一種發形霞水母硫氧還蛋白及其編碼基因與應用的製作方法

2023-05-22 13:16:56 2

專利名稱：一種發形霞水母硫氧還蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥技術領域，具體涉及一種發形霞水母硫氧還蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
水母屬刺胞動物門，是一類分布廣泛、生物總量非常龐大的海洋浮遊生物。已有大量研究表明，水母體內富含多種生物活性物質，包括水母毒素蛋白和一些活性強烈、具有良好開發前景的新功能蛋白。水母類浮遊於4-6米深的海水錶層，長期生活在強烈的光輻射環境下。氧化損傷是紫外輻射造成機體損傷的重要機制之一，已有研究表明，浮遊生物為避免或減少紫外輻射造成的損害，經過長期適應性選擇，在其機體內產生了種類繁多、結構特異、活性強烈的抗氧化活性物質。發達的抗氧化體系在保護細胞和生物體免受光及感光色素等損傷中起重要作用， 能保護強光紫外對生物體的輻射，清除輻射反應中產生的自由基。已有研究發現，發形霞水母觸手提取物具有很強的體外抗氧化活性，對活性氧族的清除能力遠比常用的抗氧化劑維生素C強。通過硫酸銨沉澱、凝膠過濾層析等方法也分別從水母Rhopilema esculentum、Stomolophus meleagris中分離出多種具有明顯清除自由基功能的蛋白。這些結果均表明，水母體內含有活性強烈的抗氧化活性組分，是抗氧化、抗輻射活性物質的重要來源。儘管如此，目前對水母體內抗氧化系統的組成、重要抗氧化酶類(蛋白)的序列信息、表達情況、抗氧化活性水平等尚未有系統的了解。硫氧還蛋白(Thioredoxin, Trx)是一類廣泛存在於各種生物體內作為氫載體的小分子氧化還原蛋白，分子量為10 12kDa，均含有一個高度保守的活性結構位點WCGPC。硫氧還蛋白可以使蛋白的二硫鍵還原為雙巰基，從而對機體內多種生物反應過程進行調節，包括調節轉錄因子DNA結合活性、細胞抗氧化應激、細胞凋亡過程、抗脅迫作用、抗腫瘤、促進免疫應答等。硫氧還蛋白與硫氧還蛋白還原酶、NADPH共同構成硫氧還蛋白系統，能夠對機體內被氧化損傷的蛋白質進行還原修復與重新摺疊，調節體內多種酶活力，通過可逆的雙硫鍵和硫醇變化在保護機體應對氧化應激、保持細胞內環境穩定等方面發揮重要還原載體的作用。此外，在一些活性氧過量產生的情況下，硫氧還蛋白的表達量亦大量增加，作為生物體內活性氧清除劑來減少或避免機體的氧化損傷。在機體因衰老引起活性氧增加導致細胞凋亡的過程中，硫氧還蛋白還可以結合調控某些細胞因子，抑制細胞凋亡和機體衰老。目前，國內外尚未見對水母硫氧還蛋白的有關研究報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種發形霞水母硫氧還蛋白及其編碼基因，本發明的另一目的在於提供該發形霞水母硫氧還蛋白在製備抗氧化藥物、抗輻射藥物、皮膚防護劑、食品防腐劑、抗衰老藥物等中的應用。本發明通過構建發形霞水母觸手組織cDNA文庫，並對該文庫重組克隆的序列進行測定和注釋分析，獲得了發形霞水母硫氧還蛋白的編碼基因。該發形霞水母硫氧還蛋白是首次發現的具有明顯抗氧化活性的水母類硫氧還蛋白，是水母體內抗氧化系統的重要活性組分，該蛋白在抗氧化、抗輻射藥物研究中具有良好的應用前景。本發明的主要技術方案是，通過構建發形霞水母觸手組織cDNA文庫，對其進行測序和篩選，獲得發形霞水母硫氧還蛋白的編碼基因，並對其抗氧化活性進行研究。本發明的第一方面，提供了一種發形霞水母硫氧還蛋白，所述的一種發形霞水母硫氧還蛋白，具有如下(i)或(ii)的蛋白質:( i )具有SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(ii)SEQ ID NO:2所示的胺基酸序經取代、缺失和/或添加一個或幾個胺基酸且同等功能的由(i )衍生的蛋白質。所述的一種發形霞水母硫氧還蛋白，具有如SEQ ID NO: 2所不的氣基酸序列，該蛋白不含信號肽，為非分泌蛋白，定位於細胞質，分子量為11.5kDa，等電點為5.1。本發明還提供了一種發形霞水母硫氧還蛋白的編碼基因，為如下(i )或(ii )的DNA分子:( i )具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；(ii )與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列同源性在80%以上的核苷酸序列。所述的一種發形霞水母硫氧還蛋白的編碼基因，該核苷酸序列全長479bp，包含一個315bp的開放閱讀框，如SEQ ID NO:1所示。本發明的第二方面，提供了一種發形霞水母硫氧還蛋白的製備方法，該方法包括如下步驟:(I)構建發形霞水母觸手組`織cDNA文庫；(2)對上述發形霞水母觸手組織cDNA文庫重組克隆的序列進行測定和分析，獲得一個編碼硫氧還蛋白的核苷酸序列；(3)構建發形霞水母硫氧還蛋白的表達質粒，重組工程菌；(4)發形霞水母硫氧還蛋白的表達；(5)重組發形霞水母硫氧還蛋白的純化。所述步驟(I)中的發形霞水母觸手組織cDNA文庫通過如下方法構建:I)抽提發形霞水母觸手組織總RNA ；2 )分離mRNA，合成發形霞水母觸手組織cDNA ；3)將上述cDNA插入pUC19質粒載體，再轉化至大腸桿菌DH5a中，塗布於LB培養基平板進行藍白斑篩選，即構建成發形霞水母觸手組織cDNA文庫。所述步驟(3 )中的構建發形霞水母硫氧還蛋白的表達質粒，重組工程菌，具體步驟為:I)根據發形霞水母硫氧還蛋白基因序列以及原核表達載體pET24a的酶切位點，設計一對帶有特異性酶切位點Nde I和Xho I的PCR引物，如下所示:上遊引物:5』 -GCGGGAATTCCATATGGTTAGAGA-3 』下遊引物:5』 -CCGCTCGAGTTTATGACTCTTAATC-3 』PCR 反應條件為:95°C保溫 5min ;95°C保溫 30sec，55.5°C保溫 30sec，68°C保溫lmin, 30 個循環；68°C保溫 5min ；2)酶切回收後的PCR產物及pET24a原核表達質粒；
3)利用兩個酶切位點將編碼序列連接到pET24a載體上，構建重組表達質粒，然後轉化到大腸桿菌BL21(DE3)獲得重組工程菌。所述步驟(4)中的發形霞水母硫氧還蛋白的表達條件為:25°C、lmM IPTG、150rpm/min下誘導8小時，在此誘導條件下重組蛋白主要以可溶形式表達，表達量佔總蛋白量的50%以上。所述步驟(5)中的純化為採用鎳離子親和層析柱一步純化即得，洗脫條件為分別佔總體積50%的結合緩衝液與50%的洗脫緩衝液；其中，結合緩衝液為NaH2P0420mM;NaC1500mM;咪唑 30mM ；pH7.4，洗脫緩衝液為 NaH2P0420mM; NaC1500mM;咪唑500mM ；pH7.4。本發明的第三方面，提供了發形霞水母硫氧還蛋白及其編碼基因在製備抗氧化藥物、抗輻射藥物、皮膚防護劑、食品防腐劑、抗衰老藥物中的應用。本發明通過構建發形霞水母觸手組織cDNA文庫，採用BLASTx分析法，獲得了一個編碼硫氧還蛋白的序列，即包含序列表SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。此核苷酸序列全長479bp,包含一個315bp的開放閱讀框,編碼一個含105個胺基酸殘基的蛋白質，即序列表SEQ ID N0.2所示胺基酸序列。該蛋白不含信號肽，為非分泌蛋白，定位於細胞質，具有典型的硫氧還蛋白功能結構域。本發明通過構建硫氧還蛋白基因的原核重組表達載體，將重組表達載體轉化大腸桿菌宿主細胞，篩選得到表達發形霞水母硫氧還蛋白的重組菌，誘導表達後利用親和層析法純化獲得重組蛋白，該製備方法簡單，成本低廉。本發明獲得的重組發形霞水母硫氧還蛋白具有顯著的抗氧化活性。胰島素還原法實驗中，在DTT存在的情況下，胰島素A、B鏈間的二硫鍵可以被上述硫氧還蛋白還原而斷裂，兩鏈解離，因B鏈的溶解度較低使反應液變渾濁，在655nm處吸光值明顯升高，且重組發形霞水母硫氧還蛋白的濃度越高，吸光值上升越快，說明其具有明顯的二硫鍵還原能力。另夕卜，上述硫氧還蛋白還具有ABTS自由基清除能力，抗氧化能力為維生素C等價物Trolox的
6.5倍。因此，本發明中涉及的發形霞水母硫氧還蛋白在開發抗氧化藥物、抗衰老藥物、抗輻射藥物、皮膚防護劑、食品防腐劑方面將有很大的應用價值。


圖1為發形霞水母硫氧還蛋白與其他物種硫氧還蛋白的序列多重比對；其中，黑色代表完全同源的區域，方框標出了其高度保守的活性結構位點WCGPC。 圖2為本發明中擴增發形霞水母硫氧還蛋白開放閱讀框編碼序列的PCR產物核酸電泳結果；其中，M:2kb的核酸分子量Marker ；1:PCR產物。圖3為本發明中重組發形霞水母硫氧還蛋白誘導表達的SDS-PAGE電泳結果；其中，M:蛋白分子量Marker ；1:未誘導的pET24a大腸桿菌；2:經誘導的pET24a大腸桿菌；3:誘導前的發形霞水母硫氧還蛋白重組大腸桿菌；4:誘導後的發形霞水母硫氧還蛋白重組大腸桿菌；5:誘導後的發形霞水母硫氧還蛋白重組大腸桿菌超聲裂解上清；6:誘導後的發形霞水母硫氧還蛋白重組大腸桿菌超聲裂解沉澱；圖4為本發明中重組發形霞水母硫氧還蛋白分離純化的SDS-PAGE電泳結果；

其中，1:誘導前的發形霞水母硫氧還蛋白重組大腸桿菌；2:誘導後的發形霞水母硫氧還蛋白重組大腸桿菌超聲裂解上清；3:純化重組蛋白時穿透峰；4:純化重組蛋白時洗脫峰；圖5為檢測純化發形霞水母硫氧還蛋白抗氧化能力(ABTS+自由基清除法)時用維生素C等價物Trolox反應而製作的標準曲線(y=_0.0005x+0.2979，R2=0.9976)。圖6為檢測純化發形霞水母硫氧還蛋白對胰島素A、B鏈間二硫鍵還原作用能力的曲線圖。
具體實施例方式下面結合實施例和附圖對本發明進行詳細描述。但下列實施例不應看作對本發明範圍的限制。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。用實施例1製得的發形霞水母硫氧還蛋白進行實施例2-3的實驗。本發明選擇的發形霞水母(Cyanea Capillata)採集自浙江省三門灣海域,並經集美大學水產學院教授鑑定(L.Xiao et al, Toxicon, 2009，53:146 - 152)。實施例1:發形霞水母硫氧還蛋白的篩選及製備。1.發形霞水母觸手組織cDNA文庫的構建和分析I)發形霞水母觸 手組織總RNA的抽提根據Invitrogen公司的Trizol試劑說明進行，氯仿去除蛋白質，獲得約7 μ g總RNA ；2)mRNA 的分離按照 QIANGEN 公司的 Oligotex mRNA Spin-coIumn Kit 說明進行，cDNA 的合成則參照 Clontech 公司的 SMART cDNA Library Construction Kit 說明進行；3)將cDNA插入pUC19質粒載體(購自Takara公司),再轉化至大腸桿菌DH5 α (購自北京博邁德公司)中，塗布於15CM培養皿進行藍白斑篩選，即構建成發形霞水母觸手組織cDNA文庫。該文庫共有菌落1923個，其中藍斑35個，重組率98.18%，庫容量1.92*106，插入長度彡400bp的有效序列1035條,採用100bp、90%的原則對這些序列進行unigene歸併，得到unigene數為528條。同時對序列進行全長分析，在20條序列中有12條序列有相關同源信息，結果為其中12條全長，完整性比率:12/12X100%= 100%，表明該cDNA文庫具有較好的質量。對該cDNA文庫進行隨機測序，所得序列經去載體後進行BLASTx分析(http://blast.ncb1.nlm.nig.gov)。2.發形霞水母硫氧還蛋白基因序列的分析發形霞水母硫氧還蛋白基因來自上述cDNA文庫中編號為2F09的克隆。序列全長479bp，包含一個315bp的開放閱讀框，編碼含105個胺基酸殘基的蛋白質，分子量11.5kDa，等電點5.1。Blastx搜索結果顯示該蛋白與多個物種的硫氧還蛋白高度同源(如圖1),是水母來源硫氧還蛋白家族的新分子。對其進一步的生物信息學分析顯示，該蛋白不含有信號肽，為非分泌蛋白，定位於細胞質。3.發形霞水母硫氧還蛋白重組表達質粒的構建及工程菌重組I)根據發形霞水母硫氧還蛋白基因序列以及原核表達載體pET24a (購自Novagen公司)的酶切位點，設計併合成一對引物，其中上遊引物包含酶切位點Nde I (CATATG)，下遊引物包含酶切位點Xho I (CTCGAG)，兩引物的序列具體如下:上遊引物:5，-GCGGGAATTCCATATGGTTAGAGA-3』(SEQID NO:3)下遊引物:5』-CCGCTCGAGTTTATGACTCTTAATC-3』 (SEQ ID N0:4)經過梯度PCR實驗後，選定55.5°C為最佳退火溫度，對目的基因進行PCR大量擴增，PCR反應條件為:
權利要求
1.一種發形霞水母硫氧還蛋白，其特徵在於，所述的發形霞水母硫氧還蛋白具有如下(i )或(ii )的蛋白質: (i )具有SEQ ID NO:2所不的氣基酸序列組成的蛋白質； (ii )SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列經取代、缺失和/或添加一個或幾個胺基酸且同等功能的由(i )衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的一種發形霞水母硫氧還蛋白，其特徵在於:所述的發形霞水母硫氧還蛋白具有如SEQ ID N0:2所示的胺基酸序列，該蛋白不含信號肽，為非分泌蛋白，定位於細胞質，分子量為11.5kDa，等電點為5.1。
3.—種如權利要求1所述的發形霞水母硫氧還蛋白的編碼基因，其特徵在於，該編碼基因為如下(i )或(ii )的DNA分子: (i )具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列； (ii )與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列同源性在80%以上的核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的一種發形霞水母硫氧還蛋白的編碼基因，其特徵在於:所述的發形霞水母硫氧還蛋白的編碼基因，該核苷酸序列全長479bp，包含一個315bp的開放閱讀框。
5.一種如權利要求2所述的發形霞水母硫氧還蛋白的製備方法，其特徵在於，該方法包括如下步驟: (A)構建發形霞水母觸手組織cDNA文庫； (B)對上述發形霞水母觸手組織cDNA文庫重組克隆的序列進行測定和分析，獲得一個編碼硫氧還蛋白的核苷酸序列； (C)構建發形霞水母硫氧還蛋白的表達質粒，重組工程菌； (D)發形霞水母硫氧還蛋白的表達； (E)重組發形霞水母硫氧還蛋白的純化。
6.根據權利要求5所述的發形霞水母硫氧還蛋白的製備方法，其特徵在於:所述步驟(A)中的發形霞水母觸手組織cDNA文庫通過如下方法構建: a)抽提發形霞水母觸手組織總RNA； b)分離mRNA，合成發形霞水母觸手組織cDNA； c)將上述cDNA插入pUC19質粒載體，再轉化至大腸桿菌DH5a中，塗布於LB培養基平板進行藍白斑篩選，即構建成發形霞水母觸手組織cDNA文庫。
7.根據權利要求5所述的發形霞水母硫氧還蛋白的製備方法，其特徵在於:所述步驟(C)中的構建發形霞水母硫氧還蛋白的表達質粒，重組工程菌，具體步驟為: a)設計併合成PCR引物如下: 上遊引物如SEQ ID NO:3所示， 下遊引物如SEQ ID N0:4所示， PCR 反應條件為:95°C保溫 5min ;95°C保溫 30sec，55.5°C保溫 30sec，68°C保溫 lmin，30個循環；68°C保溫5min ； b)酶切回收後的PCR產物及pET24a原核表達質粒； c)利用兩個酶切位點將編碼序列連接到pET24a載體上，構建重組表達質粒，然後轉化到大腸桿菌BL21獲得重組工程菌。
8.根據權利要求5所述的發形霞水母硫氧還蛋白的製備方法，其特徵在於:所述步驟(D)中的發形霞水母硫氧還蛋白的表達條件為:25°C、lmM IPTG、150rpm/min下誘導8小時。
9.一種如權利要求1或2所述的發形霞水母硫氧還蛋白在製備抗氧化藥物、抗輻射藥物、皮膚防護劑、食品防腐劑或抗衰老藥物中的應用。
10.一種如權利要求3所述的發形霞水母硫氧還蛋白的編碼基因在製備抗氧化藥物、抗輻射藥物、皮膚防護劑、·食品防腐劑或抗衰老藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬於生物醫藥技術領域，目前尚未見對水母硫氧還蛋白的有關研究報導。本發明提供了一種發形霞水母硫氧還蛋白，所述的發形霞水母硫氧還蛋白，具有如SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列組成的蛋白質。本發明還提供了發形霞水母硫氧還蛋白的編碼基因，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。同時，本發明還提供了發形霞水母硫氧還蛋白及其編碼基因在製備抗氧化藥物、抗輻射藥物、皮膚防護劑、食品防腐劑、抗衰老藥物等中的應用。本發明具有較大的臨床應用價值。
文檔編號C12N9/02GK103232979SQ20131018993
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月21日 優先權日2013年5月21日
發明者阮增良, 柳國豔, 張黎明, 趙傑, 溫小娟, 尹慢慢, 陸佳, 劉丹 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學