Pdgf-rbeta結合劑的製作方法

2023-04-24 15:01:16

專利名稱：Pdgf-rbeta結合劑的製作方法
技術領域：
本發明一般涉及結合PDGF-Rii的試劑。更具體地，本發明涉及結合PDGF-Rβ的標記試劑及用所述試劑的檢測方法。
背景技術：
PDGF-Rii是參與纖維變性和腫瘤疾病的受體酪氨酸激酶，代表潛在的有價值的分子成像靶標。在體內或體外定性或定量顯現PDGF-Rβ的能力，為研究人員和臨床醫生提供重要的診斷和治療工具。例如，視覺上辨別肝臟相關疾病(如肝臟纖維變性、肝硬化或肝功能異常)的能力。測量所述病況患者體內PDGF-Rii表達方式的能力，將為臨床醫生和研究人員在診斷、預測和治療肝臟相關疾病狀態方面提供幫助。天然存在的葡萄球菌蛋白A包含形成三螺旋結構的結構域，所述三螺旋結構與 IgG的Fc區結合。源自葡萄球菌蛋白A的B結構域的58個殘基多肽的Z結構域維持結合。源自蛋白A的Z結構域的某些多肽含有由三個由環連接的α-螺旋組成的支架 (scaffold)。位於這些螺旋中的兩個螺旋上的某些殘基構成對IgG的Fc-部分的結合位點。 按照蛋白質工程領域所用術語，結合表面是定位於支架上的表面。因此，所述支架是三螺旋束的蛋白結構域。通過取代位於螺旋1和螺旋2上的13個表面暴露的胺基酸殘基，將結合 IgG的Fc-部分的能力更換為結合其它分子的能力，來製造可供選擇的結合劑分子。發明簡述本文提供的是PDGF-Rii顯像劑，所述顯像劑包含用信號發生劑(generator)(即順磁性標記、放射性核素或螢光團)標記的SEQ. ID號1、2、3、4、5、6、7、8、9或其保守變體中的任何多肽，其中所述多肽特異性結合PDGFR-β。在某些實施方案中，多肽具有對Α772細胞、U87細胞或Μ231細胞表達的PDGFR-β的至少IOnM的結合親和力。在某些實施方案中，多肽可包含選自SEQ. ID號1、2、3、4、5、6、7、8、9中的至少兩種胺基酸序列，以形成多價多肽。多價多肽可包括具有大於90%的序列同一性的二個重複的胺基酸序列，以產生二價同源多肽。在某些實施方案中，信號發生劑可為選自氟(例如F-18)、碘(1-123)、鎝(例如 Tc-99m)、鎵或釓的放射性核素。在某些實施方案中，經由氨氧基接頭將F-18或1-123與多肽連接。在某些備選實施方案中，經由氨氧基接頭在多肽N-末端將F-18或1-123與多肽連接。在某些實施方案中，可經由PN接頭例如CPN216將鎝與多肽連接。或者，可經由PN 接頭在多肽的N-末端將Tc-99m與多肽連接。順磁性標記可包含Gd-157、Mn-55、Dy-162、Cr-52和Fe_56，可經由選自ΝΟΤΑ、 D0TA、DTPA的螯合劑與多肽連接。放射性標記可包含Gd-153或fei-67，可經由選自ΝΟΤΑ、DOTA, DTPA的螯合劑與多肽連接。附1顯示抗PDGF-Rii的多肽的表面等離子體共振(SPR)。圖IA顯示針對人PDGF-R β 的 Ζ2465 (SEQ. ID 號 16)的結合。圖 IB 顯示針對鼠 PDGF-R^ 的 Ζ2465 (SEQ. ID 號 16)的結合。圖 2 顯示針對人 PDGF-R α (hPDGF-R α )的 Z2465 (SEQ. ID 號 16)的 SI^R。圖3顯示抗人PDGF-R β抗體針對四種細胞類型Α172 (人腦成膠質細胞瘤，陽性對照)、U87 (人腦成膠質細胞瘤)、M231 (人乳腺癌)和HD9 (人結腸直腸腺癌，陰性對照)的定性流式細胞術結果圖4顯示針對一組腫瘤類型的ELISA測定結果圖5 顯示用抗人 PDGF-R^ 在 U87 (PDGF-R^ 高表達)、M231 (PDGF-R β 中 / 低表達)和(PDGF-Rii不表達)腫瘤中的體內光學測定。圖6顯示標記的Z2465(SEQ. ID號16)的HPLCy色譜圖。圖6A中的色譜圖顯示單體形式，而圖6B中的色譜圖顯示二聚體形式(Z246Q2(SEQ. ID號19)。圖7顯示血液和腫瘤組織中ZM65 (SEQ. ID號16)的體內生物分布研究。圖7A顯示Z2465(SEQ. ID號16)在荷U87腫瘤的小鼠中的分布。圖7B顯示Z2465 (SEQ. ID號16) 在荷有HT-四腫瘤的小鼠中的分布。圖7C顯示Ztaq (SEQ. ID號10)在荷U87腫瘤的小鼠中的分布。圖7D顯示圖7A-7C中所述的系列實驗中的腫瘤血液比率。圖8顯示Z2465(SEQ. ID號16)的清除模式。圖8A顯示Z2465 (SEQ. ID號16)在肝臟、腎臟、脾臟、膀胱/尿和腸中的％ ID 注射劑量]。圖8B顯示肝臟、腎臟和脾臟的％ ID/g[%注射劑量/克組織]。圖9A顯示用U87腫瘤細胞系注射五種多肽Ztaq (SEQ. ID號10) ,Z2465 (SEQ. ID號 16) ,Z2477 (SEQ. ID 號 25) ,Z2483 (SEQ. ID.號 18)、Z2516 (SEQ. ID 號 17)後 2 小時的腫瘤 血液比率。圖9B顯示用U87腫瘤細胞系注射五種多肽後2小時的腫瘤吸收。

圖10顯示Z2465多肽的單價和二價形式(SEQ. ID號16和19)的化合價比較。圖 IOA顯示二價(Z246Q2(SEQ. ID號19)在血液和腫瘤細胞中隨時間的水平變化。圖IOB顯示單價Z2465(SEQ. ID號16)在血液和腫瘤細胞中隨時間的水平變化。圖IOC顯示單價體 (SEQ. ID.號16)和二價體(SEQ. ID.號19)的比較。圖11顯示在高表達(U87)和中/低表達(M231)腫瘤中含有99mTc-標記的 Z2465 (SEQ. ID 號 16)和(Z2465) 2 (SEQ. ID 號 19)以％ ID/g 計的腫瘤血液比率。圖12顯示用高表達(U87)和中/低表達(M231)腫瘤在注射單價(SEQ. ID號16) 和二價多肽(SEQ. ID號19)2小時後的腫瘤血液比率。圖 13 顯示 Ztaq(SEQ. ID 號 10)和 Z1982(SEQ. ID 號 14)在三種細胞系:HT29、M231 和U87中的腫瘤血液比率。圖14顯示Mal_cPn216接頭的化學結構圖15顯示Mal-PEG-Cl3I^ 16的化學結構圖16顯示cPn216-標記的Z0M65 (SEQ. ID號23)的反向高壓液相色譜(HPLC)純化。圖17闡明用Tc-99m標記cPn216_標記的ZM65 (SEQ. ID號16)的濃度依賴性。圖 18 闡明 Tc-99m 標記的 Z2465 (SEQ. ID 號 16)和 cPn216_ 標記的 Z02465 (SEQ. ID 號23)的大小排阻色譜HPLC的保留時間的相似性。圖19顯示U87和HT 29細胞對經由cPn216用 ^-99ι 標記的Ζ02465 (SEQ. ID號23)的腫瘤吸收。圖20顯示經由cPn216用Tc_99m標記的Z0M65 (SEQ. ID號23)在肝臟、腎臟和膀胱/尿中(％ ID, %注射劑量)的清除曲線。圖21顯示Z03358 (SEQ. ID號24)表現出類似於Z0M65 (SEQ. ID號23)的生物分布模式。圖21A顯示腫瘤血液比率、腫瘤中的％ ID/g和肝臟中的％ ID/g，圖21B顯示相同情況但包括了血液中的％ ID/g。圖 22 顯示經由 PEG4-cPn216 用 ^-99ι 標記的 Ζ02465 (SEQ. ID 號 23)的 U87 和 HT 29細胞的腫瘤吸收。圖23顯示馬來醯亞胺-氨氧基(Mal-AO)接頭的化學結構。圖A描述了 2_0_(2， 5- 二氧代_2，5- 二氫-IH-吡咯-1-基)乙基氨基)-2-氧代乙氧基氨基甲酸叔丁酯的化學結構，圖B描述了 2-(氨氧基)-N-(2，5- 二氧代-2，5- 二氫-IH-吡咯-1-基)乙基) 乙醯胺氫氯化物的化學結構。圖24顯示用18F標記的Z02465 (SEQ. ID號23)多肽。圖25顯示用F-18標記的Z0M65 (SEQ. ID號23)多肽在荷U87腫瘤的動物中的％ ID/g(圖A)和腫瘤血液比率(圖B)。圖洸顯示F-18標記的Z0M65(SEQ. ID號23)的清除曲線(％ ID)，圖A為在血液、腫瘤、膀胱/尿、肝臟、腎臟、脾臟和尾的(％ ID)，圖B為在血液、腫瘤、肝臟、腎臟和脾臟的％ ID/g。圖 27 顯示粗品 Gd-153-DOTA-標記的 Z2465 (SEQ. ID 號 16)的 γ 痕量 HPLC0圖 28 顯示純化的 Gd-153-DOTA-標記的 Ζ2465 (SEQ. ID 號 16)的 γ 痕量 HPLC0發明詳述關於術語「多肽」，通常指多肽的那些殘基，所述殘基提供三維結構以適當地定位多肽結合界面的殘基，由此使其能夠與靶標結合。以相同的拓撲學(ζ-結構域三螺旋摺疊) 保留結合位點和結合活性的任意序列是基於多肽。「脂肪族胺基酸」指具有脂肪族烴側鏈的疏水性胺基酸。遺傳上編碼的脂肪族胺基酸包括 Ala (A)、Val (V)、Leu (L)和 Ile(I)。術語「胺基酸」指天然存在的和人工合成的胺基酸，以及以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的胺基酸類似物和模仿物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的胺基酸，以及那些隨後被修飾的胺基酸，例如，羥脯氨酸、Y-羧基穀氨酸、0-磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸和磷酸酪氨酸。本文定義的胺基酸類別不是相互排斥的。因此，具有表現出兩種或多種物理化學性質的側鏈的胺基酸可能包括在多種類別中。例如，進一步被極性取代基取代的具有芳香族部分的胺基酸側鏈，例如Tyr (Y)，既可以表現出芳香族疏水特性，又可表現出極性或者親水特性，並因而可被包括在芳香族和極性兩種類別中。「酸性胺基酸」指具有ρΚ值小於7的側鏈的親水性胺基酸。酸性胺基酸通常在生理PH時由於失去氫離子而具有帶負電荷的側鏈。遺傳編碼的酸性胺基酸包括Glu(E)和 Asp (D)。「胺基酸類似物」指與天然存在的胺基酸具有同樣的基礎化學結構(即與氫、羧基、 氨基結合的碳)的化合物，其包括非常規的R基團(例如高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞碸或蛋氨酸甲基鋶(methionine methyl sulfonium))。這些類似物的R基團進行了修飾(例如正亮氨酸)或對肽主鏈進行修飾，但保留了和天然存在的胺基酸同樣的基礎化學結構。「芳香族胺基酸」指含具有至少一個芳香環或雜芳香環的側鏈的疏水胺基酸。芳香環或雜芳香環可含有一個或多個取代基，如-OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-N02、-NO、-NH 2、-NHR、-NRR、-C (0) R、-C (0) OH、-C (0) OR、-C (0) NH2、-C (0) NHR、-C (0) NRR 等，其中每個 R 獨立為(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、取代的(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、取代的(C1-C6)炔基、(C5-C20)芳基、取代的(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、取代的 (C6-C26)烷芳基、5-20元的雜芳基、取代的5-20元的雜芳基、646元的烷雜芳基或取代的 6-26元的烷雜芳基。遺傳編碼的芳香族胺基酸包括Phe (F)、Tyr (Y)和Trp (W)。「鹼性胺基酸」指具有pK值大於7的側鏈的親水性胺基酸。鹼性胺基酸通常在生理PH時因與水合氫離子締合而具有帶正電荷的側鏈。遺傳編碼的鹼性胺基酸包括His (H)、 Arg(R)和 Lys (K)。本文所用術語「結合」指多肽優先與靶標結合的能力，其親和力至少是其結合除預定靶標或緊密相關的靶標外的非特異性靶標(例如BSA或酪蛋白)的親和力的二倍以上。本文提供的多肽以以下親和力與其各自靶標結合KD值小於約5Χ1(ΤΜ、更優選小於約 2Χ1(ΤΜ、最優選小於約1Χ10ΛΓ。同樣地，「特異性結合」指以KD值小於約2X10—1的親和力與預定的抗原結合的多肽的性質。術語「結合界面殘基(「bindinginterface residue」 和 「binding interface residues") 」指那些參與靶標結合的多肽殘基，其例示於表1和表2所示的代表性多肽中。本文所用短語「血液半衰期」指當排除為第一級或擬第一級時試劑的血漿濃度衰減一半所需的時間。在多重衰減相位情況下，術語「血液半衰期」指表觀半衰期(如果不同相位的衰退半衰期相似)，或者如果不同半衰期不相似則為優勢半衰期(佔清除的大部分)。本文所用術語「保守變體("conservative variant，，禾口 "conservative variants") 」既用於胺基酸序列也用於核酸序列。關於特定胺基酸序列而言，保守變體指其中某些胺基酸被相同類別的相似胺基酸取代的序列，所述相同類別例如如上所述的酸性、 鹼性、極性、疏水性、親水性、芳香族和脂肪族。本文所用術語「疾病管理」指對與PDGFR-β表達或失調相關的疾病狀況的醫療關注，可用本發明試劑來促進所述醫療關注。疾病管理包括由醫學從業人員關於罹患 PDGFR-β相關疾病的受試者的治療療程所作的決定，所述決定包括但不限於治療成功或失敗、疾病組織狀態和/或是否表明要化學或手術幹預。當表明需要手術或其它非系統幹預時，疾病管理亦包括疾病組織的空間定位。本文所用術語「螢光團」指化學化合物，當其因暴露於特定波長的光被激發時發射光(以不同的波長)。螢光團可以根據其發射特徵或「顏色」來闡述。綠色螢光團(例如 Cy3、FITC和俄勒R綠(Oregon Green))可由其通常在515-540納米間的發射波長來表徵。 紅色螢光團(例如德克薩斯紅、Cy5和四甲基羅丹明)可由其通常在590-690納米間的發射波長來表徵。螢光團的實例包括但不限於4-乙醯氨基-4'-異氰硫基芪_2，2' -二磺酸、吖啶、吖啶和吖啶異硫氰酸酯衍生物、5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、 4-氨基-N-[3-(乙烯基磺醯基)苯基]萘醯亞胺_3，5-二磺酸酯(螢光黃VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)馬來醯亞胺、2-氨基苯甲醯胺(anthranilamide)、亮黃、香豆素、香豆素衍生物、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7_氨基-三氟甲基香豆素(香豆素151)、 焰紅染料(cyanosine) ；4'，6_ 二脒基_2_苯基吲哚(DAPI)、5 『，5」-二溴鄰苯三酚-磺肽(溴鄰苯三酚紅)、7_ 二乙基氨基-3-(4'-異氰硫基苯基)4-甲基香豆素、4，4' -二異氰硫基二氫-芪_2，2' -二磺酸、4，4' - 二異氰硫基芪_2，2' -二磺酸、5-[二甲基氨基]萘-1-磺醯氯(DNS，丹磺醯氯)、曙紅、曙紅衍生物(如曙紅異硫氰酸酯)、赤蘚紅、赤蘚紅衍生物(如赤蘚紅B和赤蘚紅異硫氰酸酯)；乙啡啶；螢光素及衍生物，如5-羧基螢光素(FAM)、5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基螢光素(DTAF)、2' 7' -二甲氧基-4' 5' -二氯-6-羧基螢光素(JOE)、螢光素、螢光素異硫氰酸酯(FITC)、QFITC O(RITC)；螢光胺衍生物(與胺反應後產生螢光)；IR144 ；IR1446 ；孔雀綠異硫氰酸酯；4-甲基傘形酮；鄰甲酚酞； 硝基酪氨酸；鹼性副品紅；酚紅、B-藻紅蛋白；鄰苯二醛衍生物(與胺反應後產生螢光)；芘及衍生物，如芘、芘丁酸酯和琥珀醯基1-芘丁酸酯；活性紅4(Cibacr0n. RTM.亮紅!3B-A)、 羅丹明及衍生物，如6-羧基-X-羅丹明(ROX)、6_羧基羅丹明(R6G)、麗絲胺羅丹明B磺醯氯、羅丹明(Miod)、羅丹明B、羅丹明123、羅丹明X異硫氰酸酯、磺基羅丹明B、磺基羅丹明 101和磺基羅丹明101的磺醯氯衍生物(德克薩斯紅)、N，N，N' ,N'-四甲基_6_羧基羅丹明(TAMRA)、四甲基羅丹明、四甲基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC)；核黃素；玫紅酸及其鑭系元素螯合衍生物、量子點、青色素和方酸菁(squaraine)。本文所用術語「順磁性金屬離子」、「順磁性離子」或「金屬離子」，指與磁場平行或反平行被磁化到與磁場成比例的程度的金屬離子。通常這些是具有不成對電子的金屬離子。適宜的順磁性金屬離子的實例包括但不限於釓III (Gd3+或Gd(III))、鐵III (Fe3+ 或!^e(III))、錳 II (Mn2+或 Mn(II))、釔 III (Yt3+或 Yt (III))、鏑(Dy3+或 Dy(III))和鉻 (Cr(III)或Cr3+)。在某些實施方案中，順磁性離子是鑭系元素原子Gd (III)，因為其具有高磁矩(u 2 = 63BM2)、對稱電子基態(S8)，而且最近被批准用於哺乳動物診斷應用。「序列同一性百分比」意即通過在比較窗口比較兩個最佳比對序列所測定的值，其中為了兩個序列的最佳比對，在比較窗口中多核苷酸序列或多肽序列部分與參考序列(不包含添加、取代或刪除)比較時，可包含添加、取代或刪除(即空隙)。百分比通過以下方法計算確定在兩個序列中都存在的同一的核酸鹼基或胺基酸殘基的位置數量，得到匹配的位置數，用匹配的位置數除以比較窗口中的位置總數，將該結果乘以100，得到序列同一性百分比。本文所用術語「生理條件」指通常存在於哺乳動物身體中的條件。因此，生理條件意即pH約6. 5-約7. 5，溫度介於約36°C -約39°C之間。本文所用術語「信號發生劑」指能夠提供可用一種或多種檢測技術(例如光譜測定法、熱量測定法、光譜學或視覺檢查)檢測的信號的分子。可檢測信號的合適實例可包括光學信號及電子信號或放射性信號。用於本發明方法中的信號發生劑實例包括例如生色團、螢光團、拉曼活性標籤、放射性標記、酶、酶底物或其組合。適宜的放射性同位素可包括 H-3、C-ll、C-14、F-18、P-32、S-35、I-123、I-124、I-125、I-131、Cr-51、Cl-36、Co-57、Fe-59、 k-75和Eu-152。滷素同位素(例如氯、氟、溴和碘)和包括鎝、釔、錸和銦等在內的金屬亦為有用的標記。可用作信號發生劑的典型金屬離子實例包括Tc-99m、1-123、In-Ill、 I-131、Ru-97、Cu-67、Ga-67、I-125、Ga-68、As-72、Zr-89、Gd-153 和 T1-201。用於通過正電子發射斷層掃描術(PET)體內成像診斷的放射性同位素包括C-ll、F-18、Ga-68和1-124。可以是金屬離子的順磁性標記以金屬絡合物或金屬氧化物顆粒的形式存在。適宜的順磁性同位素可包括 Gd-157、Mn-55、Dy-162、Cr-52 和 Fe_56。「親水性胺基酸」指按照艾森柏格疏水性標度的規範化一致要求表現出小於零的疏水性的胺基酸。遺傳編碼的親水胺基酸包括Thr⑴、Ser⑶、His (H)、Glu (E)、Asn (N)、 Gln (Q)、Asp (D)、Lys (K)禾口 Arg (R)。「疏水性胺基酸」指按照艾森柏格疏水性標度的規範化一致要求表現出大於零的疏水性的胺基酸。遺傳編碼的疏水胺基酸包括Pro (P)、lie (I)、Phe (F)、Val (V)、Leu (L)、 Trp (W)、Met (M)、Ala (A)、Gly (G)和 Tyr (Y)。「非極性胺基酸」指具有在生理pH時不攜帶電荷的側鏈的疏水性胺基酸，其具有在其中由兩個原子共同分享的電子對的鍵，所述鍵通常由兩個原子中的每一個同等維持(即側鏈無極性)。遺傳編碼的極性胺基酸包括=Leu (L)、Val (V)、lie (I)、Met (M)、Gly (G)和 Ala(A)。短語「胃腸外給予，，指不通過口攝取或直接引入消化道將物質或化合物引入受試者的任何手段，所述手段包括但不限於皮下注射、腹腔注射、肌內注射、靜脈注射、鞘內注射、大腦內注射、腦室內注射或脊柱內注射或者它們的任何組合。本文所用短語「PDGRF-β相關病理學」，通常指其中PDGRF-β的表達模式為症候群、疾病或其它病理狀況的原因或與症候群、疾病或其它病理狀況相關的任何病況，例如但不限於肝纖維變性、肝硬化或肝功能異常或其任何組合。「極性胺基酸」指具有在生理pH時不攜帶電荷的側鏈的親水性胺基酸，但其至少有一個其中由兩個原子共同分享電子對的鍵，所述鍵由兩個原子中的一個更緊密地保持。極性胺基酸包括 Asn (N)、Gln (Q)、Ser (S)和 Thr (T)。關於螺旋多肽的術語「支架」，通常指多肽的那些殘基，它們提供三維結構以適當地確定多肽結合界面殘基的位置，以使其能夠結合靶標。本文所用術語「信號發生劑」指能夠提供可用一種或多種檢測技術(包括例如光譜測定法、熱量測定法、光譜學或視覺檢查)檢測的信號的分子。本文所用術語「活性基團」指使得羰基對親核試劑(例如N-羥基琥珀醯亞胺、磺基-N-羥基琥珀醯亞胺、醯基氯、脲中間體)更易反應的任何基團。本文所用術語「醛反應性末端」指能與醛官能團反應的任何官能團。某些醛反應官能團的實例包括但不限於-0ΝΗ2、-CONHNH2, -NHNH2, -NHCONH2和-NHCSNH2。醛反應官能團也可以是受到保護的衍生物，所述衍生物可以在與醛反應前去保護，或在與醛反應期間原位去保護。醛反應性末端的保護基團的某些實例包括烷氧基羰基、芳氧基羰基、環烷氧基羰基、烷基磺醯基、芳基磺醯基、環烷基磺醯基及膦醯基。醛反應性末端的保護基團的某些具體實例包括叔丁氧基羰基、三苯基甲基、9-芴基甲基羰基、苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、4-疊氮基苄基氨基甲酸酯、4-硝基苄氧基羰基、9-芴基甲氧羰基、2，4_ 二硝基苯磺醯基和二苯基膦醯基。本文所用術語「脂肪族自由基」或「脂肪族基團」，通常指不是環形的碳原子的任何排列，其具有SP3碳原子連接點。碳原子的排列可進一步包含SP3、SP2或SP雜化的碳原子的任意組合。另外，碳原子的排列可為單價、二價或三價。烷基實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異辛基、苄基、環己基甲基、苯乙基、1』，1』 - 二甲基苄基等。
本文所用術語「環境溫度」指通常存在於臨床或實驗室設置中的溫度。因此，環境溫度的範圍可介於約0°c -約37°C。本文所用術語「芳香族自由基」或和「芳香族基團」，指Sp2雜化的碳原子和共軛的碳-碳雙鍵的環狀排列，並在芳香族的SP2雜化的碳原子上有連接點，所述連接點形成碳原子環狀排列的一部分。芳香族基團或自由基可以有一到所允許的最大數量的取代基。芳基實例包括苯基、取代的苯基、甲苯基、取代的甲苯基、二甲苯基、三甲苯基、氯苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基等。本文所用術語「環烷基自由基」或「環烷基基團」，指SP3雜化的碳原子的環狀排列， 並在SP3雜化的碳原子處有連接點，所述連接點形成碳原子環狀排列的一部分。碳原子的排列可進一步包含sp3、Sp2或sp雜化的碳原子的任何組合。而且，碳原子的環狀排列可被一到所允許的最大數量的取代基取代。此外，環原子的排列可包含雜原子，例如0、N或S。環烷基實例包括環己基、甲基環己基、三甲基環己基、苯基環己基、四氫吡喃基、4-硫雜環己基、環辛基等。本文所用術語「自由基」和「基團」，如施用到術語「烷基」、「脂肪族的」、「環狀脂肪
族的」和「芳香族的」，可互換使用。本文所用術語「取代」，通常指因化學反應而產生一個或多個元素或自由基的替代。適宜的取代基包括烷基、烷基芳基、芳基、芳烷基和雜芳基，其中殘基上最多三個H原子被以下基團取代低級烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、滷代烷基、烷氧基、羰基、羧基、羧基烷氧基、羧基氨基、醯氧基、脒基、硝基、滷素、羥基、OCH(COOH)2、氰基、伯氨基、仲氨基、醯氨基、烷基硫代、亞碸、碸、苯基、苄基、苯氧基、苄氧基、雜芳基或雜芳氧基。本文所用術語「硫醇反應性末端」，指可與硫醇基團(thiol group或mercaptan group，即-SH基團)反應的官能團。硫醇反應性官能團的實例包括但不限於馬來醯亞胺基、滷代脂肪基、滷代芳香基、滷代環脂肪基、(滷代乙醯基)烷基、(滷代乙醯基)環烷基、 (滷代乙醯基)芳基、α，β-不飽和碸基團、乙烯基碸基團、α，β-不飽和羰基、環氧基、氮丙啶基團和能夠與硫醇基發生硫醇交換反應的二硫基。術語「能夠與硫醇基發生硫醇交換反應的二硫基」，指可與生物分子的硫醇基(例如多肽的硫醇基)反應的基團。因此，可認為二硫基為硫醇反應基團。吡啶基二硫化物為所述二硫基的合適的實例。合適的馬來醯亞胺基包括母(未被取代)基團以及包含作為取代基的脂肪族基團、環脂肪族基團或芳香族基團的衍生物。合適的α，不飽和羰基包括那些包含丙烯醯基的基團。合適的α，β-不飽和羰基包括α，β-不飽和酯和α，β-不飽和碸。乙烯基碸基團是α，β-不飽和碸基團的具體實例。本文所用術語「氟取代的醛」，意指具有至少一個氟取代基的含醛化合物。另外，氟取代基可以為任何同位素變化，例如F-18和F-19。而且，醛可以是脂肪醛、環脂肪醛或芳香醛。此外，環脂肪醛和芳香醛可以有單環、雙環或多環結構。實施方案一般而言，當將多肽結合PDGF-R用作檢測劑時，可通過添加標記(例如螢光團或放射性同位素)對其進行修飾以產生信號。可用標準固相合成技術產生結合多肽。或者，可用重組技術產生所述多肽。在用重組技術產生多肽的實施方案中，可分離編碼多肽或其保守變體的DNA。可將編碼多肽或其保守變體的DNA插入到克隆載體中，導入宿主細胞(例如真核細胞、植物細胞或原核細胞) 中，並用任何公認的表達系統進行表達。不論多肽的生產是使用肽合成技術還是重組技術，生成的多肽可以主要包含單一手性形式的胺基酸殘基。因此，本發明的多肽可主要包含L-胺基酸或D-胺基酸；但亦可採用L-胺基酸和D-胺基酸組合。由於本文提供的多肽來源於蛋白A的Z結構域，所以結合界面上的殘基可被保守取代，同時保留結合活性。在某些實施方案中，取代的殘基可以是任何20個天然存在的胺基酸或其任何類似物。本文提供的多肽基本上由49-71個殘基長度的多肽組成。多肽的長度可為約49 個殘基到約130個殘基。表 1.
權利要求
1.PDGF-Ri3顯像劑，所述顯像劑包含用信號發生劑標記的SEQ. ID號1、2、3、4、5、6、7、8、9或其保守變體中的任何多肽，其中所述多肽特異性地與PDGFR-β結合。
2.權利要求1的顯像劑，其中多肽具有與由Α772細胞、U87細胞或Μ231細胞表達的 PDGFR- β至少IOnM的結合親和力。
3.權利要求1或權利要求2任一項中的顯像劑，其中所述多肽包含選自SEQ.ID號1、 2、3、4、5、6、7、8、9中的至少兩種胺基酸序列，以形成多價多肽。
4.權利要求1-3中任一項的顯像劑，其中所述多價多肽包括兩個重複胺基酸序列，所述兩個重複胺基酸序列具有大於90%的序列同一性，以產生二價同源的多肽。
5.權利要求1-4中任一項的顯像劑，其中所述信號發生劑包含順磁性標記、放射性核素或螢光團。
6.權利要求5的顯像劑，其中所述信號發生劑為放射性核素，並選自氟、碘、鎝、鎵或釓。
7.權利要求6的顯像劑，其中所述氟包含WF。
8.權利要求6的顯像劑，其中所述18F經由氨氧基接頭與所述多肽連接。
9.權利要求6的顯像劑，其中所述18F經由氨氧基接頭在所述多肽的N-末端與多肽連接。
10.權利要求6的顯像劑，其中所述碘包含123I。
11.權利要求10的顯像劑，其中所述123I經由氨氧基接頭與所述多肽連接。
12.權利要求10的顯像劑，其中所述123I經由氨氧基接頭在所述多肽的N-末端與多肽連接。
13.權利要求10的顯像劑，其中所述鎝包含99mTc。
14.權利要求13的顯像劑，其中所述99mTc經由二胺二肟螯合劑與所述多肽連接。
15.權利要求14的顯像劑，其中所述二胺二肟螯合劑包含cPn216。
16.權利要求14的顯像劑，其中所述99mTc經由二胺二肟螯合劑在所述多肽的N-末端與所述多肽連接。
17.權利要求5的顯像劑，其中所述信號發生劑為選自157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe的順磁性標記。
18.權利要求17的顯像劑，其中所述順磁性標記經由選自ΝΟΤΑ、DOTA、DTPA的螯合劑與所述多肽連接。
19.權利要求6的顯像劑，其中所述放射性核素由Gd-153或fei-67、Co_55、Co_57、 Cu-64、Cu-67、Zr-89、Y-86 組成。
20.權利要求19的顯像劑，其中所述放射性核素標記經由選自ΝΟΤΑ、DOTA、DTPA的螯合劑與所述多肽連接。
21.在哺乳動物中對PDGF-Rii相關疾病狀況成像的方法，所述方法包括將用信號發生劑標記的SEQ. ID號1、2、3、4、5、6、7、8、9或其保守變體中的任何多肽引入所述哺乳動物，其中所述多肽與PDGFR- β特異性結合，這使得所述試劑可遷移到所述疾病組織，對所述疾病組織成像，利用及任選管理所述疾病狀態。
22.權利要求21的方法，其中所述哺乳動物是人。
23.權利要求21的方法，其中所述PDGF-Rii相關疾病狀況是肝纖維變性、肝硬化或肝功能異常或其組合。
24.權利要求21的方法，其中所述成像方法選自PET、SPECT、MRI、放射成像和光學成像。
25.權利要求21的方法，所述方法進一步包括在成像成像步驟前、成像後或成像前後對哺乳動物治療，並應用所述結果來管理疾病狀態。
26.權利要求21的方法，其中所述試劑分散在PH約為6 約8的藥學可接受溶液中。
全文摘要
本發明提供的是PDGF-Rβ顯像劑，所述顯像劑為信號發生劑(例如順磁性標記、放射性核素或螢光團)標記的多肽，其中所述顯像劑與PDGFR-β特異性結合。亦提供用所述顯像劑在體內成像的方法。
文檔編號A61K51/08GK102316903SQ200980157221
公開日2012年1月11日 申請日期2009年12月17日 優先權日2008年12月17日
發明者B·D-L·李, C·倫德爾, E·貢內裡烏松, F·A·休德, M·E·馬裡諾, M·林德博裡, P·謝菲爾, R·張 申請人:通用電氣公司