一種重組人胰島素及其類似物的製備方法

2023-05-22 17:38:21

專利名稱：一種重組人胰島素及其類似物的製備方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域。更具體地，本發明提供一種新型N-端前導肽序列的人胰 島素原或其類似物分子(PreproinsuUn)，及一種利用該分子生產人胰島素的方法，以及有關的 表達載體與丄程細胞的構建、人胰島素原的表達和純化工藝。
背景技術：
糖尿病是僅次於心血管和腫瘤的第三大致死疾病，現今世界上已有2億糖尿病患者，而 且每年新增約600萬新病例，每年死於糖尿病及相關併發症者達到320萬(2006年6月美國 糖尿病年會報告)。胰島素從20世紀20年代用於治療糖尿病，現在仍是無法替代的糖尿病特 效藥，而且在治療中使用胰島素的劑量為mg水平。每個I型糖尿病病人每天需要用胰島素 1.4-2.1mg，II型糖尿病患者對胰島素也有相當大的需求，導致發達國家每年要消耗胰島素4600 公斤。隨著糖尿病患者人群的擴大和胰島素用藥方式的多樣化(口服給藥、肺部給藥和口腔 噴霧給藥等)，胰島素的用量迅速增加。因此，提高胰島素的產量，降低胰島素的生產成本， 滿足廣大糖尿病患者用藥的需求，不僅具有重要的經濟意義，而且具有重要的社會意義。
現有技術
重組人胰島素是人類使用基因工程的方法生產的第一個生物工程藥物，並成功上市。從 國內國際市場的發展趨勢來看，重組人胰島素已逐步取代用提取法製備的動物胰島素。
目前重組人胰島素及其類似物的生產採用了兩套系統，其一是用酵母系統(CN1414974A; CN1873006A; CN1125081C); 其二是用大腸桿菌系統(；CN1163600C; CN1011073006A; JuanA.Asenjo， CRCPress, 1990)。酵母系統採用了分泌人胰島素原類似物的方式，分泌出來的人胰島素前體己具有了天然的二硫鍵及正確的N-端。缺點在於酵母菌生長滿，導致生產周 期長，且表達水平很低。應用大腸桿菌表達重組人胰島素生產的方式主要包括三種方式一 種是美國禮來公司1982年採用的重組大腸桿菌分別表達胰島素的A鏈和B鏈，表達產物經 溴化氰(bromine cyanide, CNBr)切下融合導肽片段後，得到的A鏈和B鏈經純化後再進行 復性，最後得到有活性的重組人胰島素。由於該方式的復性率只有10%左右，採用這條工藝 生產的胰島素成本太高。第二種也是美國禮來公司建立的，目前仍然是諸多公司生產重組人 胰島素的主要方式。由於正常序列的人胰島素原(B-C-A)在大腸桿菌中不穩定而容易降解， 通常採用融合蛋白的形式，將人胰島素原接在一個較大的N-端融合蛋白後面，大大增加了胰 島素原的表達量(10%-30%) (Castellanos-Serra, et al. 1996; Tikhonov, et al. 2001),表達產物通 過溴化氰釋放出人胰島素原。由於C肽的存在，胰島素原能形成良好的空間構象，摺疊率到 達70%，從而在一定程度上降低了胰島素的生產成本。第三種方式是丹麥諾和諾德公司採用 的A、 B鏈同時表達的方法，在A鏈前端和A、 B鏈中間均有甲硫氨酸。表達產物經溴化氰 處理，得到A鏈和B鏈，再經過復性和純化得到有活性的重組人胰島素，這種方式與第一種 方式存在著同樣的因為復性效率帶來的成本問題。
另外，在應用大腸桿菌表達體系方面，美國禮來公司實驗室(Heath, et al. 1992)使用了倒 置胰島素原(A-B-C)在大腸桿菌系統的非融合形式表達，有一定的意義。倒置胰島素原復 性率較高，後加工也有所簡化，但是表達效率較低(10%),後加工時副反應強烈，從而阻礙 了這一方案在工業中的應用。該公司還開發了應用短導肽(僅兩個胺基酸)表達正常人胰島 素原及其類似物的方法(Belagaje, et al. 1997)。這類方法的優點是短導肽對胰島素原的復性沒 有影響，可以在復性後由胰蛋白酶切除，避免了溴化氰的使用。同吋由於短導肽僅兩個氨基 酸殘基，有效地增加了表達產物中胰島素原的比例，具有一定優勢，但表達量較低，在7%-15% 間。
綜上所述，現有的重組人胰島素的生產方法中存在表達量較低或者在生產過程中使用劇毒溴化氰的技術缺陷。雖然應用大腸桿菌系統的第二種方式在一定程度上有效的提高了融合 胰島素原的表達量，但是胰島素原在表達產物中所佔比例較低。而溴化氰的使用，可能對環 境產生較大汙染，操作條件苛刻。本發明綜合現在胰島素表達生產遇到的問題，提供了一類 新型含有N-端前導肽序列的人胰島素原或其類似物分子，並提供了一種利用該胰島素原分 子，採用大腸桿菌高密度發酵體系生產人胰島素原的方法，可以大大提高胰島素原的表達量， 而且克服現有技術中存在的使用有毒有害物質溴化氰的技術缺陷。

發明內容
本發明的目的就是提供一種用於製備重組人胰島素及其類似物的新型胰島素前體。 本發明的另一目的就是提供一種利用該新型胰島素前體高效簡便的生產人胰島素或其類 似物的方法。
本發明的再一 目的就是提供用於該方法的表達載體及工程細胞。
本發明的目的是通過以下技術方案來實現的
本發明的第一方面，提供了一種用於製備重組人胰島素及其類似物的新型胰島素前體， 其特徵在於，所述前體從氨基端至羧基端分別含有以下元件
(a) 具有式Met-Ser-(Xaa)mZi所示的導肽元件，式中Xaa為20種天然胺基酸中任一種， m為0-30的正整數，Zi為Arg或Lys;
(b) 人胰島素B鏈或其類似物；
(c) 具有式Z2(Xaa)nZ3所示的連接肽元件，式中Xaa為20種天然胺基酸中任一種，n 為非負整數或者0， Z2為Arg或Lys， Z3為Arg或Lys;
(d) 人胰島素A鏈或其類似物。
在一優選例中，導肽元件Met-Ser-(XaaV^式中m=0， &為Arg且所述的導肽元件序列為MSR。
在另一優選例中，導肽元件Met-Ser-(Xaa)mZi式中m=2， Z！為Aig，且所述的導肽元件 序列為SEQ ID NO:l所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，導肽元件Met-Se"Xaa^Z！式中m=4， Zx為Arg，且所述的導肽元件 序列為SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，導肽元件Met-Ser-(Xaa)n^式中m=6, Zi為Arg，且所述的導肽元件 序列為SEQ ID NO:3所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，導肽元件Met-Ser-(Xaa)m^式中n^10， A為Arg，且所述的導肽元件 序列為SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，導肽元件Met-Ser-(XaaVZi式中m-12， Z,為Arg，且所述的導肽元件 序列為SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述的連接肽元件為人胰島素C肽。
本發明的第二方面，提供了一種分離的DNA序列，它編碼本發明上述的新型胰島素前 體。還提供了含有所述DNA的表達載體，以及含有表達載體或所述DNA的宿主細胞。
在一優選例中，表達載體是上海一就生物醫藥有限公司提供的pAmk大腸桿菌表達質粒。 在另一優選例中，宿主細胞是五sc/ien'c/w'a co/"DHl)。
本發明的第三方面，提供了一種製備胰島素或其類似物的方法，包括從表達上述新型胰 島素前體並從前體中釋放和分離胰島素或其類似物的過程。
本發明的一種用於製備重組人胰島素及其類似物的新型胰島素前體能帶來如下技術效 果該類前體能在上海一就生物醫藥有限公司提供的pAmk大腸桿菌表達體系中實現高表達 量的表達，胰島素原在表達產物中所佔比例達到96.6% (Met-Ser-Aig-proinsulin，簡稱 MSR-proinsulin)。該類前體能有效的應用常規胰島素原復性方法復性，在轉化成為胰島素或 胰島素類似物時只須用胰蛋白酶和羧肽酶B就能釋放胰島素或胰島素類似物分子，不使用溴200 化氰，適合大規模生產重組人胰島素或其類似物。


圖1 質粒pAmk-MS-proinsulin結構圖。
圖2重組質粒pAmk-MS-proinsulin部分基因測序結果。
圖3 SDS-PAGE電泳顯示pAmk-MS-proinsulin的表達和純化。1.標準分子量蛋白(kDa); 2.載荷pAmk-MS-proinsulin質粒的大腸桿菌BL21 (DH1)細胞全蛋白(乳糖誘導後)；3.載 荷pAmk-MS-proinsulin質粒的大腸桿菌BL21 (DH1)細胞全蛋白(乳糖誘導前)；4.陰離子 交換層析(DEAE-52)純化後的MS-proinsulin。
圖4 SDS-PAGE電泳顯示純化的重組人胰島素。1.純化後的MS-proinsulin; 2.純化的重組 人胰島素(氧化態)；3.標準品人胰島素(氧化態)；4.純化的重組人胰島素(還原態)；5.標 準品人胰島素(還原態)。
圖5純化的重組人胰島素AutoflexToF/ToF (BrukerDaitonics)質譜圖。
圖6胰島素的HPLC檢測結果，A為本發明製備的重組人胰島素，B為標準品人胰島素。
具體實施例方式
以下通過附圖及實施例對本發明做進一步說明
材料
(1) 菌株和質粒
宿主菌Escherichia coli(DHl)是基因工程常用工具菌種，在與基因工程研究有關的實驗室 一般都有保存。
質粒pET28a-23DT-proinsulin和質粒pAmk均由本公司實驗室構建並保存。
(2) 酶和試劑
分子克隆工具酶和試劑、質粒抽提試劑盒為普洛麥格(Promega)公司產品，PCR回收 試劑盒和瓊脂糖膠回收試劑盒為上海華舜生物工程公司產品。
標準品天然人胰島素、胰蛋白酶和羧肽酶B購至上海生物工程有限公司。
7(3) 培養基
LB培養基，配方見參考文獻Sambrook J, Fristsh EF, Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。該書是基因工禾呈中支 術的經典著作，在許多高校圖書館都有收藏。
(4) Cellouse-DEAE: DEAE-52為Whatman公司產品。
方法
質粒提取、聚合酶鏈反應、內切酶酶切、DNA片段的回收、連接和轉化大腸桿菌，這些 在基因工程研究領域都是常規操作方法，參見Sambrook J， Fristsh EF， Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Piess， 1989， pp. 16-340。
重組蛋白表達量的測定參見Sambrook J, Fristsh EF, Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989，方法進1亍。
實施例1 MSR-proinsulin重組基因工程菌的構建 1.1 MS-proinsulin基因的獲得
以pAmk為模板，設計引物P1和P2，兩條引物核苷酸序列如下 PI: 5，GGAATTGTGAGCGGATAACA3， P2: 5'AAAACGACTCATAACGTATTCCTCT3'
通過PCR的方法擴增pAmk中Ascl酶切位點與表達導肽MS之間的片段。將其命名為 fragment-MS。使用Pfu DNA聚合酶擴增，擴增條件為94 °C， 45s、 53°C， 45s、 72°C， 30s。 共30個循環。PCR產物用DNA膠回收試劑盒純化回收130bp左右的條帶。
以本實驗室構建的pET28a-23DT-proinsulin設計引物P3和P4: P3: 5'ATGAGTCGTTTTGTCAATCAGCACC3'P4: 5，CCGCCATGGCGCTTTTGATCC3，
擴增pET28a-23DT-proinsulin中胰島素原與Nco I酶切位點之間片段。將其命名為 fragment-proinsulin。使用Pfu DNA聚合酶擴增，擴增條件為94 。C， 45s、 68°C， 120s。共30 個循環。PCR產物用DNA膠回收試劑盒純化回收580bp左右的條帶。
利用重疊區延伸法獲得MS-proinsulin基因由於引物P2的5'端與引物P3的5'端有12 個鹼基的互補，所以以fragment-MS與fragment-proinsulin為模板，通過PCR擴增，在退火 時可以使fragment-MS基因的單鏈與fragment-proinsulin基因的單鏈配對，通過DNA聚合酶 的作用，得到將fragment-MS與fragment-proinsulin連接的片段。命名為 fragment-MSR-proinsulin。使用Pfu DNA聚合酶擴增，擴增條件為94 °C， 45s、 57°C， 50s、 72°C， 80s。共30個循環。
PCR產物用DNA膠回收試劑盒純化回收710bp左右的條帶。 1.2 pAmk-MS-proinsulin質粒的構建及相應重組基因工程菌的構建
將擴增純化後的fragment-MSR-proinsulin基因片段用Asc I與Nco I進行雙酶切，酶切後 產物用PCR產物純化試劑盒回收酶切產物。
採用鹼裂解法對pAmk質粒進行抽提，抽提得到的質粒也用Asc I與Nco I進行雙酶切， 酶切反應結束後用膠回收試劑盒回收大片段DNA。
將上述酶切回收後得到的fragment-MSR-proinsulin基因片段和pAmk質粒大片段用T4連接 酶進行連接，連接產物轉化大腸桿菌&c/tm'c/u'fl co/z' BL21(DH1)，篩選後得到含有 fragment-MSR-proinsulin前體胰島素原蛋白基因的重組質粒的基因工程菌，稱為 pAmk-MS-proinsulin重組基因工程菌，其結構示意圖見附圖l。從該工程菌中提取重組質粒， 委託上海英俊公司進行核酸序列分析，進一步驗證MS-proinsulin前體胰島素原蛋白基因及其 讀碼框的正確性，其結果見附圖2。
9實施例2 pAmk-MS-proinsulin重組基因工程菌發酵表達
從pAmk-MS-proinsulin重組基因工程菌的培養平板上挑取單菌落，接種於含有25 y g/ml 鏈黴素的LB液體培養基中，於37'C恆溫振蕩培養過夜，按1免比例轉接種入20升LB液體培養 基(25 U g/ml鏈黴素)中，並加入終濃度為0.5mmol/L的a-乳糖誘導表達融合蛋白MS-proinsulin。 誘導後12小時離心問收菌體(共計溼菌體5kg)， 15免SDS-PAGE電泳再經薄層掃描顯示已經實 現了MS-proinsulin前體胰島素原蛋白基因的表達，表達的蛋白佔細菌總蛋白的44.2%，結果見 附圖3。
實施例3 MS-proinsiilin前體胰島素原蛋白的分離純化
誘導表達後的工程菌經離心回收菌體，將菌體懸浮在菌體裂解液(pH8.0， 50mMTris-Cl， 0.5%TritOnX-100， 0.02%溶菌酶)中，37。C攪拌過夜。離心回收沉澱，沉澱經包涵體洗滌液 (pH8.0， 50mMTris-Cl, 0.2% Triton X-100)、低濃度尿素溶液(pH8.0， 50mMTris-Cl， 3M 尿素)洗滌，洗滌後離心回收沉澱。沉澱裂解於高濃度尿素中(pH8.0， 50mM Tris-Cl， 7M 尿素)，離心回收上清。上清經亞硫酸鹽解(亞硫酸鈉、連四硫酸鈉)，陰離子交換(DEAE-52) 層析純化。層析用緩衝液包含pH8.0， 50mMTris-Cl， 7M尿素，梯度洗脫用0-0.3M NaCl梯度 進行，目的蛋白層析峰經SDS-PAGE電泳檢測已達到電泳純，結果見附圖3。
實施列4 MS-proinsulin前體胰島素原蛋白轉化為人胰島素
為形成正確的二硫鍵，將純化後的MS-proinsulin前體胰島素原蛋白(-S-磺酸鹽)溶解於 含有50mM甘氨酸的緩衝液pH10.6中，濃度為0.5g/1。在巰基乙醇(10mol/mol前體胰島素原) 作用下，4'C攪拌過夜，然後用磷酸調節pH至3.5,離心去除沉澱。上清液用50mMTris調節pH 至9.0，按質量比l: IOOO-I: 1000 (E/S，即酶/前體胰島素原)分別加入胰蛋白酶和羧肽酶B， 37。C反應30min，產物經陰離子交換層析(DEAE-52)純化。層析用緩衝液包含pH9.0， 50raMTris-Cl，梯度洗脫用0-0.8M NaCl梯度進行，胰島素析峰經SDS-PAGE電泳檢測已達到電泳純， 結果見附圖4。目的峰經脫鹽、凍幹後保存。
凍幹品經AutoflexToF/ToF 〔Bruker Daitonics)質譜測定分子量為5807.29Da，與理論分 子量相比誤差為0.01%，見附圖5。
實施列5重組人胰島素RP-HPLC檢測
實施例4中純化的重組人胰島素和人胰島素標準品，分別按美國藥典USP28th的方法進行 RP-HPLC檢觀U，見圖6。結果表明重組人胰島素和人胰島素標準品具有同樣的RP-HPLC保留性質。上海一就生物醫藥有限公司 —種重組人胰島素及其類似物的製備方法
5
1
5 PRT 人工序列
當m=2時導肽元件的序列 1
Met Ser Leu Asn Arg 1 5
2 7 PRT 人工序列
當ra=4時導肽元件的序列 2
Met Ser Leu Asn Thr Ser Arg 1 5
3 9 PRT 人工序列
當m=6時導肽元件的序列 3
Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Arg 1 5
4 13 PRT人工序列
當m-lO時導肽元件的序列 4
Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Arg 1 5 10
5 17 PRT 人工序列
當m=12時導肽元件的序列 5
Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gin Glu Glu Arg 15 10 1權利要求
1. 本專利涉及一種用於製備重組人胰島素及其類似物的新型胰島素前體。
2. 條款l所述的胰島素前體，其特徵在於，所述前體從氨基端至羧基端分別含有以下元件a) 具有式Met-Ser-(XaaV^所示的導肽元件，式中Xaa為20種天然胺基酸中任一種，m為 0-30的正整數，Zi為Arg或Lys;b) 人胰島素B鏈或其類似物；c) 具有式Z2(Xaa)nZ3所示的連接肽元件，式中Xaa為20種天然胺基酸中任一種，n為非負 整數或者O， Z2為Aig或Lys， Z3為Arg或Lys;d) 人胰島素A鏈或其類似物。
3. 條款1或2所述的前體，其特徵在於a) 當m-O時，導肽元件的序列為MSR;b) 當m=2時，導肽元件的序列為SEQ ID N0:1所示的胺基酸序列；c) 當m=4時，導肽元件的序列為SEQ ID N0:2所示的胺基酸序列；d) 當m=6時，導肽元件的序列為SEQ ID N0:3所示的胺基酸序列；e) 當m=10時，導肽元件的序列為SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列；f) 當m-12時，導肽元件的序列為SEQIDNO:5所示的胺基酸序列。
4. 一種分離的DNA序列，其特徵在於，它編碼條款l-3中一項或多項所述的胰島素前體。
5. —種表達載體，其特徵在於，它含有條款4所述的DNA序列。
6. —種宿主細胞，其特徵在於，它含有條款5所述的表達載體或含有條款4所述的DNA序列。
7. —種製備胰島素或其類似物的方法，其特徵在於，表達條款1-3中一項或多項所述的胰島素 前體並從前體中釋放並分離胰島素或其類似物。
8. 條款l中的重組人胰島素類似物包括甘精胰島素、谷甘胰島素、賴脯胰島素、門冬胰島素等。
全文摘要
本發明提供了一種新型N-端前導肽序列的人胰島素原或其類似物分子(Preproinsulin)，及一種利用該分子生產人胰島素的方法，以及有關的表達載體與工程細胞的構建、人胰島素原的表達和純化工藝。將編碼帶有本發明N-端前導肽序列的人胰島素原或其類似物的核酸序列導入原核表達載體，再轉入大腸桿菌中實現該類分子以包涵體形式的表達。產物具有表達量高、易純化、製備方法不使用CNBr、加工成為重組胰島素過程工藝簡單的優點。
文檔編號C12R1/19GK101519446SQ20091003004
公開日2009年9月2日 申請日期2009年3月31日 優先權日2009年3月31日
發明者景 侯, 劉景晶, 劉素麗, 劉言華, 婧 孔, 張笑巖, 楊亞男, 豪 範, 勇 魯 申請人:上海一就生物醫藥有限公司