO. 2、Sequence NO. 3 與 Sequence NO. 4)。2引物設計利用計算機輔助設計軟體DNASTAR，設計引物，考慮弓I物的二級結構、GC含量等相關參數。設計包括突變位點密碼子的上遊引物Primer NO. 1> Primer NO. 2、PrimerNO. 3和下遊 Primer NO. 4。表I第一組實驗引物序列 表
權利要求
1.一種密碼子優化的門冬胰島素前體基因序列，其特徵在於，所述優化門冬胰島素前體的基因為 Sequence NO. 2、Sequence NO. 3> Sequence NO. 4、SequenceNO. 5> SequenceNO. 6、Sequence NO. 7、Sequence NO. 8、Sequence NO. 9 或 Sequence NO. 10 之一。
2.根據權利要求1所述優化的門冬胰島素前體基因在生產用於治療糖尿病相關疾病藥物中的用途。
3.—種表達載體，其特徵在於，所述載體含有門冬胰島素前體基因序列，其中基因序列選自 Sequence NO. 2、Sequence NO. 3、Sequence NO. 4、SequenceNO. 5、Sequence NO. 6、Sequence NO. 7、Sequence NO. 8、Sequence NO. 9 或 equenceNO. 10。
4.一種宿主細胞，其特徵在於，所述細胞為畢赤酵母菌，且被權利要求3所述的表達載體所轉化。
5.一種門冬胰島素前體基因的改造方法，其特徵在於包括以下步驟1)根據畢赤酵母偏好密碼子對原基因序列進行優化，獲得經過優化的門冬胰島素前體基因序列；2)利用PCR技術合成經過優化的門冬胰島素前體基因；3)對經過優化的門冬胰島素前體基因的進行鑑定；4)經過優化的門冬胰島素前體基因向酵母的轉化及高效表達。
全文摘要
本發明公開了優化的門冬胰島素前體基因序列及其在酵母的高效表達。本發明優化的門冬胰島素前體基因所編碼的胺基酸序列與原基因序列一致，但在酵母內的表達水平遠高於原基因序列。通過搖瓶發酵試驗對表達結果進行檢測發現優化後門冬胰島素前體的蛋白表達量提高了1.8～7.5倍；在30L發酵罐中，搖瓶結果最佳的改造序列重組子的產量比原來可提高10.8倍。本發明還公開了上述基因序列的改造方法。
文檔編號A61P3/10GK103060335SQ201110322750
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月21日 優先權日2011年10月21日
發明者徐巖, 耿月兵, 聶磊, 王海彬, 葉小紅, 白驊 申請人:浙江海正藥業股份有限公司