來源於絲蛋白的促細胞生長肽的提取與應用的製作方法
2023-05-13 04:44:56
專利名稱：來源於絲蛋白的促細胞生長肽的提取與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及來源於絲蛋白的能極好促進細胞生長的肽，其製備方法，及其作為皮膚養護材料在藥物、準藥物(quasi drug)、化妝品等領域的應用，以及作為生物材料應用於細胞培養基質。
背景技術：
由於自從古時候絲線已經被用作為外科手術縫合線，因此絲蛋白被看作是生物相容的材料，並且最近，關注於此性質在各種領域的新用途的新發展變得活躍了。
例如，絲線溶解形成絲蛋白溶液，然後通過沉澱、乾燥、粉碎等轉化成粉劑從而用於化妝品的添加劑；將絲蛋白水溶液在平板等上澆鑄成薄膜狀材料用作細胞培養基質或傷口覆蓋包被材料；絲蛋白溶液被製成凝膠狀材料以用於食品和化妝品。這些應用的發展仍在繼續進行。
這樣的進展例子包括，如特開(日本未審查專利公開文本)62-000415，特公(已審查專利公開文本)01-044320，特開(日本未審查專利公開文本)01-254164，特公(已審查專利公開文本)06-004679，特開(日本未審查專利公開文本)11-139986，特開(日本未審查專利公開文本)11-276876，專利號2997758，專利號2990239，特開(日本未審查專利公開文本)11-253155，專利申請2002-230656，專利申請2002-148849，特開(日本未審查專利公開文本)2001-163899。(參見專利文獻1至12)。
在新絲綢材料的開發過程中，已經清楚了絲蛋白具有各種功能，比如促細胞生長作用，抗氧化作用，殺菌作用，酒精消化作用和抗血凝結作用。
可是還沒有闡明絲蛋白中的何位置或結構是造成那些功能的原因。
本發明人關注絲蛋白相關的細胞生長作用，並從事開發和研究其功能，目的在於，溶解蠶繭纖絲或絲線而後轉化成粉末、薄膜、膠(gel)等，然後，利用蠶繭纖絲或絲線用作用於傷口覆蓋材料的皮膚養護材料、化妝品以及改良的合成纖維材料(例如，參見專利文獻8，9，10，11及12)。
在以上開發和研究過程中，發現絲心蛋白的H和L鏈和絲膠蛋白a成分，都構成絲蛋白，它們對於來源於正常人皮膚的成纖維細胞有促進生長的作用(例如，參見專利文獻13、14和15)。
在另一方面，繭絲被用作纖維，除用於製衣之外，通過各種方法步驟將繭絲處理成生絲進而處理成絲纖維，還用於如下的領域，比如，醫療用品(外科手術的縫合線)、化妝品(蓬鬆劑)等，另外最近已經認識到在繭絲和生絲的這些加工過程中，絲蛋白的分子量會減少。
另外，在將繭絲或絲線轉化成粉末、薄膜、膠等的步驟中(尤其是繭絲或絲線的溶解步驟)，發現絲蛋白的分子量會減少[H.Yamada等，材料科學和工程C，14，41-46頁(2001)]，[Tubouchi Kouzou，Yamada Hiromi，Takasu Yoko日本蠶業科學協會學報，第71卷，第1期，第1-5頁(2001)](參見非專利文獻，非專利文獻2)。
通過這種加工減少分子量的絲蛋白在電泳圖譜上顯示為分子量介於10,000和200,000道爾頓範圍內的一片寬條帶。
那些低於10,000道爾頓的絲蛋白大都在透析等步驟中被去除了，而且實際上它們的分子量已減少到了胺基酸和寡肽的水平。
發現降低了分子量的絲蛋白具有減少的促人細胞生長活性或者抑制細胞生長(參見專利文獻11)。
換句話說，未降解的絲心蛋白和未降解的絲膠蛋白對促進細胞生長來說是極好的，然而在繭處理步驟中，通過用酸、鹼、光、熱等處理造成肽鍵複雜和異質(heterogeneous)的裂解會導致隨其分子量的減少而抑制細胞生長。
因此，為了利用絲蛋白促細胞生長功能之目的，優選使用未降解的絲心蛋白或未降解的絲膠蛋白、絲心蛋白H鏈(分子量，大約350,000)或L鏈、絲膠蛋白a(分子量，大約400,000)等未降解狀態。
可是，這三種成分(尤其是H鏈和絲膠蛋白a)有著巨大的分子量，在長期儲存中保持它們特性不變的穩定性是低的。
另外，按重量計算，絲心蛋白中僅含L鏈少於10％，其量很少。
再者，還未見報導闡明這三種成分之每一種的哪部分擁有促細胞生長活性。
特開(日本未審查專利公開文本)62-000415 特公(已審查專利公開文本)01-044320[專利文獻3]特開(日本未審查專利公開文本)01-254164[專利文獻4]特開(日本未審查專利公開文本)04-202435[專利文獻5]特公(已審查專利公開文本)06-004679[專利文獻6]特開(日本未審查專利公開文本)11-139986[專利文獻7]特開(日本未審查專利公開文本)11-276876[專利文獻8]專利號2997758[專利文獻9]專利號2990239[專利文獻10]特開(日本未審查專利公開文本)11-253155[專利文獻11]專利申請2002-230656[專利文獻12]專利申請2002-148849[專利文獻13]特開(日本未審查專利公開文本)2001-163899[專利文獻14]專利申請2001-180169[專利文獻15]特開(日本未審查專利公開文本)2002-128691[非專利文獻1]H.Yamada等，材料科學和工程C，14，41-46頁(2001)[非專利文獻2]
Tsubouchi Kouzou，Yamada Hiromi，Takasu Yoko日本蠶業科學協會學報，第71卷，第1期，第1-5頁(2002)[非專利文獻3]Tashiro Yutaka和Otsuki Eiichi，細胞生物學雜誌，第46卷，第1頁(1970)發明內容發明要解決的技術問題絲心蛋白H鏈和絲膠蛋白的a成分對於促進細胞生長是極好的，然而它們有著大於300,000的高分子量並且傾向於結晶化。
與這些相比，絲心蛋白L鏈的分子量為25,000，小於H鏈和a成分的分子量，但是它比普通蛋白質更容易具有結晶的傾向。
此外，按重量計算，絲心蛋白H鏈與L鏈的比率大約是13(H鏈)比1(L鏈)，L鏈的百分比是很小的。
高分子量與高結晶性的蛋白質在水溶液中是不穩定的。
另外，當向含有油性成分等的藥物或化妝品添加劑加入這些蛋白質時，會容易發生膠生成，轉變成不穩定的物理特性，並且在長期儲存中(長於1年)它們的穩定性低。
在另一方面，分子量小於絲心蛋白H鏈或絲膠蛋白a並對於細胞生長極好的物質包括各種細胞的生長因子，比如，成纖維細胞生長因子(FGF)具有介於17,700到19,000範圍內的分子量。
這些因子由腫瘤和癌細胞或迅速生長的細胞分泌，它們中的一些被用作治療皮膚潰瘍的藥劑(Fiblast噴霧劑，Kaken製藥有限公司)，但是它們的安全性令人擔憂。
本發明成功解決了這些問題。
也就是說，本發明的目的是獲得安全性、穩定性極好(這歸因於它們相對低的分子量)和促細胞生長作用的肽，，它們都不同於由像腫瘤細胞那樣的異常細胞所產生的細胞生長因子。
解決問題的手段為了解決以上問題，本發明發明人進行了辛勤研究並成功鑑定出位於絲心蛋白特定位置的肽鏈具有促細胞生長功能，由此完成本發明。
換句話說，本發明在以下方面(1)有重大意義，對於促進細胞生長極好的肽組合物，其包含一個或多個肽鏈的部分肽，該肽鏈選自形成構成絲蛋白的非晶體部分(noncrystalline portion)的肽鏈，其中所述部分肽具有由四至四十個胺基酸殘基所形成的特定胺基酸序列。
更具體地，本發明提供對促進細胞生長極好的肽組合物，其包含來自一個或多個肽鏈的部分肽，該肽鏈選自，構成家蠶(domesticated silkworm)絲的絲心蛋白H-鏈的N-末端部分(I)、非晶體部分(A)和C-末端部分(a)的各個肽鏈，其L-鏈的肽鏈，以及構成屬於半目大蠶蛾屬(Antheraea)之野生蠶(如天蠶(Antheraea Yamamai)的絲心蛋白的N-末端部分(I)、非晶體部分(A)和C-末端部分(a)的各個肽鏈，其中所述部分肽具有由四至四十個胺基酸殘基所形成的特定胺基酸序列。
另外，在第二方面(2)提供一種肽組合物，其中帶有以上特定胺基酸序列的肽鏈具有以下胺基酸序列(1)至(8)中的任意序列(1)A-6-2 VITTDSDGNE(2)A-6-6 NINDFDED(3)SfHE AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKN(4)SfHA GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT(5)AfH1 YGWGDGGYGSDS(6)AfH5 DEYVDN(7)AfH6 VETIVLEEDPYGHEDIYEED(8)AfH7 DDGFVLDGGYDSE此外，在第三方面(3)提供一種對於促進細胞生長極好的肽，其包含以下胺基酸序列(1)至(8)中的任意序列(1)A-6-2 VITTDSDGNE(2)A-6-6 NINDFDED(3)SfHE AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKN(4)SfHA GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT(5)AfH1 YGWGDGGYGSDS(6)AfH5 DEYVDN(7)AfH6 VETIVLEEDPYGHEDIYEED(8)AfH7 DDGFVLDGGYDSE
此外，在第四方面(4)提供一種從非晶體部分分離並獲得對於促進細胞生長極好的肽的方法，其通過水解來自於家蠶的未降解的絲蛋白或來自於屬於半目大蠶蛾屬的野生蠶的未降解的絲心蛋白，接著分子分級分離。
此外，在第五方面(5)提供一種上述第四項發明中的從非晶體部分分離並獲得對於促進細胞生長極好的肽的方法，其中水解是通過使用稀酸、羥胺或蛋白酶來進行的。
此外，在第六方面(6)和在第七方面(7)提供一種促細胞生長劑，其包含上述(1)和(2)中所述的肽組合物和上述(3)中所述的肽。
此外，在第八方面(8)和在第九方面(9)提供一種細胞粘附劑，其包含上述(1)和(2)中所述的肽組合物和上述(3)中所述的肽。
此外，在第十方面(10)和在第十一方面(11)提供一種傷口促癒合劑，其包含上述(1)和(2)中所述的肽組合物和上述(3)中所述的肽。
此外，在第十二方面(12)和在第十三方面(13)提供一種化妝品材料，其包含上述(1)和(2)中所述的肽組合物和上述(3)中所述的肽。
此外，在第十四方面(14)和在第十五方面(15)提供一種細胞培養基質(substrate)，其包含上述(1)和(2)中所述的肽組合物和上述(3)中所述的肽。
本發明成功地提供了對於細胞生長極好的新型的肽，其具有分子量小於10,000的特定的胺基酸序列，分子量優選在4,000至400的範圍內，其既可通過從絲蛋白的非晶體部分分離和分級分離肽，也可通過合成類似於這樣的肽的肽來獲得。
這些肽可以用作生物材料，例如，細胞粘附劑，促細胞生長劑，傷口促癒合劑，皮膚養護材料，如化妝品等，以及細胞培養基質。
實施本發明的最佳方式來自於絲蛋白非晶體部分的對於促進細胞生長極好的肽及其肽組合物通過如下過程獲得，並且也確定了它們的胺基酸序列。
(1)屬於半目大蠶蛾屬的野生蠶如家蠶或天蠶的蠶繭層脫膠之後，溶解於LiSCN水溶液中並離心分離。回收分離的上清液並用水透析。再次離心透析液，並回收分離的上清液。
(2)向經分離回收的純化的上清液中加入蛋白酶，如胰凝乳蛋白酶，進行水解處理。
(3)水解處理後的溶液的上清液(非晶體部分)同沉澱層(晶體部分(crystalline portion)分離並被回收。
(4)通過反相色譜分級分離上清液(非晶體部分)。
(5)將通過反相色譜分離的每個級分進行細胞培養。
(6)通過凝膠過濾色譜法，將對細胞生長極好的級分按分子量進行分級分離，並且測定具有高於對照級分2倍細胞生長率的級分(肽鏈)的胺基酸序列。
(7)基於獲得的肽，設計併合成出預期顯示極好促細胞生長作用的肽。
因此，本發明可以分離和分級分離來自於絲蛋白非晶體部分的分子量小於10,000，優選4,000至400範圍內的肽，該肽具有極好的促細胞生長活性，合成這種肽的類似肽，以及將這些肽用作生物材料，如細胞粘合劑，細胞生長促進劑，傷口促癒合劑，皮膚養護材料，如化妝品等，和細胞培養基質。
源於本發明絲蛋白的促細胞生長肽是指顯示出高於對照2倍細胞生長率的肽，其中對照按實施例1至3所述，在三天細胞培養測試中在不含外加肽的情況下進行細胞培養。
家蠶絲心蛋白的基本結構就家蠶來說，在吐絲的時候，蠶吐出絲蛋白以結成蠶繭(含有繭絲和蛹)。在繭絲中，其中心存在有絲心蛋白，而其周圍有絲膠蛋白，已知它們的存在比率是70％至80％(絲心蛋白)比20％至30％(絲膠蛋白)。
繭絲中絲心蛋白(絲蛋白指單獨的絲心蛋白或絲膠蛋白或指它們的結合體)的分子量大約為370,000。
(參見非專利文獻3)在大約370,000分子量的絲心蛋白中，大小為大約350,000的分子(H-鏈)和大小為大約25,000的分子(L-鏈)通過S-S鍵互相結合。
絲心蛋白H-鏈有非常高的分子量，其由相似的胺基酸殘基序列重複而組成。
根據Gen Bank登錄號AF 226688，H-鏈的前體蛋白由N-末端部分(I)、晶體部分(R)和非晶體部分(A)的重複部分、和C-末端部分(a)組成。
通過十二個晶體部分(R01至R12)間隔十一個非晶體部分(A01至A11)從而重複形成該重複部分。
晶體部分是由高度結晶性的二肽(Gly-X)大量重複組成，X是以高度結晶性的Ala(A)或外加Ser(S)作為主要成分，其另外的次要成分包括Tyr(Y)，Val(V)等。
尤其是GAGAGS或GA的重複很多見。
因此，在晶體部分中G和A的總量超過50％，並且能達到約70％以上。
非晶體部分的A01至A11肽就它們的胺基酸序列來說互相相似，每個胺基酸序列中只發現了微小差別。
另外，每個非晶體部分(A01至A11)中的G和A的總量少於50％。
從它們的胺基酸序列和胺基酸成分來看，N-末端部分和C-末端部分被認為是非晶體，與A01至A11相似，其各自G和A的總量均少於50％。
另一方面，非晶體部分中存在有一些部分，其中大約6至10個殘基的部分肽中G和A的總量會超過50％。
絲心蛋白H-鏈前體
I-R01A01R02A02R03A03R04A04R05A05R06A06R07A07R08A08R09A09R10A10R11A11R12-aN-末端部分IN-末端部分(I)是肽的起始部分，其胺基酸序列如下所示MRVKTFVILCCALQYVAYTNANINDFDEDYFGSDVTVQSSNTTDEIIRDASGAVIEEQITTKKMQRKNKNHGILGKNEKMIKTFVITTDSDGNESIVEEDVLMKTLSDGTVAQSYVAADAGAYSQSGPYVSNSGYSTHQGYTSDFSTSAAV晶體部分R01，R02，……，R12R01，R02，……，R12都是被稱為晶體部分的部分，每個晶體部分的胺基酸殘基數量大於300。可是應當注意到，R12的胺基酸殘基數量是54個。
每個晶體部分(R01至R11)中的G和A的總量超過約70％。
非晶體部分A01，A02，……，A11它們由28至32個胺基酸殘基組成並被稱為非晶體部分(A)。
它們的胺基酸序列如下所示A01 GSSGFGPYVANGGYSRSDGYEYAWSSDFGTA02 GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGTA03 GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGT
A04 GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGTA05 GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGTA06 GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGTA07 GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGTA08 GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGTA09 GSSGFGPYVNGGYSGYEYAWSSESDFGTA10 GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGTA11 GSSGFGPYVANGGYSRREGYEYAWSSKSDFETC-末端部分aC-末端的非晶體部分的胺基酸序列如下所示AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKNCGIPRRQLVVKFRALPCVNC為方便和參考以理解本發明，蛋白質中胺基酸或胺基酸殘基的符號、其電荷特徵等如下表10所示。
基於側鏈性質，胺基酸被分成四組，即酸性胺基酸，極性不帶電荷的胺基酸，非極性胺基酸和鹼性胺基酸(1)酸性胺基酸E，D(2)極性不帶電荷的胺基酸N，S，Q，Y，T，C，F(3)非極性胺基酸A，G，V，P，L，I，W(4)鹼性胺基酸H，K，R
在與絲心蛋白H-鏈晶體部分和非晶體部分的胺基酸序列比較後，如下所示的絲心蛋白L-鏈為非晶體部分。
絲心蛋白L-鏈中的胺基酸序列
MKPIFLVLLVATSAYAAPSVTINQYSDNEIPRDIDDGKASSVISRAWDYVDDTDKSIAILNVQEILKDMASQGDYASQASAVAQTAGIIAHLSAGIPGDACAAANVINSYTDGVRSGNFAGFRQSLGPFFGHVGQNLNLINQLVINPGQLRYSVGPALGCAGGGRIYDFEAAWDAILASSDSSFLNEEYCIVKRLYNSRNSQSNNIAAYITAHLLPPVAQVFHQSAGSITDLLRGVGNGNDATGLVANAQRYIAQAASQVHV另一方面，來源於野生蠶的絲蛋白的胺基酸序列不同於家蠶的，而屬於半目大蠶蛾屬的野生蠶，例如天蠶、柞蠶(Antheraea pernyi)、蓖麻蠶(SamiaCynthia ricini)、琥珀蠶(Antheraea assama)及Antheraea mylitta，它們幾乎有完全一樣的胺基酸序列。
對於天蠶的絲心蛋白，僅由10個或更多個丙氨酸殘基(A)重複而組成的部分被稱為晶體部分，除此之外的其它部分被稱為非晶體部分。
與家蠶的絲心蛋白相比，屬於半目大蠶蛾屬的野生蠶的絲心蛋白在晶體部分和非晶體部分的每個重複部分中有較少的殘基數量。
除了晶體部分(具有10個或更多個連續的丙氨酸殘基)，天蠶絲心蛋白的非晶體部分的胺基酸序列如下所示。
從胺基酸組成來看，N-末端部分和C-末端部分也是非晶體部分。
來自天蠶絲心蛋白的非晶體部分的基本結構
N-末端部分起始肽MRVTAFVILCCALQYATANNLHHHDEYVDNHGQLVERFTTRKHYERNAATRPHLSGNERLVETIVLEEDPYGHEDIYEEDVVINRVPGASSSAAAASSASAGSGQTIIVERQASHGAGGA非晶體部分
AGAAAGAAAGSSARGGSGFYETHDSYSSYGSGSSSAAAASSGAGGAGGGYGWGDGGYGSDSGSGAGGRGDGGYGSGSSRRAGHDHAAGSSGGGYSWDYSSYGSESGSGAGGVGGGYGGGDGGYGSGSSRRAGHDRAAGSSGAGGSGGGYGWGDGGYGSDSGSGAGRAGGDYGWGDGGYGSDSRQAGHERAAGSSGAGGSGRGYGWGDGGYGSDSGSGAGGAGGDYGWGDGGYGSDGSGAGGAGGDYGWGDGGYGSDSSGAGGAGGGYGWGDGGYGSDSSGAGGAGGYGGYGSDSSGAGGSGGGYGWGDGGYGSGSGSGAGGVGGGYGWGDGGYGSDSSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGAGGGYGWGDGGYGSDSRRAGHDRAAGCSGAGGTGGGYGWGDGGYGSDSSGAGGSGGGYGWGDGGYGSNSSGAGRSGGGYGWGDGGYSSDSSGAGGSGGYGGYGSDSGSGAGGVGGGYGWGDGGYGGYGSDSGSGAGGVGGGYGRGDSGYGSGSSGHGRSSGSSGAGGSGGGYGWDYGSYGSDSSSGAGGSGGGYGWDYGGYGSDSGSGAGGSGGGYGWGDGGYGSDSSRRAGHDRAYGAGSGAGASRPVGIYGTDDGFVLDGGYDSEGSC-末端部分SSSGRSTEGHPLLSICCRPCSHRHSYEASRISVH對於能極好促進細胞生長的絲蛋白的成分，本發明進行分析每個成分的哪一部分會帶來促細胞生長作用，發現該作用與非晶體部分相聯繫。
絲心蛋白的非晶體部分指的是具有上述胺基酸序列的部分。
因此，在非晶體部分中包含了N-末端部分和C-末端部分。
家蠶非晶體部分的A01至A11(28至32個殘基的肽)都顯示出極好的細胞生長促進作用，然而A01至A11的胺基酸序列是不同的。
在其32個殘基以外的8個殘基的範圍內，A11的胺基酸殘基序列不同於其他A01至A10中任一個的胺基酸殘基序列。
因此，即使胺基酸殘基序列有大約30％或更少的差異，也不會影響到促細胞生長活性。
而且，即使胺基酸殘基數量在大約20％的範圍內增加/減少，也不會影響到促細胞生長活性。
可是，優選胺基酸序列差異少於50％以保持促細胞生長活性。
另一方面，胺基酸殘基數量非常少的肽可能不會表現出促細胞生長活性。
尤其當胺基酸殘基數量不超過2個時，會抑制細胞生長。
因此，促細胞生長肽較好是4至40個殘基的肽，優選為6至32個殘基。
另外，發現了非晶體部分中包含較多酸性胺基酸殘基和/或極性不帶電荷的胺基酸殘基，而且幾乎沒有鹼性胺基酸殘基的部分肽能較好地具有促細胞生長作用。
尤其是酸性胺基酸殘基顯示出極好的促細胞生長活性。
非晶體部分作為一個整體來看有極好的促進生長活性，然而從局部來看，因為G和A的總量會超過55％並且包含大量的鹼性胺基酸，因而有一些胺基酸序列部分顯示出低的促進生長活性。
因此從絲心蛋白的非晶體部分分離和回收部分肽，其中有酸性胺基酸和/或極性不帶電荷的胺基酸並基本上沒有鹼性胺基酸。
在回收的部分肽中，將具有40個或更少胺基酸殘基並顯示出高於對照二倍細胞生長率的肽定為SDFGP，其中對照按實施例1至3所述，在細胞培養測試中沒有外加肽。
具有4至40個胺基酸殘基的多個肽的混合物也被定為是SDFGP，只要其細胞生長率顯示出高於對照2倍或更高的活性 。
對於上述情況，來自於非晶體部分的部分肽必須滿足以下各項，這從表6顯示的結果中就能容易地推斷出來(1)G和A的總量相對於肽中胺基酸殘基總數量不超過55％。這是因為較高的G和A的含量會易於形成晶體。
(2)鹼性胺基酸殘基的數量相對於肽中胺基酸殘基總數量不超過25％。
(3)其中存在酸性胺基酸和/或極性不帶電荷的胺基酸。
當這些條件不能被滿足時，細胞生長會被抑制。
關於這一點，胺基酸或肽的性質根據它們的側鏈化學結構而產生差異。
儘管酸性胺基酸對促細胞生長作用極好，但是因為E和D之間的側鏈長度有差異，因此它們之間的側鏈和主鏈的柔韌性或構象存在差異，從而導致不同的促細胞生長作用。
同樣地，這對被稱為極性不帶電荷的胺基酸或鹼性胺基酸的各種胺基酸也一樣正確，並且由於物理化學性質的變化，也不總是能產生相同的細胞促進與細胞抑制活性。
形成我們身體的細胞主要分成粘附細胞和流動(floating)細胞。
粘附細胞包括皮膚細胞、血管細胞、腺細胞等等。流動細胞包括血液細胞等。
粘附細胞的生長過程始於粘附，然後增殖，因此該過程大致被分成粘附和增殖。
本發明的SDFGP具有支持粘附和增殖的性質，而且這兩者相比，對粘附相對更好。
對增殖更好會導致細胞的異常增殖，並會使長期使用牽涉到安全性議題上。
因此，本發明的SDFGP，其對粘附效果良好，具有增殖促進作用，而且不抑制細胞生長，將其用作皮膚養護材料和生物材料是極好的。
實際上當從絲蛋白中分離並回收部分肽時，絲蛋白用裂解特定肽鍵的蛋白酶或用能達到相同目的的化學製品裂解，然後回收屬於非晶體部分並且不超過40個胺基酸殘基的肽。
另外，基於所得到的肽也可能設計出對細胞生長極好的肽，然後合成出該肽。
1.從絲蛋白中分離並回收肽為了分離並回收絲蛋白的非晶體部分，可以利用非晶體部分的特性。
由於非晶體部分易溶於水，可以在接近中性的水(pH5.0至9.0)中浸泡絲(silk)材料。
可是，僅僅通過浸泡絲材料並不能有效地獲得非晶體部分的肽。
因此要主動裂解絲蛋白的特定肽鍵。
該肽鍵裂解方法最好使用能主動裂解特定肽鍵的化學物質、酶等。
以下描述該方法。
1)原材料對於家蠶來說，使用的原材料是含絲心蛋白H-鏈、L-鏈並留有絲膠蛋白a成分的絲蛋白。
對於野生蠶(如，天蠶、柞蠶、蓖麻蠶、琥珀蠶及Antheraea mylitta等)來說，使用的原材料是這樣的原材料，其中能與家蠶的絲心蛋白H-鏈一樣清晰地在電泳圖譜中觀察到絲心蛋白的條帶。
原材料可以分別是絲心蛋白和絲膠蛋白，或是它們的共同體。
因此，本發明的原材料可以包括所有的繭絲、生絲、絲織品和編織品、絲線(絲心蛋白纖維)、其剩餘的線或纖維、粉、薄膜等可用作原材料的材料，以及由蠶(如家蠶和野生蠶)吐的蛋白纖維材料(絲材料)。
應當注意的是，這些材料必須包括家蠶的絲心蛋白H-鏈和絲膠蛋白a成分以及野生蠶的相應成分。
由於絲心蛋白H-鏈比L-鏈更易於降解，所以部分保留的H-鏈顯示出L-鏈大部分被保留而不降解。
2)材料的溶解性以上1)的用中性鹽溶解的材料可以是脫膠的材料，半脫膠的材料，未脫膠的材料，或其中間材料。
它可以是來自於蠶繭的絲膠蛋白纖維。
重點是在經過各種處理步驟後，它們的絲蛋白沒有降解，或絲心蛋白H-鏈、絲膠蛋白a成分及其相應蛋白質仍部分未降解。
H-鏈、a成分等是否保留被它們在電泳圖譜中各自相應的條帶所確證。
被用作生絲線增溶劑的中性鹽包括，例如，氯化鈣，乙二胺銅，硫代氰酸鈉，硫代氰酸鋰，溴化鋰，硝酸鎂等等。
中性鹽最好是處於飽和水溶液或者處於不小於50％飽和度的濃度[重量(g)/體積(ml)]中。
對於含有絲心蛋白和絲膠蛋白的情形，例如，繭絲，未脫膠材料，半脫膠材料等，均用以上中性鹽以溶解絲線的相似方式溶解。
另一方面，當絲膠蛋白如在蠶繭的絲膠蛋白纖維中的情況一樣，含量達到98％或更多時，以70至90攝氏度用8M尿素進行溶解10分鐘。
另外，蠶繭的絲膠蛋白纖維也可以在室溫(20至30攝氏度)用9M LiBr溶解30分鐘。
根據以上情況，溶解的條件可以變化。
在中性鹽溶液中溶解絲材料的步驟中，可以向中性鹽中加入醇，如甲醇、乙醇和丙醇。
當將氯化鈣用作中性鹽時，在不高於94攝氏度的溫度下進行溶解，優選在75至85攝氏度的範圍內。
當使用溴化鋰時，在低於大約50攝氏度的溫度下溶解原材料。因此，根據使用的中性鹽，溶解的條件會變化，並且使用可使絲心蛋白H-鏈和絲膠蛋白a成分保留的方法或其相應的方法來溶解。
在溶解絲材料期間，(1)可以通過攪拌加速溶解。
(2)在較低的溫度下溶解困難。
儘管較高的溫度可以使溶解變得容易，但是可能發生分子量急速降低。
除絲心蛋白或絲心蛋白和絲膠蛋白的混合物之外，用中性鹽溶解絲的溶液還包含中性鹽、醇等。
首先從該溶液中去除不溶材料，然後用透析膜或透析設備去除分子量小於5,000的低分子量化合物。
通過這樣的透析獲得了絲蛋白溶液。
3)用酶降解並回收通常而言，用蛋白酶進行的蛋白質裂解時裂解發生在特定的肽鍵上，而且由於裂解是在溫和條件下進行的，因此不易於發生胺基酸殘基側鏈上的修飾。
另外，可以避免產生蛋白質非特異性裂解所產生的複雜片段。
這樣的酶包括賴氨醯內切酶，精氨醯內切酶，胰凝乳蛋白酶，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，凝乳酶，胰酶，彈性蛋白酶等。
向絲蛋白水溶液加入蛋白酶，在特定肽鍵之間裂解絲蛋白。
在這些蛋白酶中間，尤其優選胰凝乳蛋白酶來分離晶體和非晶體部分。
來自絲蛋白的裂解的肽主要由絲蛋白晶體部分產生的片段組成，它們傾向於聚集和聚集為沉澱(凝結或結晶)。
既使它們的聚集幾乎沒有發生，但源於晶體部分的肽更容易傾向於聚集，而且將醇(甲醇、乙醇等)等作為凝結劑添加會引起衍生於晶體部分的肽所觸發的聚集，從而沉澱出來。
去除沉澱後，剩下的是來自於非晶體部分的肽的溶液。
為了去除沉澱，將含沉澱的溶液離心(1,000至10,000G)以去除沉澱。
無沉澱的溶液是源於非晶體部分的肽的水溶液，該肽是從非晶體部分分裂而成的。
乾燥該溶液，就得到了薄膜狀或粉狀的肽。
應當注意的是，將醇加入到產生自非晶體部分的肽的水溶液中時，非晶體部分的肽開始依次聚集，並隨著醇濃度的升高而沉澱出來。
來自非晶體部分的肽可以含有來自晶體部分的部分肽，只要後者在大約50％之內。
可是，要獲得對促進細胞生長極好的肽，即使肽是來自非晶體部分的，甘氨酸和丙氨酸殘基的總量也最好不要超過55％。
另外，鹼性胺基酸殘基的數量最好不要超過構成肽的殘基數的25％。
另一方面，酸性胺基酸殘基和極性不帶電荷的胺基酸殘基佔較大量是優選的。
特別地，酸性胺基酸殘基佔較大量對促細胞生長作用更好。
通過冷凍乾燥或噴霧乾燥的方法來進行乾燥。
即使來自非晶體部分的肽在乾燥後結晶，但由於它們較低的分子量，它們也很容易溶解在水中。
2.來自於絲蛋白的促成纖維細胞生長肽(SDFGP)的合成分離和回收的來自絲蛋白的SDFGP包括以下肽這些僅僅是SDFGP的實例。
不言而喻，有許多SDFGP滿足以上所述( 部分)的條件。
A-6-2 VITTDSDGNEA-6-6 NINDFDEDSfHE AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKNSfHA GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT
AfH 1 YGWGDGGYGSDSAfH 5 DEYVDNAfH 6 VETIVLEEDPYGHEDIYEEDAfH 7 DDGFVLDGGYDSE既使這些SDFGP中僅有一部分的胺基酸序列可用作能顯示出極好促細胞生長作用的SDFGP。
另外，可以在40個殘基範圍內重複這些肽或與其它肽相連。
可是，單一的胺基酸狀態卻不具有促細胞生長功能。
促細胞生長功能所必需的胺基酸殘基數不能少於4個殘基。
另一方面，考慮到肽合成的效率，優選殘基數是40個或更少。
可模擬絲蛋白非晶體部分的胺基酸序列合成SDFGP，並且合成出滿足以上所述( 部分)條件的肽。
合成肽的胺基酸殘基數為4至40個，優選6至32個。
在這種情況下，其胺基酸序列不必與絲蛋白的相同。
例如，絲心蛋白H-鏈的非晶體部分(A0至A11)的胺基酸序列並不完全相同，然而它們的生長促進活性大致相同，而且它們都與SDFGP一致。
因此，其胺基酸序列可以有大約30％或更少的差異，優選相差50％或更少。
在這種情況下，越多酸性胺基酸越好，而且優選存在極性不帶電荷的胺基酸。
相反，優選不含鹼性胺基酸。
換句話說，每個SDFGP的胺基酸殘基都可以用其他胺基酸殘基替換。
既然如此，鹼性胺基酸殘基數被設計為所構成肽中的25％或更少。
另一方面，在肽(SDFGP)中優選有較大量的酸性胺基酸。
全部胺基酸殘基可以由酸性胺基酸和/或極性不帶電荷的胺基酸組成。
因此，A-6-2的DSDGDE，A-6-6的DEDEDE和EDEDED，SfHA的SSESSE和YGGYEY，AfH1的DGGYGGD，AfHS的DEYDEY，AfHG的YEEDYEED，等等，以及另外許多別的肽，如EEEE，EEEEEE，EYEYEY，EEYEEY，YYYYYY，EGSEGS，都可以成為SDFGP。
不言而喻，只要它們在上述 所述的條件範圍內，並有10,000或更小的分子量，優選在4,000至400的範圍內，這些肽就可以被重複或與其他肽相連。
另外，胺基酸殘基可以用其他胺基酸殘基替換。
4.應用由絲蛋白和SDFGP的非晶體部分得到的肽不僅對於細胞生長促進作用極好，而且易溶於水。
另外，它們的分子量大約低於4,000，因而它們的形態(forms)在長期溶解狀態中能得以穩定。
更進一步，混合各種SDFGP可以較單個SDFGP促進更高的細胞生長。
所以，這些混合物可以加入細胞培養基質、洗劑、乳劑、乳油(cream)、油膏(ointment)、滴劑(instillation)、食品，等等。
由於本發明的肽和SDFGP對於促進皮膚細胞生長極好，所以對於皮膚養護、細胞培養，以及對於將來除以上領域之外的其他領域的改進，如織物纖維、化妝品粉末、樹脂等，它們是都是極好的材料。
蠶絲(silk)絲心蛋白酶消化液的細胞生長活性(1)絲綢絲心蛋白非晶體部分的酶降解，以及隨後的分離和分級分離切開家蠶的繭以去除蛹，在90攝氏度下，將繭層(10g)浸沒在30體積8M尿素中10分鐘以提取絲膠蛋白。
提取後的殘餘物用水洗，乾燥，並製備成絲心蛋白。
一克絲心蛋白浸沒於10ml 9M LiSCN中溶解。向其中加入10ml蒸餾水並以3,000rpm離心10分鐘。
上清液裝入半透膜管中，用50體積的水透析。
透析進行四次，每隔30分鐘換外部的透析液。
透析後，再次離心溶液，然後加入0.1M磷酸二氫鈉(pH8.5)調節其pH到7至8。
向該溶液加入相當於絲心蛋白1/100量的胰凝乳蛋白酶，40攝氏度放置4小時，之後沉澱會形成。
源於絲心蛋白非晶體部分(A)的上清液中的蛋白質或肽被叫做非晶體部分(A』)，源於晶體部分(C)的沉澱中的蛋白質或肽被叫做晶體部分(C』)。
晶體部分用水洗，溶於1ml 9M LiSCN中，並且使用上述半透膜管在50個體積的水中透析，然後測定水溶液中蛋白質的量。
不進行進一步處理就測定上清液中的蛋白質的量。
(2)塗在細胞培養容器上通過加入70％乙醇，該晶體部分(C』)和非晶體部分(A』)水溶液的濃度每個都各自調節到0.025％和0.0025％，1ml每種稀釋後的溶液裝進聚苯乙烯製成的培養皿(35mm，Falcon)中，然後空氣乾燥。
僅向培養皿中加入1ml 70％乙醇作為對照。
(3)細胞培養使用的細胞是人皮膚成纖維細胞(源於成人普通皮膚)，購(冷凍)於SankoJunyaku有限公司。
使用的培養基質是用於人皮膚成纖維細胞生長的低血清培養基質，購於Kurabo工業有限公司。[10ml LSGS(低血清生長補充劑)加入到500ml 106S培養基質(皮膚成纖維細胞的基本培養基質)中]。
應當注意到LSGS具有促細胞生長活性。
向每個培養皿加入2ml培養基質，並且接種80,000個細胞培養3天。
(4)用Alamer藍染料測定活細胞數量每個培養皿加入2ml培養基質和0.1ml Alamer藍(Iwaki Glass公司)，在37攝氏度培養2小時，用570nm和600nm處的吸收值計算Alamer藍的減少量，該量與活細胞數量相關。
與沒有絲蛋白成分的對照(100％)相比，人皮膚成纖維細胞在塗有晶體部分和非晶體部分的培養皿中的生長情況如表1所示。
在所有情況下，在塗有絲蛋白成分的培養皿中的細胞生長率都顯示出較對照更高的值。
濃度為0.025％的非晶體部分(C』)的生長率特別高。這部分是SDFGP的混合物。
較高濃度(0.025％)的晶體部分的生長率比較低濃度的(0.0025％)差。
這被認為是由於晶體部分的絲蛋白造成了細胞生長抑制。
細胞生長促進肽的胺基酸序列實施例1中發現絲心蛋白非晶體部分較其晶體部分能更高活性地促進細胞生長。
可是，實施例1中分級分離的非晶體部分可能是酶解產生的肽的混合物。
因此，進一步分離非晶體部分以鑑定出促進細胞生長的位置。
首先，根據其極性差異，使用反相色譜層析以分離實施例1中非晶體部分所含的肽。
按原始材料計，使用的體積是RESOURCER RPCK 3ml。
A泵用0.1％的TFA(三氟乙酸)，B泵用0.1％TFA/90％乙腈，在0至15分鐘內，以0％的B至75％的B的梯度進行色譜層析。
結果，確定了有6個峰(A-1，…，A-6)。
收集每個峰，用蒸發器乾燥，然後再溶解在少量緩衝液(PBS)中。
A-1至A-6的濃度各自用70％乙醇調節到0.025％，然後每種取1ml加入聚苯乙烯製成的細胞培養皿(35mm，Falcon)中，並空氣乾燥。
對照的培養皿僅包含1ml 70％乙醇，然後空氣乾燥。
使用這些培養皿進行細胞培養實驗。
細胞培養的方法與實施例1中的相同。
在塗有來自非晶體部分肽片段的培養皿中，人皮膚成纖維細胞的生長率如表2所示。
在來自非晶體部分的片段中，A-6對生長極好，相對於對照，顯示出大約4倍的增長。
接下來，根據其分子量，顯示最佳細胞生長促進活性的A-6中所含的肽用Superdex肽HR10/30儀(凝膠過濾色譜)進行分離。
結果，確定了有7個峰，A-6-1，…，A-6-7。
它們的分子量均在2,500以下。
在7個峰中，收集5個突出而明顯的峰(A-6-2，A-6-3，A-6-4，A-6-6，A-6-7)中的肽，並把每種肽塗於細胞培養皿上，加入培養基質，接種細胞並培養2天，然後測定細胞生長情況。
細胞生長實驗與實施例1中的相同。
細胞生長率的測定結果如表3所示。
A-6-2和A-6-6在培養2天後的生長率高於對照生長率1.5倍，顯示出極好的促細胞生長作用。
培養3天後的生長率超過2倍。
接著，用BI技術日本有限公司的LF3000蛋白質測序儀分析A-6-2和A-6-6的胺基酸序列，得到其如下的胺基酸序列A-6-2VITTDSDGNEA-6-6NINDFDEDA-6-2和A-6-6都是來源於絲心蛋白N-末端的肽。
根據胺基酸組成，N-末端部分是非晶體部分。
接下來，合成A-6-2和A-6-6的肽(由Hokkaido系統科學有限公司負責承包合成)，並在培養3天後如上所述地測定合成肽的生理活性，證實這些肽和絲蛋白提取物一樣顯示出細胞生長促進作用。
另外，混和合成的A-6-2和A-6-6肽後，其細胞生長促進作用更優於每個肽各自進行細胞培養。
合成肽的細胞生長率合成肽(由Hokkaido系統科學有限公司負責承包合成)衍生自基於家蠶絲心蛋白H-鏈和天蠶絲心蛋白的胺基酸序列上的總共12個位點，測定它們的細胞活性。
(1)肽的合成從家蠶絲心蛋白中挑選來源於晶體部分2個位點的部分肽(SfHC-1，SfHC-2)和來源於非晶體部分2個位點的部分肽(SfHE，SfHA)，併合成它們。
進一步，從天蠶絲心蛋白中挑選晶體部分的Ala(A)重複位點(AfH0)和非晶體部分的7個部分肽(AfH1至AfH7)，併合成它們。
源於家蠶絲心蛋白H-鏈的部分肽有4種，源於天蠶絲心蛋白的部分肽有8種(AfH0至AfH7)。這些肽的每個胺基酸序列如下所示。
源於家蠶絲心蛋白H-鏈的部分肽(4種)SfHC-1 GAGAGSGAGAGSGAGAGYGAGYSfHC-2 GAGAGSGAASGAGAGAGAGAGTSfHE AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKNSfHA GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT源於天蠶絲心蛋白的部分肽(八種)AfH 0 AAAAAAAAAA
AfH 1 YGWGDGGYGSDSAfH 2 SGAGGSGGYGGYGSDSAfH 3 GSGAGGRGDGGYGSGSSAfH 4 RRAGHDRAAGSAfH 5 DEYVDNAfH 6 VETIVLEEDPYGHEDIYEEDAfH 7 DDGFVLDGGYDSE(2)合成肽塗布於培養皿中約1mg的每種合成肽溶解於200.1 PBS中。溶解的肽溶液用70％乙醇稀釋到0.025％和0.0025％的濃度，並把1ml每種溶液加入培養皿並乾燥。
SfHC-1、SfHC-2和SfHE難溶，因此加入1ml 9M LiSCN溶解。
溶解的溶液裝入半透膜管，用100個體積的水透析，每30分鐘換掉外面的水，然後通過275nm處的吸收值確定蛋白質的量。
SfHC-2沒有酪氨酸以及類似物，因此不可能測定其吸收值。由於SfHC-1和SfHE在它們溶解前後幾乎有相同的量，所以假設SfHC-2也有相同的量，並與其他肽所用的相同方法用70％乙醇稀釋，裝入培養皿並乾燥。
進一步，AfH0也難溶並似乎由於其小分子量而會在透析中損失掉，因此在用70％乙醇稀釋後通過充分攪拌使之溶解，裝入培養皿並乾燥。
(3)細胞培養使用的細胞是人皮膚成纖維細胞(源於成人的正常皮膚)，購(冷凍)於Sanko Junyaku有限公司。
使用的培養基質是用於人皮膚成纖維細胞生長的低血清培養基質，購於Kurabo工業有限公司。
每個培養皿加入培養基質2ml，接種大約80,000個細胞並培養3天。
然後，加入0.1ml Alamer藍(Iwaki Glass公司)，於37攝氏度培養2小時，減少的Alamer藍的量與活細胞數量相關，減少的量是從在570nm和600nm處吸收值計算出來的這些細胞培養的測定方法與實施例1中的相同。
其結果示於表4和5。
對於來自家蠶的絲心蛋白來說，非晶體部分的部分肽、SfHE和SfHA比起晶體部分的部分肽、SfHC-1和SfHC-2有著更高的生長率，並顯示出高於對照值2倍以上，表明非晶體部分的部分肽或它們的混合物是SDFGP。
AfH0中幾乎沒有活性，AfH0是來自天蠶絲心蛋白晶體部分的部分肽，而且其較高濃度(0.025％)會導致較低的生長率，暗示了其細胞生長的抑制作用。
合成的非晶體部分的部分肽，AfH1至AfH7，顯示出生長率存在差異的促細胞生長作用。
例如，AfH3和AfH6都分別含有一個鹼性胺基酸殘基。由於AfH3含有較少的酸性胺基酸殘基，而AfH6含有較多的酸性胺基酸殘基，因而AfH6顯示出更高的細胞生長促進作用。
特別地，AfH1，AfH5，AfH6和AfH7顯示出極好的細胞生長促進作用，而它們都是通過合成獲得的SDFGP。
如表5所示，並非所有衍生自非晶體部分的部分肽都成為有著高生長率的SDFGP。
如表6所示，這歸因於構成每個肽的胺基酸側鏈的化學結構的差異。
合成肽的細胞生長活性基於實施例1至3的結果，合成肽(由Hokkaido系統科學有限公司負責承包合成)具有酸性胺基酸和極性不帶電荷的胺基酸，當測定主要成分的促成纖維細胞生長活性時，這些合成肽被認為能顯示出細胞生長活性。
細胞生長活性的測定用類似於[實施例1]中的方法進行。
細胞培養3天，用肽濃度為0.025.g/cm2獲得的結果示於表7。
對於穀氨酸來說，四個或更多個連續的殘基對細胞生長活性極好。
合成肽對細胞粘附和增殖的促進作用源於絲蛋白的合成肽、主要具有酸性胺基酸或極性不帶電荷的胺基酸的合成肽等，它們的細胞生長活性進一步分成細胞粘附和細胞增殖來具體測定。
該方法部分不同於[實施例1](3)中的細胞培養的方法。
在當前細胞培養中，使用的細胞是人皮膚成纖維細胞(源於成人的正常皮膚)，購(冷凍)於Sanko Junyaku有限公司。
使用的培養基質是用於人皮膚成纖維細胞生長的低血清培養基質，購於Kurabo工業有限公司。[106S培養基質500ml]。
106S培養基質是皮膚成纖維細胞的基本培養基質。
LSGS(低血清生長補充劑)不在此使用。
在粘附作用的測定中，在向培養基質接種細胞後的5小時去除浮在培養基質中的細胞，測定粘附在培養皿底部的活細胞數。
在增殖作用的測定中，測定向培養基質接種細胞後3天的活細胞數。
除了細胞培養方法之外，在細胞培養皿上塗布肽、用Alamer藍染料測定活細胞數等都按照[實施例1]中所述的方法進行。
粘附作用和增殖作用所得到的結果分別示於表8和9，結果是與培養皿中不塗布肽的對照的活細胞數相比較而得出的。
也就是說，表8顯示了在塗有各種肽的培養皿中培養人皮膚成纖維細胞5小時後的粘附情況。
此處，合成肽用標號或胺基酸序列來表示。
在此情況中，塗布於培養皿上的每種肽的濃度是0.025.g/cm2。
其中未塗有肽的粘附率(％)設成100。
表9顯示了在塗有各種肽的培養皿中培養人皮膚成纖維細胞3天後的增殖情況。
此處，合成肽用標號或胺基酸序列來表示。
在此情況中，塗布於培養皿上的每種肽的濃度是0.025.g/cm2。
其中未塗有肽的粘附率(％)設成100。
應當注意的是，對照中的活細胞數在3天的培養過程中增加了約150％，對照的值(100％)是基於培養3天後的活細胞數得出的。
因此，當培養3天後細胞數既沒有增加也沒有減少時，生長率會變成約70％。
在塗有晶體部分和非晶體部分的培養皿中人皮膚成纖維細胞的生長率
(*標準差)[表2]在塗有來自非晶體部分的肽片段的培養皿中人皮膚成纖維細胞的生長情況
(*標準差)[表3]在塗有得自肽鏈(表2，A-6)的5個片段的培養皿中的人皮膚成纖維細胞的生長率
(*標準差) 在塗有合成的家蠶絲心蛋白部分肽的培養皿中的人皮膚成纖維細胞的生長情況
(*標準差)[表5]在塗有合成的天蠶絲心蛋白部分肽的培養皿中的人皮膚成纖維細胞的生長情況
(*標準差)[表6]構成合成肽的每個胺基酸基團的百分比和細胞生長率(表4和5中的細胞生長率是在較高肽濃度(0.025％)下獲得的值)
合成肽的細胞生長活性
5小時培養後在塗有每種肽的培養皿中的人皮膚成纖維細胞的粘附情況
培養3天後在塗有每種肽的培養皿中的人皮膚成纖維細胞的生長情況
權利要求
1.對於促進細胞生長極好的肽組合物，包含一個或多個肽鏈的部分肽，所述肽鏈選自形成絲蛋白非結晶部分的肽鏈，所述部分肽具有由四至四十個胺基酸殘基所形成的特定胺基酸序列。
2.根據權利要求1的肽組合物，其中具有特定胺基酸序列的肽鏈具有以下胺基酸序列(1)至(8)中任意的胺基酸序列(1)VITTDSDGNE(2)NINDFDED(3)AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKN(4)GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT(5)YGWGDGGYGSDS(6)DEYVDN(7)VETIVLEEDPYGHEDIYEED(8)DDGFVLDGGYDSE
3.對於促進細胞生長極好的肽，包含以下胺基酸序列(1)至(8)中的任意序列(1)VITTDSDGNE(2)NINDFDED(3)AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKN(4)GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT(5)YGWGDGGYGSDS(6)DEYVDN(7)VETIVLEEDPYGHEDIYEED(8)DDGFVLDGGYDSE
4.一種分離並獲得對於促進細胞生長極好的肽的方法，其通過水解來自家蠶的未降解絲蛋白或來自屬於半目大蠶蛾屬的野生蠶的未降解蠶絲的絲心蛋白，然後按分子量分級分離。
5.根據權利要求4的分離並獲得對於促進細胞生長極好的肽的方法，其中水解是通過使用稀酸，羥胺或蛋白酶而進行的。
6.一種包含如權利要求1和2的肽組合物的促細胞生長劑。
7.一種包含如權利要求3的肽的促細胞生長劑。
8.一種包含如權利要求1和2的肽組合物的細胞粘附劑。
9.一種包含如權利要求3的肽的細胞粘附劑。
10.一種包含如權利要求1和2的肽組合物的促傷口癒合劑。
11.一種包含如權利要求3的肽的促傷口癒合劑。
12.一種包含如權利要求1和2的肽組合物的化妝品材料。
13.一種包含如權利要求3的肽的化妝品材料。
14.一種包含如權利要求1和2的肽組合物的細胞培養基質。
15.一種包含如權利要求3的肽的細胞培養基質。
全文摘要
目的是要獲得由於其低分子量從而在安全性、穩定性和促細胞生長作用方面極好的肽，其不同於由異常細胞，如腫瘤細胞，產生的細胞生長因子。對於促進細胞生長極好的肽組合物包含一個或多個肽鏈的部分肽，所述肽鏈選自形成構成絲蛋白的非結晶部分的肽鏈，所述部分肽具有由四至四十個胺基酸殘基所形成的特定胺基酸序列。本發明成功地提供了對於細胞生長極好的新型的肽，其具有分子量不大於10,000，優選在4,000至400範圍內的特定胺基酸序列，其既可通過從絲蛋白的非晶體部分分離和分級分離肽，也可通過合成類似於這樣的肽的肽來獲得。這些肽可以用作生物材料，例如，細胞粘附劑，促細胞生長劑，傷口促癒合劑，皮膚養護材料，如化妝品等，以及細胞培養基質。
文檔編號C07K14/435GK1535723SQ20041003524
公開日2004年10月13日 申請日期2004年3月1日 優先權日2003年2月28日
發明者坪內 三, 坪內紘三, 山田弘生, 生 申請人:獨立行政法人農業生物資源研究所