用於檢測水產動物病毒的檢測試劑的製作方法

2023-05-12 21:14:21

專利名稱：用於檢測水產動物病毒的檢測試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測水產動物病毒的檢測試劑套組。
背景技術：
在亞洲及歐洲國家中，石斑魚是魚類中重要的品種，其可產生高經濟價值。然而，因幼體會遭受病毒的傷害，使幼體的繁殖比例相當低。有多種病毒會攻擊石斑魚，如神經壞死病毒NNV (nervous necrosis virus)、虹彩病毒(irido virus)和感染性膜髒壞死病毒(infection pancreatic necrosis virus)。而神經壞死病毒對於石斑魚幼體會造成傷害，並且導致死亡率高於90%以上。神經壞死病毒NNV是一種核酸病毒，屬於野田病毒中的β -野田病毒(beranodavirus)的一種。神經壞死病毒的大小約為25-30納米,其包含兩種核糖核酸(RNA) =RNAl及RNA2，其中RNAl可表現蛋白質A，而RNA2可表現蛋白質α，形成NNV的帽結構。常見用於定量檢測NNV的步驟是包含從石斑魚組織中萃取出NNV的微顆粒，並進行RNA反轉錄為DNA，最後利用實時定量聚合酶連鎖反應，亦是實時聚合酶連鎖反應。雖然上述的方法在檢測NNV可表現出高靈敏度及專一性，但因在操作流程中需小心處理，所以僅可適用於在實驗室中的熟練該技術的人員操作，此缺點嚴重地阻礙了檢測NNV方法的普及性，並且在水產養殖業中，NNV的大範圍檢驗很難由實時聚合酶連鎖反應完成。近年來，有許多研究團隊使用酶聯免疫吸附分析(ELISA)，如三明治免疫分析技術，而上述技術常因檢測時的操作複雜度，無法將該技術普遍地推廣。因此，具有容易操作的優點、高信賴性、高靈敏度和專一性的替代技術是近年來逐漸發展的重點。

發明內容
本發明的目的在於提供一種用於檢測水產動物病毒的檢測試劑套組。為實現上述目的，本發明採取的技術方案為一種用於檢測水產動物病毒的檢測試劑，包括多個磁性納米粒子,分布於水溶液中，其中這些多個磁性納米粒子中的磁性納米粒子的構造為磁性核、界面活性劑層，所述界面活性劑層披覆於所述磁性核上，以及多個水產動物病毒抗體，所述多個水產動物病毒抗體結合於所述界面活性劑層上。本發明所述的磁性納米粒子，其材料選自於四氧化三鐵(Fe3O4)、三氧化二鐵(Fe2O3)、鐵猛酸(MnFe2O4)、鐵酸鈷(CoFe2O4)及鐵酸鎳(NiFe2O4)所組成的群組。在較佳的實施例中,所述磁性納米粒子的磁性核的材料為四氧化三鐵(Fe3O4)。本發明所述的界面活性劑是指能使目標溶液表面張力顯著下降的物質，以及降低兩種液體之間表面張力的物質，一般的界面活性劑為具有親水與疏水基團的有機兩性物質，可溶於有機溶液和水溶液。在本發明中，所使用的界面活性劑材料包含但不限於有機酸、蛋白質Α、蛋白質G、葡聚糖(Dextran)或微脂粒。優選地，所述界面活性劑的材料為葡聚糖。本發明中，所述的水產動物病毒包含神經壞死病毒、虹彩病毒和感染性胰臟壞死病毒。優選地，所述水產動物病毒是神經壞死病毒。此外，本發明所使用的水產動物指石斑魚。本發明另提供一種檢測水產動物病毒的方法，包括提供本發明所述的檢測水產動物病毒的試劑，並萃取水產動物內的病毒，進一步將試劑與萃取物混合，量測免疫磁減量訊號，並藉由下述邏輯函數定量該病毒的濃度。
imi%) - a^b + B, …、
I — Γ其中，A為噪音強度，B為飽和值參數，是神經壞死病毒濃度，Φ。是隨著變化的參數，Y是密合參數。 本發明還提供一種萃取組織內病毒的方法，其步驟為(I)取出水產動物的腦組織；(2)在含有水產動物腦組織的容器中加入萃取溶液；(3)將含有組織的容器放在冰上，並磨碎該組織；(4)取出容器中的上清液進行檢測萃取效率。


圖1-1為從石斑魚幼體萃取神經壞死病毒顆粒的流程圖。圖1-2為從石斑魚幼體萃取虹彩病毒顆粒的流程圖。圖2-1為神經壞死病毒濃度與萃取效率之間的關係示意圖。圖2-2為虹彩病毒濃度與萃取效率之間的關係示意圖。圖3-1為表面接有神經壞死病毒抗體(Anti-NNV)的磁性納米粒子與附有FITC的二級抗體的示意圖。圖3-2為表面接有虹彩病毒抗體(Anti-GIV)的磁性納米粒子與附有FITC的二級抗體的示意圖。圖4為圖3所示表面接有神經壞死病毒抗體(Anti-NNV)的磁性納米粒子與附有FITC的二級抗體在螢光顯微鏡下觀察到受磁鐵吸引的一種移動行為。圖5為圖3所示表面接有神經壞死病毒抗體(Anti-NNV)的磁性納米粒子與附有FITC的二級抗體在螢光顯微鏡下觀察到受磁鐵吸引的另一種移動行為。圖6-1為接有神經壞死病毒抗體的磁性粒子的粒徑分布圖。圖6-2為接有虹彩病毒抗體的磁性粒子的粒徑分布圖。圖7為磁性試劑的交流磁化率的虛數部分(Imaginary Part)作為適用的磁場頻率函數圖。圖8為含有虹彩病毒抗體磁性試劑的穩定度測試。圖9為免疫磁減量對神經壞死病毒濃度訊號的影響關係圖。圖10為在實時聚合酶連鎖反應的測試方式中，神經壞死病毒濃度與交叉點的關係曲線圖。圖11為免疫磁減量(MR)與實時聚合酶連鎖反應(PCR)檢測神經壞死病毒濃度的有效性的關係圖。
具體實施例方式為更好的說明本發明的目的、技術方案和優點，下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步描述。實施例1-1萃取石斑魚幼體中的神經壞死病毒所有神經壞死病毒NNV幾乎存在於石斑魚的腦組織中，本發明實施例將取出的O. 5克腦組織放入微量離心管，並加入200 μ I的萃取液(MagQu Co. ,Ltd.)至微量離心管，為了保持組織的新鮮度，將微量離心管放置在冰上並將組織磨碎，磨碎後3分鐘，移開在冰上的微量離心管5分鐘，取出在微量離心管中含組織的液體的上部溶液，做免疫磁減量檢測並量測NNV的濃度。

圖1-1是不同石斑魚腦組織的萃取過程的流程圖，其中圖1-1 (a)直接從石斑魚腦組織萃取神經壞死病毒的RNA,所萃取的RNA被轉錄為DNA,並藉由實時聚合酶連鎖反應檢測DNA的濃度，即為小亂 。根據萃取的結構，選擇700TCID5Q/ml至4X 107TCID5(l/ml的神經壞死病毒濃度作為檢測萃取NNV的濃度範圍。所述的TCID5tl是指半數組織培養感染量。圖1-1 (b)為萃取腦組織的神經壞死病毒顆粒，經由上述萃取流程，在上部溶液中含NNV顆粒通過實時聚合酶連鎖反應檢測並表示為(tfflV,part。經上述方式所萃取的NNV濃度，可經由ΦΝΝν,_/ΦΝΝν,κΜ的比例獲得萃取效率值。如附圖2-1所示，700TCID50/ml至4X107TCID50/ml的神經壞死病毒濃度中，本發明萃取神經壞死病毒的效率超過80%。實施例1-2萃取石斑魚幼體中的虹彩病毒(GIV)本發明另一具體實施例系萃取石斑魚幼體中的虹彩病毒(Irido Virus ；GIV)。將取出的O. I克前腎組織放入微量離心管，並加入200 μ I的萃取液(MagQuCo. ,Ltd.)至微量離心管，為了保持組織的新鮮度，將微量離心管放置在冰上並將組織磨碎，磨碎後3分鐘，移開在冰上的微量離心管5分鐘，取出在微量離心管中含組織的液體的上部溶液，做免疫磁減量檢測並量測GIV的濃度。圖1-2是不同石斑魚組織的萃取過程的流程圖，其中圖l_2(a)直接從石斑魚前腎組織萃取虹彩病毒的RNA,所萃取的RNA被轉錄為DNA,並藉由實時聚合酶連鎖反應檢測DNA的濃度，即為Φ , 。根據萃取的結構，選擇700TCID5Q/ml至4X107TCID5Q/ml的虹彩病毒濃度作為檢測萃取GIV的濃度範圍。所述的TCID5tl是指半數組織培養感染量。圖l-2(b)為萃取前腎組織的虹彩病毒顆粒，在上部溶液中含GIV顆粒通過實時聚合酶連鎖反應檢測並表示為cKIV,part。經上述方式所萃取的GIV濃度，可經由ΦΗν,_/ΦΗν,km的比例獲得萃取效率值。如附圖2-2所示，700TCID5Q/ml至4X 107TCID5(l/ml的虹彩病毒中，本發明萃取虹彩病毒的效率超過80 %。實施例2試劑合成2-1合成具有神經壞死病毒抗體之納米磁性粒子混合化學計量比率為I : 2的硫酸亞鐵七水(FeSO4 · 7H20)與氯化鐵六水(FeCl3 · 6H20)的鐵溶液與等量的水性葡聚糖混合，其作為四氧化三鐵粒子的界面活性劑並分散在水中。該混合物加熱至70-90°C，並以強鹼溶液滴定形成黑色的四氧化三鐵粒子，團聚體和多餘的葡聚糖則以離心的方式移除，並以凝膠過濾層析方式獲得高濃度均相的磁流體。該試劑可通過pH為7. 4的磷酸鹽緩衝液稀釋高濃度磁流體而獲得適合的磁性濃度。

為了使抗體結合至磁性納米粒子外層的葡聚糖上，以神經壞死病毒抗體為例，神經壞死病毒抗體加入過碘酸鈉NaIO4溶液至磁性溶液中，使葡聚糖氧化並得到醛基(-CH0)，之後，葡聚糖可通過-CH = N-的連結與神經壞死病毒抗體反應。因此，神經壞死病毒抗體共價連接到葡聚糖上。通過磁性分離，未接合的神經壞死病毒抗體可從溶液中分離。為確定磁性納米粒子表面接合上神經壞死病毒抗體，如附圖3-1所示，本實施例使用一端藉由FITC(異硫氰酸螢光素)螢光的二級抗體與神經壞死病毒試劑混合。實驗中，加入過量的FITC 二級抗體與披覆有神經壞死病毒抗體的磁性粒子混合。充分混合後，再藉由磁性分離技術，將混合液中的磁性粒子分離出，而未與磁性粒子表面的神經壞死病毒抗體接合的FITC 二級抗體，因不具有磁性，則會留在原混合液中。因此，本實施例將混合液放在螢光顯微鏡下觀察，首先會看到綠色(灰色)亮點，如圖4中箭頭所指之處。此亮點是FITC所發出的光亮。為了再次確認二級抗體鍵結至磁性納米粒子上，在混合液旁擺上磁鐵。此時溶液中的磁性粒子會受到磁鐵的吸弓I而移動，通過磁性納米粒子的移動，若附有FITC的二級抗體與披覆有神經壞死病毒抗體的磁性粒子結合，則亮點也會移動。本實施例中，將磁鐵放於圖4的右下方，而圖5的亮點應朝向右下方移動。此預測在圖5中被觀察到，這證實磁性粒子上，確實已接上神經壞死病毒抗體(Anti-NNV)。藉由動態雷射散射法(dynamic laser scattering)分析具有神經壞死病毒抗體的磁性納米粒子的粒徑分布,而測量神經壞死病毒試劑的磁濃度為O. lemu/g(l. 2mg-Fe/ml)。如圖6-1所示，粒子的平均流體動力粒徑為55nm，此粒徑是根據布朗式磁鬆弛，時間常數4在55·!的粒子分散在20-25°C的水中，通過方程式(1)，估計為65. 79μ S，其中η是在20-25°C中水的黏度，V是粒子平均流體動力體積，Kb是Boltzmann常數，T是蘭氏溫度單位。經由上述的估計，此意味著在交流磁場下的頻率為I/τΒ(= 15.2kHz)。實際上，分散於水中的粒子的虛部交流磁化率相當於粒子的交流磁性能量的吸附作用。因此在共鳴頻率可達到最大吸附作用，並使交流磁化率的虛部達到最大值。因此本實施例藉由磁導率計測量神經壞死病毒試劑的交流磁化率的頻率相關虛部。如圖7的實驗頻率範圍中，顯示標準化交流磁化率的最大值虛部，且顯著表現出隨著適合的交流磁場頻率增加，神經壞死病毒試劑的虛部(Imaginary part) Im[ x ac]NOT也隨之增加，並且達到最大值約15kHz,此實驗結果符合公式(I)的推論。τΒ = 3 nV/KBT.................公式(I)2-2合成具有虹彩病毒抗體之納米磁性粒子本發明另一實施例系利用上述合成磁性納米粒子的方式將虹彩病毒抗體加入過碘酸鈉NaIO4溶液至磁性溶液中，使葡聚糖氧化並得到醛基(-CH0)，之後，葡聚糖可通過-CH = N-的連結與虹彩病毒抗體反應。因此，虹彩病毒抗體共價連接到葡聚糖上。通過磁性分離，未接合的虹彩病毒抗體可從溶液中分離。為確定磁性納米粒子表面接合上虹彩病毒抗體，如附圖3-2所示，本實施例使用一端藉由FITC(異硫氰酸螢光素)螢光的二級抗體與虹彩病毒試劑混合。實驗中，加入過量的FITC 二級抗體與披覆有虹彩病毒抗體的磁性粒子混合。充分混合後，再藉由磁性分離技術，將混合液中的磁性粒子分離出，而未與磁性粒子表面的虹彩病毒抗體接合的FITC 二級抗體，因不具有磁性，則會留在原混合液中。如上述，虹彩病毒抗體與磁性納米粒子外層的葡聚糖共價連接後，並藉由上述動態雷射散射法(dynamic laser scattering)分析具有虹彩病毒抗體的磁性納米粒子的粒徑分布，測量虹彩病毒試劑的磁濃度為O. lemu/g(l. 2mg-Fe/ml)。如圖6_2所示，粒子的平均流體動力粒徑為52. 6nm。另，本發明為確定所合成的試劑的保存時間，因此將該試劑存放在4°C，其穩定度至少可達到13周，如附圖8。實施例3神經壞死病毒濃度與免疫磁減量訊號建立本實施例將40 μ I與60 μ I的樣品溶液混合在玻璃管中，使用磁性免疫分析儀(XacPro-E, MagQu)量測未結合成神經壞死病毒-神經壞死病毒抗體-葡聚糖-納米磁性粒子前的X aCj0交流信號，之後，該混合物維持在室溫下以形成神經壞死病毒-神經壞死病毒抗體-葡聚糖-納米磁性粒子，量測並紀錄其交流信號X a。, 4，通過量測出的X ac,0及X ac, φ，可用下列的公式(2)計算出IMR訊號IMR(%) = (xac,0-xac,Φ)/χ3ε,οΧ100%.......公式(2)對每一個給定濃度的樣品溶液，其時間依賴的X ac交流信號皆檢測三重複。圖9顯示神經壞死病毒濃度ΦΝΝν與MR訊號的關係曲線，當神經壞死病毒濃度ΦΝΝν從5TCID5(i/ml改變至107TCID50/ml, IMR訊號則從O. 84%增加至3. 04% .上述的實驗結果數據，可由下列邏輯函數(3)推算MR(% )與神經壞死病毒濃度
4* NNV 系。
=,十 i 、 ..........公式⑶
I — I-1
Φ.其中，Α、Β、Φ。及Y是該函數的參數。將實驗數據套入邏輯函數中，可得到A =O. 64、B = 3. 47、小。=26684及Y = O. 31，並以實線繪於圖8。在邏輯函數(3)中，當小麗趨近於O時，IMR訊號趨近於A值，此結果表示A值是NNV濃度依賴MR訊號的噪音強度。此外當高於Φ。時，訊號趨近於B值，此顯示當神經壞死病毒為高濃度時，對於MR訊號，B值為高端值(high-end value)。依據上述，將濃度定義為檢測樣品的標準，在低濃度的神經壞死病毒中，藉由MR訊號的三重複標準偏差數據，顯示出MR訊號高於噪音強度A值。實驗數據顯示出，當神經壞死病毒為低濃度時，MR訊號的標準偏差為O. 021 %。因此，通過邏輯函數(3)，當IMR訊號的檢測標準為O. 903%時，此時神經壞死病毒濃度為17. 2TCID50/mL·實施例4使用實時聚合酶連鎖反應檢測神經壞死病毒濃度取出100納克的RNA定量具有神經壞死病毒的RNA濃度，其是使用核酸複製同步定量序列檢測系統(ABI Prism 7000 sequence detector, Applied Biosystems)檢測。執行實時聚合酶連鎖反應的放大作用是使用High Capacity cDNA Archive kit (AppliedBiosystems)和其專一11"生引物,如序列表SEQ ID NO. I。在實時聚合酶連鎖反應的過程中，藉由Power SYBR Green PCR MasterMix試劑以螢光實時檢測核酸量，並且利用神經壞死病毒的正義和反義引物，如序列表SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3進行行實時聚合酶連鎖反應。其反應條件，以95°C反應3秒將DNA模板雙鏈打開，再以60°C反應30秒進行引物的黏合及延伸作用，進行45個循環反應,最後藉由SDS軟體(版本1.7 !Applied Biosystems)分析實時聚合酶連鎖反應訊號。本實施例準備濃度為IO2至108TCID5(l/ml的多種神經壞死病毒樣品，並使用實時聚合酶連鎖反應方式檢測，以螢光強度與放大循環作用的實驗關聯性測定每一個神經壞死病毒濃度樣品的交叉點(crossing point)，如圖10顯示神經壞死病毒濃度對於交叉點的曲線圖，並得到CP = -1.481μΦ_+39.4的線性方程式，並且做為計算神經壞死病毒濃度的標準曲線。實施例5免疫磁減量與實時聚合酶連鎖反應分析方式的比較為了確認IMR檢測神經壞死病毒濃度的分析方式能取代實時聚合酶連鎖反應，本實施例利用IMR與實時聚合酶連鎖反應同時測試15個樣品，對於每個樣品，有兩個神經壞死病毒濃度的數值，一是使用IMR偵測的數值為，另一使用實時聚合酶連鎖反應偵測的數值為Φ_\ ,ΡΟ 。圖11顯不出Φ_\ ,ΙΜΕ與Φ_, POi之間的聞度相關性，其相關係數為·O. 99，因此證實利用MR偵測神經壞死病毒濃度是具有可信度。以上所述僅是本發明的優選實施方式而非對本發明保護範圍的限制，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，可以對本發明技術方案進行修改或等同替換，這些修改或等同替換也應視為本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種用於檢測水產動物病毒的檢測試劑，其特徵在於，包含 溶液；及 多個磁性納米粒子，所述多個磁性納米粒子分布於所述溶液中，所述多個磁性納米粒子中的各磁性納米粒子包含 磁性核； 界面活性劑層，所述界面活性劑層披覆於所述磁性核上 '及 多個水產動物病毒抗體，所述多個水產動物病毒抗體結合於所述界面活性劑層上。
2.如權利要求I所述的用於檢測水產動物病毒的檢測試劑，其特徵在於所述溶液包含水。
3.如權利要求I所述的用於檢測水產動物病毒的檢測試劑，其特徵在於所述磁性納米粒子的材料選自由四氧化三鐵、三氧化二鐵、鐵酸錳、鐵酸鈷及鐵酸鎳所組成的群組。
4.如權利要求I所述的用於檢測水產動物病毒的檢測試劑，其特徵在於所述磁性納米粒子的磁性核材料為四氧化三鐵。
5.如權利要求I所述的水產動物病毒的檢測試劑，其特徵在於所述界面活性劑層的界面活性劑包含有機酸、蛋白質A、蛋白質G、葡聚糖或微脂粒。
6.如權利要求I所述的水產動物病毒的檢測試劑，其特徵在於所述界面活性劑層的界面活性劑為葡聚糖。
7.如權利要求I所述的水產動物病毒的檢測試劑，其特徵在於所述水產動物病毒包含神經壞死病毒、虹彩病毒和感染性胰臟壞死病毒。
8.如權利要求I所述的水產動物病毒的檢測試劑，其特徵在於，所述水產動物病毒為神經壞死病毒。
全文摘要
本發明提供一種檢測水產動物病毒的檢測試劑，該檢測試劑可透過磁性免疫分析儀檢測帶有水產動物病毒抗體的磁性納米粒子的免疫磁減量(Immunomagnetic Reduction，IMR)訊號，並通過邏輯函數計算出水產動物體內的病毒濃度，進一步確認水產動物感染病毒。
文檔編號G01N33/569GK102879564SQ20111025798
公開日2013年1月16日 申請日期2011年9月2日 優先權日2011年7月14日
發明者楊謝樂 申請人:磁量生技股份有限公司