評價致病兩期細菌的毒力的方法
2023-05-12 12:49:26 2
專利名稱：評價致病兩期細菌的毒力的方法
技術領域：
本發明涉及用於測定環境系統中的致病兩期細菌(biphasicbacteria)的方法， 更準確地說，涉及用於評價環境系統中的致病兩期細菌的毒力的方法。
背景技術：
在水、食物、健康保健或製藥行業的環境或臨床樣品中致病細菌的存在可能引起 嚴重的健康顧慮。評價致病細菌以確定其毒力對評價這些樣品的相對風險十分關鍵。可 以採用常規測定法，例如基於培養的方法或基於雜交的方法，來測定微生物病原體的濃度。 然而，基於培養的方法需要漫長的孵育時間，而且該方法容易產生錯誤結果，因為野外樣品 (field sample)可能干擾該方法。同樣，用基於雜交的方法很難精確地檢測低水平的致病 細菌。更重要的是，兩種方法的輸出結果僅僅是細菌濃度，而非是公眾和業界更加關注的致 病毒力。因此，存在對用於快速準確地測定兩期致病細菌的相對毒力並提供低水平檢測的 改進方法和系統的需要。發明概述在一個實施方案中，用於評價環境系統中的兩期細菌的相對致病毒力的方法包括 測定細菌的DNA濃度、測定細菌的RNA濃度、求出RNA濃度與DNA濃度的比率並將濃度比與 相對致病性水平相關聯。各個實施方案提供在早期發作當病原體處於低濃度時用於檢測和測定兩期致病 細菌相對毒力的快速、準確和低成本方法。附圖簡述
圖1圖示嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)的平板計數。該曲線圖是CFU/ ml的對數與時間(小時)的函數。圖2圖示通過實時PCR測定的嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)的DNA拷貝 數。該曲線圖是DNA(GU)的對數與時間(小時)的函數。圖3圖示通過實時TMA測定的嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)的rRNA拷 貝數。該曲線圖是rRNA拷貝數的對數與時間(小時)的函數。圖4圖示嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)的rRNA/DNA的比率。該曲線圖 是rRNA/DNA比率的對數與嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)生長期(Lpn期)的函數。發明詳述單數形式包括複數對象，除非文中有明確規定。陳述同一特徵的所有範圍的端點 可獨立組合併包括所述端點。所有參考文獻都通過引用結合到本文中。與數量聯用的修飾語「約/大約」包括所述值並具有文中規定的含意(例如包括 與特定數量測量值有關的公差範圍)。「任選的」或「任選」是指隨後描述的事件或情況可能發生或者可能不發生，或者隨 後指定的材料可能存在或可能不存在，且該描述包括其中事件或情況發生或者其中材料存 在的情形，以及其中事件或情況不發生或者材料不存在的情形。
在一個實施方案中，用於評價環境系統中的兩期細菌的相對致病毒力的方法包括 測定細菌的DNA濃度、測定細菌的RNA濃度、求出RNA濃度與DNA濃度的比率並將濃度比與 相對致病性水平相關聯。
環境系統中的致病兩期細菌可能引起健康問題。這些病原體已產生對付不同環境 應激條件的特殊策略。細菌經歷4個不同的時期。起始期為延遲期，其中細菌成熟，但不能 分裂。指數期是其中細胞繁殖的時期。在進入宿主細胞時，基因表達將改變以允許增殖。當 環境中有大量營養物時，細菌停留在指數期。當營養物變得有限或開始缺乏時，細菌開始轉 入靜止期(亦稱後指數期)，其中生長速率接近或等於死亡速率。在靜止期間，病原體從代 謝轉變到提高感染性。當進入宿主細胞時，基因表達將改變以允許增殖。靜止期是最強毒 力期，因為它允許細菌加強感染。在靜止期後是死亡期，其中營養物耗盡，細菌死亡。細菌群可以是單一生長期的單一物類，或不同生長期的混合群，或4個時期的任 何組合。在實驗室生長培養物中也觀察到這4個時期。兩期致病細菌是可以轉變其代謝過程並改變其細胞表達和胞外活性使得病原體 尋找可以提供複製的基本生長條件的宿主的任何病原體類型。在一個實施方案中，兩期致 病細菌包括但不限於嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)、結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)或李其j 特菌屬(Lysteria)。環境系統可以是其中兩期致病細菌可侵入的任何類型的環境。在一個實施方案 中，環境系統可以是液體、固體或空氣。在一個實施方案中，環境系統可以是土壤、含有可攜 帶致病細菌的宿主細胞的霧化流體或水性介質。在一個實施方案中，水性介質可以是水、血 液、尿液、痰、體液或前述的任何組合。在另一個實施方案中，液體介質可以是冷卻塔水、廢 水或者從水、食品、醫療保健或製藥行業得到的其它工業液體。可用任何合適的方法測定兩期細菌的DNA濃度。在一個實施方案中，可以通過對 從兩期細菌提取的DNA進行實時聚合酶鏈式反應(PCR)來測定DNA濃度。在另一個實施方 案中，可以使用巨噬細胞感染性增強蛋白(mip)基因靶向引物、探針和熱穩定酶對從兩期 細菌提取的DNA進行實時PCR來測定DNA濃度。使用引物和熱穩定酶按指數擴增DNA以用於測定。引物為短的DNA片段，其與待 測定的DNA相匹配，熱穩定酶將引物裝配到新的DNA鏈上。熱穩定酶可以是Taq聚合酶，例 如Taqman 探針。探針含有DNA模板和螢光標記。DNA模板是底物上的特異性DNA序列，允許探針 只靶向或測定與DNA模板匹配的DNA。將螢光標記與DNA連接以檢測擴增的DNA。螢光標 記可以是在DNA存在時改變其螢光信號的任何類型的螢光染料或指示劑。在一個實施方案 中，螢光染料是螢光染料或螢光團，其是與核酸結合的微生物染料。在一個實施方案中，熒 光團可以是5-羧基四甲基羅丹明(TAMRA)。可通過任何類型的螢光檢測器檢測螢光。在一個實施方案中，螢光信號通過螢光 光譜法、螢光顯微鏡檢術、螢光二極體陣列檢測、微量培養板螢光讀數或流式細胞術測定。可用任何合適的方法測定兩期細菌的RNA濃度。選定的RNA可以是信使RNA (mRNA) 或核糖體RNA(rRNA)。在一個實施方案中，RNA可從兩期細菌中提取，並通過包括但不限於 以下的方法測定RNA印跡法、核糖核酸酶保護測定、原位雜交、實時轉錄介導的擴增(TMA) 或反轉錄酶聚合酶(reverse transcriptase polymerase)鏈式反應。RNA印跡法應用根據大小分離RNA樣品的電泳和與靶RNA序列的至少一部分互補的雜交探針以檢測RNA。雜 交信號用X光片檢測，並通過光密度測定法定量。原位雜交採用含有互補RNA鏈以檢測靶 RNA的標記探針。可通過測定螢光、射線照相法或免疫組織化學來定量測定RNA。在反轉錄 聚合酶鏈式反應中，使用反轉錄酶將RNA鏈反轉錄至其DNA互補鏈中，使所得到的互補DNA 擴增，並採用如上所述的實時PCR進行測定。TMA是核酸擴增試驗，可通過商業途徑購自 Gen—Probe， Inc0可通過任何合適的方法提取兩期細菌細胞的核酸(DNA和RNA)，在一個實施方案 中，可通過裂解細胞來提取致病細胞的核酸。可採用機械、化學、物理、電學、超聲或微波方 法或這些方法的任何組合進行裂解。機械裂解物理性地破壞細胞屏障，例如通過剪切、振動或外力。機械方法的實例包 括但不限於壓力驅動細胞流過過濾器樣結構或流體通道中的小規模擋板(bar)、用快速擴 散混合的低離子強度水滲透性地給細胞施壓、在進入具有尖窄的小規模結構的特定區域的 同時使細胞遭受剪切力、用微珠打珠機或珠磨機破壞細胞屏障或者向水性介質中的細胞施 加超聲能。當使用化學試劑破壞細胞屏障並使胞內內含物釋放出來時便會發生化學裂解。可 以使用可破壞細胞屏障的任何化學試劑。在一個實施方案中，可以使用洗滌劑、酶、抽提 溶劑或裂解緩衝液。洗滌劑包括但不限於十二烷基硫酸鹽、3_[ (3-膽醯氨基丙基)二甲 基氨基(amm0ni0)]-l-丙磺酸、TWEEN 20洗滌劑、TRITON X系列洗滌劑、膽酸鈉、脫氧 膽酸鈉、氯化孤。酶包括但不限於溶菌酶、變溶菌素、labiase、溶葡萄球菌素、溶細胞酶、 蛋白酶K、內溶素或消色肽酶。抽提溶劑包括但不限於聚乙烯聚吡咯烷酮、苯酚、三氯三氟 乙烷或苯酚和硫氰酸孤或氯化孤的混合物。裂解緩衝液包括但不限於氯化銨、季銨化合 物、十六烷基三甲基溴化銨、鯨蠟基三甲基溴化銨、十二烷基硫酸鈉、六偏磷酸鹽、焦磷酸 鈉、Swab Transfer Medium(STM)(—種可通過商業途徑購自Gen-Probe、Inc.的裂解溶 液)、Zap-o-globin ( —種可通過商業途徑購自Coulter Diagnostics的裂解緩衝液)或 CyQUANT 細胞裂解緩衝液(可通過商業途徑購自MolecularProbes)。試劑可以任何適於裂解微生物物質的量加入，並且可以過量加入。在一個實施方 案中，以約Iml-約10，OOOml/毫升水性介質的量加入試劑。在另一個實施方案中，以約 Iml-約1000ml/毫升水性介質的量加入試劑。在另一個實施方案中，以約Iml-約50ml/毫 升水性介質的量加入試劑。物理裂解可以熱的方式或通過凍融而發生。通過例如用加熱塊或加熱板加熱水性 介質而以熱的方式完成細胞裂解。在一個實施方案中，將水性介質加熱至約40°C-約100°C 的溫度。在另一個實施方案中，溫度為約40°C -約60°C。在一個實施方案中，將水性介質 加熱約1分鐘_約1小時。在另一個實施方案中，將水性介質加熱約1分鐘_約30分鐘， 包括約1分鐘_約15分鐘，在另一個實施方案中，將水性介質加熱約1分鐘_約3分鐘。在凍融的一個實例中，將水性介質例如在乙醇_乾冰浴凍結，然後融化。 可以通過擴散混合和介電泳捕集(dielectrophoretic trapping)或通過微波輻 射，用一系列的電脈衝以電的方式裂解細胞。自由基也可用於細胞裂解。該方法包括將電 場應用於水性介質中的金屬離子、過氧化物和微生物物質的混合物中以產生可攻擊細胞屏 障的自由基。
在一個實施方案中，可以純化由細胞裂解物中提取的核酸以得到特定的靶DNA和 特定的靶RNA。在一個實施方案中，可經化學沉澱與溶解、磁珠或與樹脂的親和力通過非特 異性吸附或者通過與互補引物連接，來純化核酸。在一個實施方案中，在化學沉澱期間，可 將溶劑加入細胞裂解物中以製備溶液，並可將沉澱溶劑與提取的核酸混合以沉澱出特定的 靶核酸後，隨溶劑一起除去雜質。在一個實施方案中，沉澱溶劑包括但不限於乙醇和異丙 醇。在溶解期間，加入溶解溶劑以重新溶解沉澱後的核酸。水溶性雜質在溶解溶劑中溶解 有限，並且不會重新溶解。溶解溶劑可包括氯化鋰、氯化孤或醇與一價陽離子的組合。
在另一個實施方案中，可以用磁珠通過結合-洗滌-洗脫步驟對核酸進行純 化。在一個實施方案中，磁珠可以是可通過商業途徑購自Promega Corporation的
Promega MagneSil Red 或可通過商業途徑購自 Seradyn Inc 的;Seradyn 珠。在互補引物方法中與樹脂的親和力中，使用DNA模板來選擇靶DNA。DNA模板是底 物上的互補寡核苷酸序列。在一個實施方案中，提取的核酸的純化可以是自動化的。在另一個實施方案中，可 以使用可通過商業途徑購自Thermo ElectronCorporation的KingFisher 儀器進行自動純化。求出RNA濃度與DNA濃度的比率。該比率表明兩期細菌存在於特定生長期的可能 性，並提供用於評價致病細菌的相對毒力的參數。兩期細菌含有處於延遲期、指數生長期 (其中細胞類似於發生改變以允許增殖的細胞內細胞)和後指數期(其中細胞類似於細胞 外細胞並具有增強的毒力)的細胞。可將RNA與DNA的濃度比等同於相對致病性水平。在一個實施方案中，通過將該 濃度比與參比曲線相比較，將該濃度比等同於相對致病性水平。在一個實施方案中，可繪製 各個目標病原體的參比曲線。在另一個實施方案中，通過監測整個不同生長期的DNA和RNA 濃度來繪製參比曲線。在一個實施方案中，採用基於培養的平板計數方法來測定病原體的 生長期。為了本領域技術人員可更好地實施本申請的公開內容，以舉例方式而非限制方式 給出下列實施例。
實施例實施例1繪製用於測定嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)的毒力的參比曲線。從之前繁殖的培養基板中取出3-5個嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)菌 落，在液體培養基生長48-72小時，加至40ml新鮮滅菌的液體培養基以製成樣品。將樣品 於36°C振蕩(175rpm)24小時。以1 40體積比將嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)樣品加入另一新鮮滅 菌的液體培養基中以製備參比樣品。將樣品於36°C振蕩(175rpm)24小時。在以下不同的時間點測定參比樣品以確定嗜肺軍團菌(Legionel lapneumophi la) 的各生長期及DNA和RNA的濃度1. 5小時(為延遲期)、6小時、9小時(為指數期)、26小 時、28小時、30小時、32小時、34小時、48小時、51. 5小時、73. 5小時和77小時(為後指數期)。在各個時間點進行平板計數試驗以測定嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila) 的生長期。採用遵循測試標準AFNOR 90-431或IS011731的標準平板計數方法。在各個時 間點進行3次重複，結果為3次重複的平均值。平板計數試驗用大約10天完成，數據見圖1。在各時間點進行實時PCR和實時轉錄介導的擴增(TMA)試驗以分別測定嗜肺軍 團菌(Legionella pneumophila)的DNA和RNA濃度。最初，從嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)提取細胞核材料。每次取出Iml的起始樣品，在離心機中以3000g離心2分 鍾。取出上清液後棄去。加入Iml無菌page鹽(0.012% (w/v)氯化鈉、0. 0004% (w/v)硫 酸鎂五水合物、0.0004% (w/v)氯化鈣脫水物、0.0. 142% (w/v)磷酸氫二鈉、0. 0136% (w/ ν)磷酸二氫鉀(136mg/L))使樣品重新懸浮。取出100μ 1重新懸浮的樣品，用3ml化學裂 解緩衝液STM裂解至少3小時。實時PCR試驗採用珠粒型DNA純化方法。500 μ 1裂解物用Promega MagneSil Red(可通過商業途徑購自Promega Corporation)純化。引物(mip6和mip8)擴增mip基 因的ι ο-bp片段，擴增用TaqMan 探針TQ-mip (用5 『 -fam/3 『 -tamra標記)檢測。數 據見圖2。實時TMA試驗是基於轉錄的檢測RNA的方法。將500 μ 1裂解物用Seradyn 珠粒 純化，使嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila) 23SrRNA的區域擴增。擴增產物用5-羧基 四甲基羅丹明(TAMRA)螢光團標記的火炬型(torch)探針檢測。數據見圖3。在得到所有結果後進行數據分析。rRNA/DNA比率=用TMA測定的rRNA拷貝數/用實時PCR測定的DNA基因組單位 (genomic unit, GU)。rRNA拷貝/CFU =用TMA測定的rRNA拷貝數/用平板計數方法測定的菌落形成單 位(CFU)。指數期的平均RNA/DNA比率為22，542，靜止期的平均值為6685。參比曲線用該數 據繪製並見圖4。基於靶RNA/DNA比率的方法鑑定出特定的兩期病原體生長期，並在3小時以內評 價其相對毒力。實施例2通過過濾型濃縮(filtration-based concentration)從不同的50ml冷卻塔 水樣品中獲得浮遊的嗜肺軍團菌細胞(Legionella pneumophila)。將樣品通過聚醚碸 (PES) 0. 45 μ m膜過濾。將細胞在該膜上用3ml化學裂解緩衝液STM裂解過夜，將裂解物通 過PES 0. 22 μ m膜過濾除去細胞碎片。按照實施例1所述方法定量測定裂解物中的DNA和rRNA。如表1所示，這些野外樣品的大部分的rRNA/DNA比率所在範圍為300-9000，這表 明嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)的生長期為後指數期。表 權利要求
1.一種用於評價環境系統中的兩期細菌的相對細菌毒力的方法，所述方法包括測定細 菌的DNA濃度、測定細菌的RNA濃度、求出RNA的濃度與DNA的濃度比率並將RNA與DNA之 比與相對致病性水平相關聯。
2.權利要求1的方法，其中所述兩期致病細菌選自嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)、結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)禾口李斯特菌屬(Lysteria)。
3.權利要求1的方法，其中所述環境系統是液體、固體或空氣。
4.權利要求3的方法，其中所述環境系統選自土壤、霧化流體和水性介質。
5.權利要求4的方法，其中所述水性介質選自水、廢水、血液、尿液、痰、體液和前述的 任何組合。
6.權利要求1的方法，其中對從兩期細菌中提取的DNA進行實時聚合酶鏈式反應以測 定DNA濃度。
7.權利要求6的方法，其中所述實時聚合酶鏈式反應使用巨噬細胞感染性增強蛋白 (mip)基因靶向引物、探針和熱穩定酶。
8.權利要求7的方法，其中所述探針含有DNA模板和螢光標記。
9.權利要求8的方法，其中所述螢光標記是螢光染料或螢光團。
10.權利要求8的方法，其中通過選自以下的螢光檢測法來測定所述螢光標記的螢光 信號螢光光譜法、螢光顯微鏡檢術、螢光二極體陣列檢測、微量培養板螢光讀數和流式細 胞術。
11.權利要求1的方法，其中通過選自以下的方法來測定從兩期細菌中提取的RNA的 RNA濃度RNA印跡法、核糖核酸酶保護測定、原位雜交、實時轉錄介導的擴增和反轉錄酶聚 合酶鏈式反應。
12.權利要求6的方法，其中所述DNA通過裂解細胞而從兩期細菌中提取。
13.權利要求12的方法，其中所述細胞通過選自以下的裂解方法裂解機械、化學、物 理、電學、超聲、微波方法和前述方法的任何組合。
14.權利要求13的方法，其中對所述提取的DNA進行純化以得到特定的靶DNA。
15.權利要求14的方法，其中所述提取的DNA通過選自以下的方法純化化學沉澱與 溶解、磁珠和與樹脂的親和力。
16.權利要求11的方法，其中所述RNA通過裂解細胞而從兩期細菌中提取。
17.權利要求16的方法，其中所述細胞通過選自以下的裂解方法裂解機械、化學、物 理、電學、超聲、微波方法和前述方法的任何組合。
18.權利要求11的方法，其中對所述提取的RNA進行純化以得到特定的靶RNA。
19.權利要求18的方法，其中所述提取的RNA通過選自以下的方法純化化學沉澱與 溶解、磁珠和與樹脂的親和力。
20.權利要求1的方法，其中通過將所述比率與參比曲線相比較而使所述比率等同於 相對致病性水平。
21.權利要求20的方法，其中通過用基於培養的平板計數方法在整個不同的生長期監 測DNA和RNA的濃度而繪製所述參比曲線。
全文摘要
一種用於評價環境系統中兩期細菌的相對細菌毒力的方法，所述方法包括測定細菌的DNA濃度、測定細菌的RNA濃度、求出RNA濃度與DNA濃度的比率並將濃度比與相對致病性水平相關聯，其中所述細菌優選為嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)、結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和李斯特菌屬(Lysteria)。
文檔編號C12Q1/68GK102105602SQ200980130497
公開日2011年6月22日 申請日期2009年7月29日 優先權日2008年7月30日
發明者K·楊, S·M·博伊特, 徐韡卿, 李潔, 陳靜 申請人:通用電氣公司