一種用於培養間充質幹細胞的無血清培養基的製作方法

2023-04-24 16:25:36 3

一種用於培養間充質幹細胞的無血清培養基的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種用於培養間充質幹細胞的無血清培養基。以該無血清培養基的體積計，其包括以下成分組成：α-MEM10.2g/L、碳酸氫鈉2.4g/L、L-穀氨醯胺1-5mM、泊洛沙姆18850-300mg/L、重組人白蛋白2-8g/L、重組人轉鐵蛋白10-20mg/L、重組人胰島素2-10mg/L、Hepes1-5mM、β-巰基乙醇50nM、脂質0.1-1mg/L、微量元素1-5mg/L、穀胱甘肽0.1-5mg/L、對氨基苯甲酸0.5-5mg/L、氫化可的松1-50ng/mL、維生素PP20-50mg/L、維生素C5-50mg/L、式I的化合物2-10μM、式II的化合物5-20μM、黃體酮10-20ng/mL、腐胺1-10mg/L、肝素1-10IU/mL、EGF1-10ng/mL、b-FGF1-10ng/mL、HGF1-10ng/mL、VEGF1-10ng/mL。該MSCs無血清培養基BPS-SFM是一種化學成分確定、無動物源性物質、無血清的培養基；
【專利說明】—種用於培養間充質幹細胞的無血清培養基
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用於培養間充質幹細胞的無血清培養基，屬於細胞工程與生物醫藥【技術領域】。
【背景技術】
[0002]間充質幹細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是廣泛存在於人體組織器官中的成體幹細胞，因其具有高度自我更新能力和多向分化潛能，在臨床造血支持、促進幹細胞植入和免疫調控等方面具有潛在的應用前景。目前，通過將MSCs作為細胞治療產品進行直接輸注，或與支架材料相結合構建組織工程化的組織、器官(皮膚、骨或軟骨等)進行移植開展的大規模臨床前及臨床研究證實，MSCs在燒傷、骨缺損、軟組織填充、終末期肝病、心肌梗死、糖尿病等創傷或疾病的治療中具有良好的安全性和有效性。例如，2012年，美國Osiris公司的幹細胞產品Prochymal在加拿大獲批上市,成為全球首個獲批的幹細胞藥物。Prochymal是間充質幹細胞靜脈注射劑，用於激素治療失敗的acute GvHD(急性移植物抗宿主病，一種骨髓移植併發症)的兒童患者，這是間充質幹細胞臨床應用的歷史性進步。
[0003]目前，已經可從臍帶、胎盤、成人骨髓、外周血、脂肪等組織中分離獲得MSCs，雖然不同來源MSCs在特性上略有差別，但都具有如下共同性質:例如，體外成纖維生長、擴增，特異性表達⑶29、⑶44、⑶90、⑶105、⑶166，但不表達內皮和造血的標誌⑶34和⑶45等，且在體外具有成脂、成骨和成軟骨分化的潛能。因此，都可以作為終末期疾病、難治性疾病治療的種子細胞來源。
[0004]隨著MSCs在臨床應用中的迫切需求以及潛在的巨大衍生市場，關於符合臨床應用要求的、規模化的MSCs的分離、純化、擴增技術和標準的建立亟待解決。由於組織中MSCs數量極其有限，為獲得足夠用於臨床治療的細胞量，需要在回輸前對其進行體外擴增。雖然研究表明，常規用於普通細`胞培養的含有胎牛/新生牛血清的培養體系同樣適合MSCs的體外擴增和維持，然而細胞內殘存的動物血清會引發回輸後受體產生嚴重的免疫反應，並且帶來不可預知的動物源性汙染，為臨床應用帶來諸多問題。例如Sunghoon Jung等人對這類含有血清或動物源成分的培養體系的臨床應用問題進行了系統性總結(Sunghoon Junget al.,Ex vivo Expansion of Human Mesenchymal Stem Cell in Defined Serum-FreeMedia, Stem Cells International，2012)，其至少包括如下潛在問題:
[0005](I)有害病原體的汙染，例如病毒、支原體、朊病毒等；
[0006](2)異種蛋白所引發的免疫反應；
[0007](3)高度的批間差異性導致細胞的生產過程很難實現標準化；
[0008](4)血清中還可能含有生長抑制因子、細胞毒性物質；
[0009](5)為降低各類汙染風險而開展的質量控制難度十分高；
[0010](6)其它成分不明的因子、激素等物質的作用尚待研究。
[0011]近年來，對MSCs等成體幹細胞的體外維持和擴增機制的深入研究，極大推動了MSCs的體外無血清培養體系的研發和建立。目前商品化以及在研的MSCs無血清培養基(表I)都是在基礎培養基(a -MEM、IMDM、L-DMEM等)中添加生長因子(鹼性成纖維細胞生長因子bFGF、上皮細胞生長因子EGF、血小板衍生生長因子、胰島素樣生長因子-1IGF-1、幹細胞生長因子SCF等)、蛋白(胰島素Insulin、轉鐵蛋白Transferrin、人/牛血清白蛋白H/BSA等)、激素(地塞米松/鈉)、微量元素(硒)、維生素等。無血清培養基具有成分明確的特點，並可良好維持MSCs的體外增殖和分化多能性，但存在價格高、保存時間短等問題。同時，這些培養基大多需要輔助明膠等基質膠對培養平皿進行包被處理，不但可能因此引入動物源成分，而且也增加了細胞培養擴增的工作量和傳代過程中的汙染機會。因此，尋找成分明確、質量穩定、使用便捷、成本較低的無血清培養體系對於MSCs的臨床應用具有重要的意義。
[0012]表1目前已有的商品化培養基情況統計表
[0013]
【權利要求】
1.一種用於培養間充質幹細胞的無血清培養基，以該無血清培養基的體積計，其包括以下成分組成: α -ΜΕΜ10.2g/L、碳酸氫鈉 2.4g/L、L-穀氨醯胺 l_5mM、泊洛沙姆 18850_300mg/L、重組人白蛋白2-8g/L、重組人轉鐵蛋白10-20mg/L、重組人胰島素2-lOmg/L、H印esl_5mM、β-巰基乙醇50ηΜ、脂質0.1-lmg/L、微量元素l_5mg/L、穀胱甘肽0.l_5mg/L、對氨基苯甲酸0.5-5mg/L、氫化可的松l-50ng/mL、維生素PP20_50mg/L、維生素C5_50mg/L、式I所示的化合物2-10 μ M、式II所示的化合物5-20 μ Μ、黃體酮10_20ng/mL、腐胺l-10mg/L、肝素1-lOIU/mL、EGFl-10ng/mL、b-FGFl-10ng/mL、HGFl-10ng/mL、VEGFl-10ng/mL ；
2.根據權利要求1所述的無血清培養基，其中，所述脂質包括膽固醇、花生四烯酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸中的一種或幾種的組合。
3.根據權利要求1或2所述的無血清培養基，其中，所述微量元素包括Cu、Zn、Se、Fe、Sn、N1、Ag、Al、Cr、Ge、Zr、Rb、Co、Cd、Ga、Mg、Mn 和 Ba 中的一種或幾種的組合。
4.根據權利要求1-3任一項所述的無血清培養基，其中，以該無血清培養基的體積計，其包括以下成分組成: α -ΜΕΜ10.2g/L、碳酸氫鈉2.4g/L、L-穀氨醯胺5mM、泊洛沙姆188100mg/L、重組人白蛋白8g/L、重組人轉鐵蛋白20mg/L、重組人胰島素10mg/L、Hepes5mM、β-巰基乙醇50ηΜ、膽固醇0.5mM、花生四烯酸50nM、棕櫚酸0.26mg/L、棕櫚油酸0.25mg/L、硬脂酸0.28mg/L、油酸 0.28mg/L、亞油酸 0.28mg/L、亞麻酸 0.28mg/L、Cu5nM、Se30nM、ZnlmM、Ga0.3mM、Cr5 μ M> Mg0.3mM、Mn5nM、穀胱甘肽lmg/L、對氨基苯甲酸lmg/L、氫化可的松50ng/mL、維生素PP50mg/L、維生素C20mg/L、式I所示的化合物10 μ M、式II所示的化合物20 μ Μ、黃體酮15ng/mL、腐胺 10mg/L、肝素 10IU/mL、EGF10ng/mL、b-FGF10ng/mL、HGF10ng/mL、VEGFIOng/mL0
5.根據權利要求1或4所述的無血清培養基，其中，以該無血清培養基的體積計，其還包括:原兒茶酸 1.5mmol/L、PDGF-BBIOng/mL, IGF-110ng/mL、GM-CSFl-lOng/mL、TGF-β 1-lOng/mL。
6.根據權利要求5所述的無血清培養基，其中，以該無血清培養基的體積計,其還包括:原兒茶酸 1.5mmol/L、PDGF-BBIOng/mL, IGF-110ng/mL、GM-CSFlOng/mL、TGF-β IOng/mL0
7.權利要求1-6任一項所述的用於培養間充質幹細胞的無血清培養基的製備方法，其包括將各種成分與水混合之後利用0.22 μ m濾器過濾除菌，密封，4°C避光保存的步驟。
8.權利要求1-6任一項所述的用於培養間充質幹細胞的無血清培養基在間充質幹細胞培養中的應用。`
【文檔編號】C12N5/0775GK103555665SQ201310583547
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月19日 優先權日:2013年8月12日
【發明者】趙侃, 王春有, 趙宇, 劉湘連, 李莉莉 申請人:北京東方華輝生物醫藥科技有限公司