一種羊多抗血清特異性抗體的純化方法與流程
2023-05-12 22:47:26
本發明屬於生物工程領域，具體涉及一種羊多抗血清特異性抗體的純化方法。
背景技術：
抗血清為含有某一類具有特異免疫功能的抗體分子的血清，一般為動物被人工注射某類抗原後製備的動物血清。一種抗原能否引起抗體生成反應，一方面取決於抗原分子表面有無抗原決定簇（antigenicdeterminant），另一方面取決於機體的免疫狀態，當具備以上兩個條件後，抗體生成將遵循抗體生成的一般規律——初次反應和再次反應。抗原的種類繁多，包括天然的蛋白質抗原和細胞性抗原、合成性抗原以及基因工程抗原等，不同的抗原免疫動物具有不同的特殊性。一般完全抗原免疫動物需加用佐劑，尤其在使用可溶性抗原時，以期得到高效價的抗血清；合成性抗原和基因工程抗原等半抗原物質需先通過人工的方法與蛋白質載體連接後再與佐劑混合免疫動物，方可獲得理想的免疫效果。使用佐劑後可增加抗原的免疫原性和延長抗原在機體內存留的時間，從而改變了抗原原有的免疫原性。
動物免疫系統是動物在種系發生和個體發育過程中逐漸進化和完善起來的，是機體執行免疫功能的組織機構，是產生免疫應答的物質基礎。動物免疫系統是由免疫器官、免疫細胞和免疫分子組成的。
製備抗體的傳統方法是用純制的抗原多次接種於適當的成年健康動物，則激其產生免疫應答，血清中含有大量特異性抗體，又稱抗血清或免疫血清。
目前，抗血清特異性抗體的純化方法主要採用離心分離法、鹽析法和層析法中任一種，每種方法都存在缺陷，比如離心分離法包括差速離心和梯度離心，二者操作過程比較複雜，差速離心是要在低速與高速交替進行，離心的對象是大小差別較大的顆粒；梯度離心要先進行前處理，然後等梯度形成後再離心，時間較長。鹽析法會受到蛋白質濃度、ph值、離子強度、溫度的影響，因此效果不好。層析法根據其原理不同可分為離子交換層析，凝膠過濾層析，親和層析；這種方法是目前提取物純度較高的方法，但是操作複雜，適應性差。
技術實現要素：
為了克服現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種操作簡單、能提高提取物純度的羊多抗血清特異性抗體的純化方法。
為達到上述目的，本發明是通過以下的技術方案來實現的。
一種羊多抗血清特異性抗體的純化方法，該方法包括以下步驟：
1）鹽析法：用辛酸、硫酸銨三步沉澱法，將羊多抗血清中的特異性抗體全部提取；
2）蛋白g柱純化：取鹽析後的羊多抗血清特異性抗體，用結合緩衝液稀釋，過濾，加入g柱中，收集流穿液，用結合緩衝液加入g柱中，待全部流出，加洗脫緩衝液，同時收集洗脫液；即得到純化後的羊多抗血清特異性抗體。
進一步地，步驟1）鹽析法的具體步驟如下；
（11）羊多抗血清用4倍體積乙酸-乙酸鈉緩衝液稀釋，用0.1mnaoh調至ph4.5；
（12）室溫下滴加辛酸，攪拌30min，按每升溶液滴加25ml辛酸的比例滴加；
（13）冷凍高速離心機離心，收集上清夜，棄去沉澱；
（14）過濾上清液；
（15）按上清液體積的l/10加入10×pbs（磷酸鹽緩衝溶液，0.1m），用5mnaoh調至ph7.4；
（16）按每升溶液加277g硫酸銨，攪拌30min；
（17）冷凍高速離心機離心，棄去上清液，收集沉澱；
（18）沉澱用透析液溶解，透析脫鹽。
作為鹽析法的進一步改進，步驟（13）中的離心轉速為10000rpm，離心30min。
作為鹽析法的進一步改進，步驟（17）中的離心轉速為5000rpm，離心15min。
進一步地，步驟2）中，蛋白g柱純化法的步驟為：
（21）血清處理：取羊多抗血清，用結合buffer（緩衝液）1:1稀釋，充分混勻，濾膜過濾；
（22）柱子平衡：用結合buffer加入柱中，流至液面與膠面平；
（23）吸附：處理好的抗血清加入柱中，收集流穿液；
（24）洗雜：用結合buffer加入柱中，待全部流出；
（25）洗脫抗體：加洗脫buffer，同時用離心管收集洗脫液，前1.5ml丟棄，收集後續全部洗脫液。
作為蛋白g柱純化法的進一步改進，步驟2）中，
結合緩衝液為：10mmpbs含nan30.01%，ph7.2—7.4。
洗脫緩衝液為：10mmnah2po4，150mmnacl含nan30.01%，用鹽酸調至ph2.8±0.04，其中所用鹽酸為5mhcl。
作為蛋白g柱純化法的進一步改進，步驟2）中，過濾採用0.22nm的濾膜過濾。
有益效果：與現有技術相比，本發明的優點在於：本發明操作簡單，提取物純度能提高20%。
具體實施方式
下面結合實例對本發明作進一步的詳細說明。
實施例1：一種羊多抗血清特異性抗體的純化方法，該方法包括以下步驟：
第一步，鹽析法：用辛酸、硫酸銨三步沉澱法，將羊多抗血清中的特異性抗體全部提取；具體步驟如下；
（11）羊多抗血清用4倍體積乙酸-乙酸鈉緩衝液稀釋，用0.1mnaoh調至ph4.5；
（12）室溫下滴加辛酸，攪拌30min，按每升溶液滴加25ml辛酸的比例滴加；
（13）冷凍高速離心機離心，收集上清夜，棄去沉澱；離心轉速為10000rpm，離心30min;
（14）過濾上清液；
（15）按上清液體積的l/10加入10×pbs，用5mnaoh調至ph7.4；
（16）按每升溶液加277g硫酸銨，攪拌30min；
（17）冷凍高速離心機離心，棄去上清液，收集沉澱；離心轉速為5000rpm，離心15min;
（18）沉澱用透析液溶解，透析脫鹽。透析液購買自天津市標準生物製劑有限公司。
第二步，蛋白g柱純化：
具體步驟如下：
（21）血清處理：取鹽析後的羊多抗血清，用結合buffer（緩衝液）1:1稀釋，充分混勻，採用0.22nm的濾膜過濾；結合緩衝液為：10mmpbs含nan30.01%(重量百分比)，ph7.2—7.4。
（22）柱子平衡：用結合buffer加入柱中，流至液面與膠面平；
（23）吸附：將步驟（21）處理好的抗血清加入柱中，收集流穿液；
（24）洗雜：用結合buffer加入柱中，待全部流出；
（25）洗脫抗體：加洗脫buffer，同時用離心管收集洗脫液，前1.5ml丟棄，收集後續全部洗脫液。即得到純化後的羊多抗血清特異性抗體。洗脫buffer為：10mmnah2po4，150mmnacl含nan30.01%(重量百分比)，用鹽酸調至ph2.8±0.04，其中所用鹽酸為5mhcl。
下面通過對純化後的crp羊多抗、apoa1羊多抗、apob羊多抗進行檢測，檢測條件：od280，免疫雙向擴散，生化儀，sds-page；結果如下：
（一）crp羊多抗優勢：
1、將常規的低值檢測範圍從1mg/l提高至0.3mg/l，將高值範圍從150mg/l提高至500mg/l，為全量程crp檢測試劑提供了高質的原料抗體；
2、特異性高，全量程定標樣條法曲線平滑，達到定標接受標準；
3、親和力高，將原料抗體稀釋10倍測定，測量25mg/l的被測物時，吸光度變化值（∆a）0.02～0.20之間；
4、該法純化各批次羊多抗批間差小，提供的三批次純化羊多抗測定數據相對偏差≤10%；
（二）apob羊多抗優勢：
1、純化羊多抗線性範圍為（0.3-2.0）g/l，在此線性範圍內線性相關係數r≥0.990；
2、批間準確度：相對偏差≤10%；
3、分析靈敏度：測量0.60g/l的被測物時，吸光度之差（∆a）在0.10～0.40之間。
（三）apoa1羊多抗優勢：
1、純化羊多抗線性範圍為（0.3-2.4）g/l，在此線性範圍內線性相關係數r≥0.990；
2、批間準確度：相對偏差≤10%；
3、分析靈敏度：測量1.20g/l的被測物時，吸光度之差（∆a）在0.20～0.40之間。
本發明按照上述實施例進行了說明，應當理解，上述實施例不以任何形式限定本發明，凡採用等同替換或等效變換方式所獲得的技術方案，均落在本發明的保護範圍之內。