大豆GmPHR1基因及其編碼的蛋白和應用的製作方法

2023-06-08 02:56:51 1

專利名稱：大豆GmPHR1基因及其編碼的蛋白和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物分子生物學領域，具體涉及一種大豆GmPHRl基因，其編碼的蛋白 和應用。
背景技術：
在植物所需17種必需元素中，磷對於植物新陳代謝和正常生長發育具有極其重 要作用。同時，由於耕地土壤所特有的「遺傳學缺磷」現象，使得磷素缺乏已經成為影響作物 產量提高和品質改良的重要限制因子。發揮植物自身潛力，通過現代基因克隆技術分離磷 高效基因，並通過轉基因技術將其轉入不同作物中，從而培育磷高效作物新品種是解決上 述問題的重要途徑。目前，已克隆的磷高效基因主要包括以下幾類(1)磷高效相關轉錄因 子基因，如CrPSRl，AtPHRl，OsPHRl等；(2)植酸酶基因，如phyA，phyB，phyC等；(3)高親和 磷轉運蛋白基因，如AtPTl，OsPTl,LePTl等；(4)磷酸酶類基因，如AtACP5，LaSAPl等；(5) 核糖核酸酶基因，如RNS1、RNS2和RNS3等；(6)有機酸分泌基因，如CSb，DcCs等。在上述 幾種不同類型磷高效基因中，轉錄因子由於可以調控(開啟或關閉)位於其下遊的一系列 磷代謝相關基因的表達，從而更大範圍地提高植物對磷素的吸收或利用效率，因而尤為突 出和重要。擬南芥中的轉錄因子AtPHRl屬於MYB-CC類型，與CrPSRl同源，而CrPSRl是在 光合真核生物中報導的第一個參與磷代謝的調節因子，已被證實與磷營養代謝密切相關； AtPHRl發生突變，可導致一系列磷代謝相關基因表達量降低，轉基因擬南芥耐低磷能力也 隨之下降；因而AtPHRl被認為是高等植物中唯一已知的磷信號調控體系的核心轉錄因子， 影響著一系列磷飢餓反應基因的表達；它的發現被認為是植物磷信號調控研究的重要裡程 碑。利用AtPHRl序列，通過同源基因克隆技術分離得到的OsPHRl和0sPHR2，分析發現，這 兩個基因均與磷脅迫信號途徑有關，且0sPHR2過量表達可使轉基因水稻地上部的磷素明 顯增加和積累。菜豆中的PvPHRl也被證明是一個參與植物磷素運輸、再利用的正向調控因 子。儘管目前已獲得一些磷高效基因，但其應用範圍仍然有限，並且關於植物磷高效分子機 制也尚未明確。究其原因仍與克隆基因數量少，尤其是功能明確基因明顯缺乏有很大關係。 因此，克隆磷高效基因，並對其進行分析，仍然是今後一段時期內的重要研究方向。

發明內容
本發明的目的是提供一種大豆GmPHRl蛋白。大豆GmPHRl蛋白為，1)由SEQ ID No. 2所示胺基酸組成的蛋白質；或2)在SEQ ID No. 2所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有同等活性的由1) 衍生的蛋白質。本發明還提供編碼上述蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。本發明提 供的大豆GmPHRl是從一個磷高效的大豆品種『冀豆11』中通過RT-PCR分離得到，其開放 閱讀框序列819bp。將得到的GmPHRl序列進行蛋白比對，發現該基因編碼蛋白與擬南芥(Arabidopsis thaliana)(Oryza sativa)(Phaseolusvulgaris)白勺ΜΥΒ$ @
子具有較高的同源性。應當理解，本領域技術人員可根據本發明公開的胺基酸序列，在不影響其活性的 前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個胺基酸，得到所述蛋白的突變序列。例如在非活 性區段，將第(200)位的(Tyr)替換為(His)，或是將第(111)位的(Gly)缺失，或是在(131 位後面)增加(一個Ser)。因此，本發明的大豆GmPHRl蛋白還包括SEQ ID No. 2所示胺基酸序列經取代、缺 失或添加一個或幾個胺基酸，具有大豆GmPHRl蛋白同等活性的由大豆GmPHRl蛋白衍生得 到的蛋白質。本發明基因包括編碼所述蛋白的核苷酸序列。此外，應理解，考慮到密碼子的 簡併性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領域技術人員可以根據需要使用適合特定物種表 達的密碼子。本發明還提供含有上述大豆GmPHRl基因或其片段的載體，以及含有該載體的宿 主細胞；所述載體為所述大豆GmPHRl基因的克隆載體或各類表達載體。本發明還提供一種大豆GmPHRl基因在培育耐低磷脅迫植物新品種中的應用，通 過在植物體內過量表達大豆GmPHRl基因，提高轉基因植物對低磷脅迫的抗性。本發明從大豆中分離出了 PHRl的同源基因，通過亞細胞定位表明該基因所編碼 的蛋白主要分布在細胞核中。通過農桿菌介導法將大豆GmPHRl基因轉化擬南芥，獲得了轉 基因擬南芥。在適磷處理下，轉基因擬南芥與野生型在植株生長上表現基本一致；而在低磷 脅迫下，GmPHRl超表達轉基因擬南芥與野生型相比，表現出植株葉片較大，呈現綠色，葉柄 較長，生長勢強等特點，而野生型擬南芥則表現出葉片變小，呈現紫色，葉柄較短，生長勢弱 等植株缺磷症狀，表明GmPHRl可以提高轉基因擬南芥在低磷條件下的耐低磷能力。


圖1是磷高效品種「冀豆11」在低磷處理條件下的cDNA進行PCR擴增的結果圖。 其中M為DNA Marker DL 2000 ；1為「冀豆11」低磷處理cDNA的PCR擴增結果。圖2是pGM-GmPHRl中間重組子陽性克隆篩選結果圖。1_6泳道為陽性克隆PCR擴 增結果，M 為 DNAMarker DL 2000。圖3是pET32a-GmPHRl重組質粒的酶切檢測結果。其中1是pET32a_GmPHRl酶切 產物；2是未酶切對照；M是DNA MarkerDL5000o圖4是GmPHRl基因原核表達蛋白的SDS-PAGE電泳檢測結果。其中M是蛋白標 準分子量；1，4，7，10為不含質粒菌株；2，5，8，11分別為含有空載質粒的菌株；3，6，9，12，13 分別為含有目的基因的菌株。圖5是GmPHRl編碼蛋白的亞細胞定位觀察結果。其中，A 紫外光激發下的轉空載 質粒pCam-GFP洋蔥表皮細胞螢光觀察；B 可見光激發下的轉空載質粒pCam-GFP洋蔥表皮 細胞顯微觀察；C 紫外光激發下的轉融合表達載體pCam-GmPHRl-GFP洋蔥表皮細胞螢光觀 察；D 可見光激發下的轉融合表達載體pCam-GmPHRl-GFP洋蔥表皮細胞顯微觀察。圖6是pBI121-GmPHRl重組質粒的酶切檢測結果。其中1-2是pBI121_GmPHRl酶 切產物；3是未酶切對照；M是DNA MarkerDL15000。圖7是擬南芥轉化植株目的基因PCR檢測圖。其中1-7為轉化後的擬南芥植株；M 是 DNAMarker DL2000。圖8是T2代轉基因擬南芥低磷脅迫處理結果圖。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。在不背離本發明精神 和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例IGmPHRl基因的分子克隆1.大豆幼苗培養與植株缺磷處理種子催芽後選擇出芽一致的材料播於鋪有蛭 石的花盆內，對生真葉展開後，進行缺磷(OmM)處理，對照磷處理為l.OmM。2.總RNA提取大豆植株總RNA(缺磷處理、對照處理)提取參照TRNzol Total RNA Reagent (購自天根生化科技(北京)有限公司)操作指南進行。3. cDNA反轉錄合成植株總RNA經反轉錄後獲得cDNA第一鏈，合成過程參照 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (購自寶生物工程(大連)有限公司)操 作指南進行。4. PCR擴增所用引物的設計利用AtPHRl序列，在NCBI網站比對大豆EST，通過電 子克隆技術拼接得到目的基因的電子序列。依據該電子序列設計一對引物，PHRl :5』 -CCCGGGTACCATGTATCACACAAAGAAATTTTCAC-3，PHR2 :5』 -GAGCTCGGGCCCTTACTGTCCACTCTCATTATCTTC-3，。5. GmPHRl基因開放閱讀框(ORF)的分子克隆利用所設計的引物，以缺磷處理下 的反轉錄cDNA為模板進行PCR擴增，克隆GmPHRl基因的開放閱讀框序列。PCR反應體系及
程序如下PCR 體系冀豆IlcDNALOyL10 X PCR 含 Mg2+ 緩衝液2. 0 μ L2. 5mM dNTPs2. 0 μ LEx Taq DNA 聚合酶(2. 5U/ μ L)0. 2 μ LPHRl(IOyM)l.OyLPHR2(10yM)l.OyL雙蒸水12.8yLPCR 程序95°C 預變性IOmin94°C 變性Imin56°C 退火Imin72°C 延伸Imin30個循環72°C 延伸IOminIO0C保溫 PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，回收目的片段，並連接於pGM-Τ載體，構建成PGM-GmPHRl載體，反應體系如下IOX連接緩衝液IyLpGM-T 載體1 μ LPCR 產物7 μ LT4DNA 連接酶IU將上述混合液混勻後，16 °C連接過夜。6.轉化大腸桿菌，獲得陽性克隆連接產物採用熱擊法轉化大腸桿菌感受態細 胞，挑取陽性克隆，進行PCR檢測(圖2)並測序，獲得GmPHRl基因的開放閱讀框序列，長度 為819bp，序列如SEQ IDNo. 1所示。實施例2GmPHRl基因的原核表達1.將重組質粒pGM-GmPHRl和原核表達載體pET_32a (+)採用KpnI/SacI雙酶切， 並回收目的片段，兩個質粒的酶切反應體系均如下Kpn IIUSac IIU10XL 緩衝液2yL質粒IOyL雙蒸水補足至20 μ L2.將回收後的pET_32a(+)表達載體與GmPHRl酶切片段進行連接，構建成 pET-32a(+) -GmPHRl載體，連接體系如下GmPHRl 片段5yLpET-32a (+)載體1 μ LT4DNA 連接酶IUIOX連接緩衝液IyL雙蒸水補足至IOyL混勻後16 °C連接過夜。3.融合重組蛋白的誘導表達將上述連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，經PCR和酶 切檢測，將陽性克隆的質粒轉化大腸桿菌BL21菌株，挑取陽性克隆，經質粒提取、酶切檢測 (圖3)，測序鑑定，得到含有基因正確編碼序列的陽性克隆。4. SDS-PAGE蛋白電泳分析利用IPTG誘導表達轉有原核表達載體的BL21菌株， 分別收集誘導0小時，3小時，6小時，9小時和12小時的菌液。將收集的菌液離心後，倒出 液體，分別加入200 μ L上樣緩衝液，振蕩混勻後，置於沸水中10分鐘，瞬離；配置12%的分 離膠，5%的濃縮膠，待其室溫聚合完畢後，拔出梳子。各取30 μ L樣品上樣；濃縮膠部分以 80V恆壓，分離膠部分以120V恆壓電泳。電泳結束後，將電泳膠從電泳板上剝下，先用蒸餾 水衝洗乾淨，然後用染色液室溫染色2小時，置於脫色液中直至出現清晰的條帶。結果如圖 4所示。實施例3GmPHRl編碼蛋白的亞細胞定位分析1. PCR所用引物的設計利用生物軟體DNAMAN設計一對PCR引物，擴增GmPHRl去 除終止密碼子後的開放閱讀框，進行編碼蛋白的亞細胞定位，引物序列如下PHR3 5' -TCTAGATGTATCACACAAAGAAATTTTCACCGGC-3『，
PHR4 5' -GGTACCCTGTCCACTCTCATTATCTTCATCC-3『。2.亞細胞定位所需開放閱讀框的擴增以pGM-GmPHRl質粒為模板，利用PHR3和 PHR4引物，擴增不含終止密碼子的基因開放閱讀框序列，電泳檢測後切膠回收目的條帶，與 PGM-T載體連接，藍白斑篩選，測序，挑選出開放閱讀框序列無誤的陽性克隆pGM-PHRl用於 後續試驗。3.表達載體的構建將目的基因GmPHRl和綠色螢光蛋白基因GFP構建成融合 基因，並與真核表達基因35S啟動子及終止子連接，利用限制性內切酶將該序列連接於 PCAMBIA1300 載體的 EcoRI/Hindlll 位點，構建成表達載體 pCam-GmPHRl :GFP。酶切反應體系為EcoR IIUHindIIIIUIOXM 緩衝液2yL質粒IOyL雙蒸水補足至20 μ L回收酶切產物，進行連接，連接體系如下融合基因片段5yLpCAMBIA1300 載體1 μ LT4DNA 連接酶IUIOX連接緩衝液IyL雙蒸水補足至IOyL連接產物採用熱擊法轉化大腸桿菌感受態細胞。挑取陽性克隆，進行質粒提取，酶 切檢測和測序，獲得用於亞細胞定位的融合表達載體pCam-GmPHRl :GFP。pCam-GFP載體構 建方法同前述。將GFP與真核表達基因35S啟動子及終止子連接，利用限制性內切酶將該 序列連接於PCAMBIA1300載體的EcoRI/Hindlll位點，構建成表達載體pCam-GFP，作為空質 粒對照。4.融合表達載體pCam-GmPHRl GFP與空質粒pCam_GFP的基因槍轉化採用基因 槍轟擊技術將融合表達載體pCam-GmPHRl :GFP和空質粒pCam-GFP轉化洋蔥內表皮細胞， 轉化具體步驟按照基因槍操作說明書進行。5.螢光顯微鏡觀察基因槍轟擊後的洋蔥內表皮細胞置於螢光顯微鏡下觀察綠 色螢光在細胞內的分布情況。結果如圖5所示，表明轉化pCam-GmPHRl: :GFP質粒的洋蔥內 表皮細胞的細胞核部位有明顯的螢光，結果表明GmPHRl編碼蛋白主要分布於植物細胞核 中。實施例4GmPHRl基因表達蛋白的功能分析 1. GmPHRl基因的植物超表達載體pBI 121-GmPHRl的構建將pGM-GmPHRl和 PBI121質粒採用Sma I/Sac I雙酶切，酶切反應體系如下Sma IIUSac IIUIOXT 緩衝液2yL牛血清蛋白2yL
質粒8 μ L雙蒸水補足至20 μ L回收酶切產物，進行連接，連接體系如下GmPHRl 片段5 μ LρΒΙ121 載體IyLT4DNA 連接酶IUIOX連接緩衝液IyL雙蒸水補足至10 μ L混勻後，16°C連接過夜，將連接產物轉化大腸桿菌DH5ci，經雙酶切檢測(圖6)，得 到陽性克隆進行測序，得到測序正確的超表達載體pBI121-GmPHRl進行後續試驗。2.農桿菌介導法侵染擬南芥採用浸花法(Floral dip)將攜帶有pBI121_GmPHRl 的農桿菌轉入哥倫比亞型擬南芥中。利用載體序列設計一對引物(擴增產物為1348bp)進 行轉化植株的PCR檢測，部分轉化植株的PCR結果如圖7所示。引物序列如下PHR5 5' -CCCGGGTACCATGTATCACACAAAGAAATTTTCAC-3『，PHR6 5' -GTAAAGCACTAAATCGGAACCCTA—3『。3.轉基因擬南芥的耐低磷特性分析選取T2代轉基因擬南芥株系3個，空載體株 系1個和野生型擬南芥為材料；每個材料分別種20盆，1株/盆，進行2個磷濃度處理(低 磷處理0. OlmM,對照處理1. OmM)。隨後，在植株生長期間，觀察擬南芥植株在2種磷處理下 的生長情況，進行耐低磷特性分析。結果如圖8所示，表明在適磷處理下，生長24天的轉基 因擬南芥與野生型在植株生長上表現基本一致；而在低磷脅迫處理下，GmPHRl超表達轉基 因擬南芥與野生型相比，則表現植株葉片較大，葉柄較長，生長勢強等特點，表明GmPHRl可 以提高轉基因擬南芥在低磷條件下的耐低磷能力，GmPHRl具有提高擬南芥耐低磷能力的功 能。序列說明SEQ ID No. 1為大豆GmPHRl基因的核苷酸序列；SEQ ID No. 2為大豆GmPHRl的氨 基酸序列；SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 所示為引物 PHRl 和 PHR2 ； SEQ ID No. 5 和 SEQID No. 6 所示為引物 PHR3 和 PHR4 ；SEQ ID No. 7SEQ ID No. 8 所示為引物 PHR5 和 PHR6。
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權利要求
一種大豆GmPHR1蛋白，其為1)由SEQ ID No.2所示的胺基酸組成的蛋白質；或2)在SEQ ID No.2所示的胺基酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的大豆GmPHRl基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其特徵在於，核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。
4.含有權利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權利要求4所述載體的宿主細胞。
6.含權利要求2或3所述基因的轉化植物細胞。
7.製備權利要求1所述蛋白的方法，其特徵在於，將大豆GmPHRl基因構建到原核表達 載體中，通過在大腸桿菌中發酵製備。
8.權利要求2或3所述的基因在培育耐低磷植物新品種中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述應用是在植物體內過量表達大豆 GmPHRl基因，提高轉基因植物對低磷脅迫的抗性。
全文摘要
本發明涉及植物分子生物學領域，具體涉及一種大豆的GmPHR1基因及其編碼的蛋白和應用。本發明提供一種大豆的GmPHR1蛋白，1)、由SEQ ID No.2所示胺基酸組成的蛋白質；或2)、在SEQ ID No.2所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質。本發明還提供編碼上述蛋白的基因，及其在培育耐低磷植物新品種中的應用。GmPHR1的轉基因植物與野生型相比表現出更強的耐低磷脅迫的能力。
文檔編號C12N5/10GK101985465SQ20101052835
公開日2011年3月16日 申請日期2010年10月22日 優先權日2010年9月14日
發明者常文鎖, 張俊紅, 張彩英, 李喜煥, 王運傑 申請人:河北農業大學