染色體核型分析質控細胞建株及質控方法
2023-05-22 14:36:01 1
專利名稱：染色體核型分析質控細胞建株及質控方法
技術領域：
本發明涉及染色體核型分析質控細胞建株及質控方法，主要用於各醫療單位細胞遺傳實驗室或產前診斷實驗室作染色體核型分析時的質量控制。
染色體核型分析就是對染色體的結構和數目有否異常進行分析。染色體由DNA、組蛋白和RNA組成，而DNA由帶有遺傳信息的基因組成。人類有23對染色體，其中22對為常染色體，1對為決定男女性別的性染色體，任何人體如果染色體數目增多或減少，或某染色體有缺失或結構改變，均會發生相應的染色體病，臨床表現為智力低下、發育障礙、性異常、死胎流產等異常妊娠、不育不孕、原發或繼發閉經等染色體病特徵。染色體常位於細胞核內，經細胞培養、製片、染色後，可在顯微鏡下分析染色體有無數目和結構異常，作為胎兒產前染色體病的診斷指標，或出生後染色體病的診斷指標。某些實驗項目的質量控制就是由各醫療或科研機構的主管部門將已知某種物質(含量)的質控品定期分發給受控實驗室檢測，根據受控實驗室對質控品的測定值，通過與質控品實際值的比較處理，可知實驗測定值與質控品實際值的差距，從而全面系統地考核受控實驗室的儀器、器材、試劑等實驗條件及實驗人員的技術水平，對質控試驗不合格的實驗室，要求其作出整改措施，這就是實驗項目的質量控制。但目前尚未見國內外文獻報導以及有相關實驗室用淋巴細胞建株的方法來製備染色體核型分析質控細胞並作相關的室內與室間質量控制。
本發明的目的是要提供以淋巴細胞建株的方法來製備染色體核型分折質控細胞系(株)以及這類質控細胞系(株)的保存和質控方法。
本發明的目的是這樣實現的取已確診的各類染色體病患者(可包括部分染色體正常者)的外周血、骨髓或羊水標本，用常規淋巴細胞分離液經離心分離出的白細胞(包括淋巴細胞)與RPMI1640細胞培養液及EB病毒(EBV)轉化液定量混合，經37℃5％CO2培養箱中培養，EBV能選擇性地轉化人類B淋巴細胞，並使其成為持續分裂、永久生存的細胞系或細胞株，當細胞數達到105/ml時，離心培養液收集細胞沉澱，根據細胞數量加入定量的凍存液使成105/ml的細胞懸液，以每管1mL的量分裝在凍存管中，置-20℃2h，再置-70℃2h，然後凍存在-196℃液氮中作為備用的質控細胞，用時復甦質控細胞，經進一步培養增殖細胞數後或直接分發給受控實驗室，作細胞培養及染色體製片核型分析，受控實驗室將實驗結果反饋給質控管理機構，以判斷受控實驗室是否準確地鑑定出質控細胞的異常染色體。
本發明主要由已確診的染色體結構或數目異常的臨床病例包括21三體型、18三體型、13三體型、5P部分單體、45XO、X三體綜合症、47XXY、47XYY、各類嵌合體、染色體易位、缺失、倒位、環狀以及等臂染色體等染色體病患者外周血淋巴細胞、骨髓細胞或羊水胎兒細胞作為原代細胞，以常規淋巴細胞分離液分離出淋巴細胞(包括白細胞)，運用常規細胞培養基培養法以及EB病毒(EBV)能選擇性地轉化人類B淋巴細胞、並使其成為持續分裂、永久生存的細胞系或細胞株的原理，經凍存和復甦，來製備染色體核型分析專用的質控細胞系(株)，凍存備用，經實驗證實，淋巴細胞在經EBV轉染持續分裂的過程中染色體數目與結構不會發生改變，即使有所改變，也剛好用來考核受控實驗室鑑別染色體核型改變的水平(參考實驗室與受控實驗室同時做)，且可建立核型異常染色體細胞庫，為其他相關科研提供異常染色體的細胞系(株)。
本發明的細胞培養液(基)選用RPMI1640培養基，其配方是稱取市售RPMI1640培養基粉末10.4g，溶於1000ml的雙蒸水中，40℃保存，有效期為1至2個月，存放-20℃可較長期保存，也可選用市售的TC199、Eagle、Ham’s F10、F12、MEM等培養基，B95-8細胞株為狨猴B淋巴細胞株，可由中科院遺傳研究所提供，B95-8細胞株經復甦後在RPMI1640培養基中培養4-7天，上清液中可得到含大量EBV的EBV懸液，凍存液含95％胎牛血清及5％二甲亞碸。
本發明按以下具體方法進行染色體核型分析質控細胞建株並進行質量控制。
外周血淋巴細胞染色體核型分析質控細胞建株及質控方法取已確診為相關染色體病患者的靜脈血5-10ml，肝素抗凝，放無菌離心管中3000rpm離心30分鐘，取血漿及其與紅細胞層之間的灰白色白細胞層，放入另一離心管中，用RPMI1640培養基洗滌3次，然後用2mlRPMI1640重懸，加入EBV懸液1.2ml，環孢菌素A 0.4ml混勻，等份轉入兩個10ml培養瓶中，置37℃5％CO2培養箱中，培養24-48h後觀察細胞轉化生長情況，當細胞數達到105/ml時，將細胞懸液收集到10ml離心管中1200rpm離心10分鐘，棄上清液，加入凍存液，分裝在數支凍存管中，每管1ml凍存液，將蓋擰緊，標明質控細胞名稱、代數、凍存日期及操作人，置-20℃2h，再置-70℃2h後放入-196℃液氮罐中保存。此即為染色體核型分折質控細胞，需用質控細胞來做質控時，將質控細胞復甦，方法是取出凍存管，迅速入37℃水浴，不斷震搖，儘快融化，然後離心去上清液，用新鮮培養液清洗細胞懸液一次，用培養液適當稀釋後裝入培養瓶，37℃培養，次日更換培養液，以後按常規培養、製片、染色、作染色體核型鑑定。如果要將質控細胞運送到較遠的實驗室，可用液氮或乾冰保存運送法作短期運輸效果較好，或選生長狀態較好的細胞，待細胞生長達80％-90％匯合時，去掉舊培養液換入新培養液達到瓶的頸部，保留小許空間運輸，到達後倒出大部分培養液，保留正常量，置37℃培養，次日傳代培養，製片、染色、作染色體鑑定。骨髓染色體鑑定質控細胞的製備方法同外周血淋巴細胞質控細胞的製備方法。
羊水胎兒細胞染色體核型分析質控細胞建株及質控方法取已確診的染色體病患兒羊水以無菌操作分裝入若干個試管內，每管10-15ml，1000r/min離心10min，去上清液，留約1.5ml，輕輕混勻後，用RPMI1640洗3次，然後按外周血淋巴細胞染色體核型分析質控細胞建株及質控方法進行建株與質控。
染色體核型分析質控方法由質控主管機構、學術機構、參考實驗室及各受控實驗室組成質控網絡，由參考實驗室定期選擇數種染色體結構或數目異常的質控細胞發放給各受控實驗室，由受控實驗室將質控細胞與被檢細胞在同等條件下作細胞培養、製片、分帶及染色體鑑定，結果通過計算機網絡等方式反饋給參考實驗室；由參考實驗室核對其結果是否準確。
染色體核型分析質控結果評價方法可根據實際情況評分，如細胞培養質量指標包括培養後細胞總數、推成規定數量的細胞玻片後平均每高倍視野細胞數，染色體分裂像質量指標包括染色體分裂像分散度質量指標如計數100個分裂像以觀察46條染色體分布在油鏡視野的個數、染色體相交、相接的數量及染色體分裂像總數指標包括全部細胞片子可計算、可分析分裂像數目，染色體帶紋是否清晰顯示，特別是質控細胞中的異常染色體是否都被正確地鑑定出來等。
權利要求
1.一種用於醫療領域的染色體核型分析質控細胞建株及質控方法，其主要特徵是取已確診的各類染色體病患者(可包括部分染色體正常者)的外周血、骨髓或羊水標本，用常規淋巴細胞分離液經離心分離出的白細胞(包括淋巴細胞)與RPMI1640細胞培養液及EB病毒(EBV)轉化液定量混合，經37℃5％CO2培養箱中培養，EBV能選擇性地轉化人類B淋巴細胞，並使其成為持續分裂、永久生存的細胞系或細胞株，當細胞數達到105/ml時，離心培養液收集細胞沉澱，根據細胞數量加入定量的凍存液使成105/ml的細胞懸液，以每管1mL的量分裝在凍存管中，置-20℃2h，再置-70℃2h，然後凍存在-196℃液氮中作為備用的質控細胞，用時復甦質控細胞，經進一步培養增殖細胞數後或直接分發給受控實驗室，作細胞培養及染色體製片核型分析，受控實驗室將實驗結果反饋給質控管理機構，以判斷受控實驗室是否準確地鑑定出質控細胞的異常染色體。
2.根據權利要求1所述的染色體核型分析質控細胞建株及質控方法，其特徵是染色體病包含了所有染色體結構和數目異常的疾病。
3.根據權利要求1所述的染色體核型分析質控細胞建株及質控方法，其特徵是質控細胞是由各種染色體異常核型、正常核型及多態性核型的細胞製成的細胞系或細胞株。
4.根據權利要求1所述的染色體核型分析質控細胞建株及質控方法，其特徵是專用細胞培養基包含了RPMI1640、TC199、Eagle、Ham’sF10、F12、MEM。
5.根據權利要求1、3所述的染色體核型分析質控細胞建株及質控方法，其特徵是質控細胞凍存於液氮中實質就是建立一種以細胞系或細胞株形式保存各類異常染色體核型細胞的細胞庫。
6.根據權利要求1所述的染色體核型分析質控細胞建株及質控方法，其特徵是質控方法包含了由質控主管者、參考實驗室及受控實驗室組成並由計算機進行網上會診的質控網絡。
全文摘要
本發明提供了一種用於醫療領域的染色體核型分析質控細胞建株及質控方法，其主要特徵是以常規淋巴細胞分離法分離受試染色體異常核型患者及正常者外周血、骨髓或羊水中淋巴細胞，經與含EB病毒的RPMI1640培養液混合併置37℃5％CO2中培養，淋巴細胞被EB病毒轉化為持續分裂、永久生存的細胞系或細胞株，當細胞數達到10
文檔編號G01N33/50GK1916183SQ200510091259
公開日2007年2月21日 申請日期2005年8月19日 優先權日2005年8月19日
發明者翁炳煥 申請人:翁炳煥