一種膽石通利片的製備方法及其在製備抑制黑色素瘤細胞b16細胞增殖藥物中的應用的製作方法
2023-05-13 00:07:31
一種膽石通利片的製備方法及其在製備抑制黑色素瘤細胞b16細胞增殖藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於中藥【技術領域】，具體涉及一種膽石通利片的製備方法及應用。本發明的膽石通利片的製備方法，由金錢草225g、茵陳225g、鬱金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三稜45g、梔子45g、甘草25g、沒藥35g作為原料藥製成，採用超微粉碎、超臨界萃取、微波萃取和大孔樹脂吸附製備而成，使得橙皮苷含量有很大提高。本發明還提供了膽石通利片在製備抑制小鼠黑色素瘤細胞B16細胞增殖藥物中的應用。
【專利說明】一種膽石通利片的製備方法及其在製備抑制黑色素瘤細胞BI 6細胞增殖藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於中藥【技術領域】，具體涉及一種膽石通利片的製備方法及其在製備抑制小鼠黑色素瘤細胞B16細胞增殖藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]膽石通利膠囊標準號WS-10324 (ZD-0324) -2002，記載於國家中成藥標準彙編內科肝膽分冊。由金錢草225g、茵陳225g、鬱金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白帆35g、大黃45g、三稜45g、桅子45g、甘草25g、沒藥35g作為原料藥製成,具有清熱利膽，化瘀排石的功效。用於肝膽溼熱所致的急、慢性膽囊炎，膽結石等。
[0003]現有技術中，尚未有膽石通利膠囊在提取製備方面採用超微粉碎、CO2超臨界萃取、微波技術和大孔樹脂吸附技術提取的報導，而中藥直接打粉取、水煎煮的方法，工藝粗糙、落後，雜質多，導致患者用量過大，不方便服用，嚴重影響了本品在臨床上應用。
【發明內容】
[0004]為了解決上述的技術問題，本發明提供了一種膽石通利片的製備方法。
[0005]本發明的另一個目的在於提供一種膽石通利片在製備抑制小鼠黑色素瘤細胞B16細胞增殖藥物中的應用。
[0006]本發明的目的是通過如下的方案實現的:
[0007]—種膽石通利片的製備方法，由金錢草225g、茵陳225g、鬱金90g、陳皮150g、黃岑45g、乳香35g、芒硝80g、白帆35g、大`黃45g、三稜45g、桅子45g、甘草25g、沒藥35g作為原料藥製成，所述的製備方法由下列步驟組成:芒硝、白帆超微粉碎成粒度範圍5-45 μ m的細粉備用；取乳香、沒藥，粉碎成細粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑佔總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.η?η,萃取時間180-220min,得超臨界萃取物，備用；萃取後的乳香、沒藥殘洛與其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W,萃取2次，每次5-10分鐘，合併萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮並乾燥，得微波提取物，將超微粉碎後的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入澱粉，70%乙醇制顆粒，乾燥,壓片，製成500片，每片重0.3g。
[0008]上述的膽石通利片的製備方法中，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑佔總萃取溶劑的體積百分比為5%。
[0009]上述的膽石通利片的製備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25MPa。
[0010]上述的膽石通利片的製備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為60°C。
[0011]上述的膽石通利片的製備方法中，所述CO2超臨界萃取中CCV流量2ml/g生藥.mirio[0012]上述的膽石通利片的製備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取時間為200min。
[0013]上述的膽石通利片的製備方法中，所述微波萃取功率為700W。
[0014]上述的膽石通利片的製備方法中，所述微波萃取每次萃取時間為8分鐘。
[0015]上述的膽石通利片在製備抑制小鼠黑色素瘤細胞B16細胞增殖藥物中的應用。
[0016]現有技術中，膽石通利膠囊口服，一次5粒，一日3次。膽石通利膠囊服藥量大。採用本發明方法製備成的膽石通利片每片重0.3g，每次僅需2片，一日服用3次。在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結論可以通過下述試驗證明。
[0017]試驗一、不同方法製備的膽石通利片中橙皮苷含量的比較
[0018]1、儀器及試藥本發明膽石通利片:按實施例1方法製備，使用IOSOg原料藥，經提取製成500片，每片重0.3g。原膽石通利膠囊，按照WS-10324 (ZD-0324) -2002標準方法製備，作為對照。Agilentl200高效液相色譜儀；AE240電子分析天平；橙皮苷對照品(中國藥品生物製品檢定所)。 [0019]2、方法
[0020]照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄V D)測定。
[0021]色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基矽烷健合矽膠為填充劑；甲醇一水(40: 60)為流動相；檢測波長為284nm;理論板數按橙皮苷峰計算應不低於3000。
[0022]對照品溶液的製備精密稱取橙皮苷對照品適量，加甲醇製成每Iml含38μ g的溶液，即得。
[0023]本發明產品供試品溶液的製備取本發明的膽石通利片，研細，取0.06g,，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，稱定重量，密塞，超聲處理(功率250w，頻率30kHz)40分鐘，放冷，稱定重量，並用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
[0024]對照品供試品溶液的製備取本對照的膽石通利膠囊，混勻，研細，取0.15g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，稱定重量，密塞，超聲處理(功率250w，頻率30kHz)40分鐘，放冷，稱定重量，並用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
[0025]測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得。
[0026]3、結果
[0027]結果表明，本發明膽石通利片中橙皮苷的含量為6-10mg/片；而原膽石通利膠囊中橙皮苷的含量為1.45mg/粒，每片橙皮苷含量相當於原膠囊劑含量的4-6倍，在服用量減少的情況下，橙皮苷含量有很大提高。
[0028]上述研究表明，採用本發明製備方法製備的膽石通利片，有效成分含量遠遠高於WS-10324 (ZD-0324) -2002標準記載的方法製備的膽石通利膠囊。
【具體實施方式】
[0029]下面結合具體實施例對本發明作更進一步的說明，以便本領域的技術人員更了解本發明，但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例，凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。
[0030]實施例1
[0031]取金錢草225g、茵陳225g、鬱金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三稜45g、桅子45g、甘草25g、沒藥35g:將芒硝、白礬超微粉碎成粒度範圍5-45 μ m的細粉備用；取乳香、沒藥，粉碎成細粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑佔總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.min，萃取時間200min，得超臨界萃取物，備用；萃取後的乳香、沒藥殘渣與其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合併萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮並乾燥，得微波提取物，將超微粉碎後的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入澱粉，70%乙醇制顆粒，乾燥，壓片，製成500片，每片重0.3g。
[0032]經檢測，成品中橙皮苷的含量為9.86mg/片。
[0033]實施例2
[0034]取金錢草225g、茵陳225g、鬱金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三稜45g、桅子45g、甘草25g、沒藥35g:將芒硝、白礬超微粉碎成粒度範圍5-45 μ m的細粉備用；取乳香、沒藥，粉碎成細粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑佔總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，CO2流量3ml/g生藥.π?η，萃取時間180min，得超臨界萃取物，備用；萃取後的乳香、沒藥殘渣與其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分鐘，合併萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮並乾燥，得微波提取物，將超微粉碎後的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入澱粉，70%乙醇制顆粒，乾燥，壓片，製成500片，每片重0.3g。
[0035]經檢測，成品中橙皮苷的含量為6.42mg/片。
[0036]實施例3
[0037]取金錢草225g、茵陳225g`、鬱金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三稜45g、桅子45g、甘草25g、沒藥35g:將芒硝、白礬超微粉碎成粒度範圍5-45 μ m的細粉備用；取乳香、沒藥，粉碎成細粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑佔總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，CO2流量lml/g生藥.min，萃取時間220min，得超臨界萃取物，備用；萃取後的乳香、沒藥殘渣與其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分鐘，合併萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮並乾燥，得微波提取物，將超微粉碎後的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入澱粉，70%乙醇制顆粒，乾燥，壓片，製成500片，每片重0.3g。
[0038]經檢測，成品中橙皮苷的含量為8.26mg/片。
[0039]實施例4:膽石通利片抑制小鼠黑色素瘤細胞B16細胞增殖的實驗研究資料
[0040]1.實驗材料
[0041]1.1實驗用細胞株
[0042]小鼠黑色素瘤細胞B16細胞，山東大學實驗室細胞庫，DMEM+10%FBS常規培養。
[0043]1.2實驗藥物[0044]研究藥物:本發明膽石通利片:按實施例1方法製備。
[0045]藥液儲液:稱取IOOmg膽石通利片，溶於5ml無水乙醇中，0.2 μ m濾器過濾，500 μ Idoff管分裝，-20°c存儲，同時0.2 μ m濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
[0046]1.3實驗試劑
[0047]DMEM(GIBC0 公司 Cat.N0.12100-061 Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ；NaHCO3(上海久億化學試劑有限公司Cat.N0.11810-033Lot.N0.1088387) ;Trypsin(AMRESCO 公司);EDTA(AMRESC0 公司);PenicillinG Sodium Salt (AMRESCO 公司 I) ；Streptomycin Sulfate(AMRESCO);無水乙醇(溜博亞杜蘭經貿有限公司)；MTT (Biosharp批號:0793) =PBS (實驗室自配)；
[0048]1.4實驗器材
[0049]萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號:DMIL);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型號:SPECTRAMAX 190) ;C02培養箱(FORMA型號:3111);超淨臺(蘇淨集團安泰公司製造型號:SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號:S/N 020579);精密移液器(法國吉爾森公司型號:P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號:BT323S);全自動高壓滅菌鍋(日本SANK)公司型號:MLS-3020);臺式電熱鼓風乾燥箱(上海精密實驗設備公司型號:DHG9123A);冰箱(西門子公司型號:KG18V21TI);液氮罐(CBS型號:2001);低速離心機(上海安亭科學儀器廠型號:ΚΑ-1000);0.2μπι濾器(MILLIP0RE型號:SLGP033RB) ;lcm培養皿(NEST公司)、96孔培養板(NEST公司)；細胞計數板；離心管、移液管、Tips若干。
[0050]2.實驗方法
[0051]1)B16細胞用DMEM+10%FBS於37 °C、5%C02進行常規培養(IOcm培養皿)，當細胞生長至對數期時，收集細胞，棄去培養液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0.25%胰蛋白酶-0.049ffiDTA，37°C消化2min後，向其中加入5ml完全培養基中和反應，吹打細胞後將其轉入離心管中，1000rpm離心5min，調`整細胞懸液濃度3X IO4個/ml。
[0052]2)將細胞種入96孔培養板中，每孔加入細胞懸液180 μ 1，培養板放入細胞培養箱中(37°C，5%C02)常規培養。
[0053]3)根據細胞生長情況，一般長至50%_70%，加入膽石通利片溶液，繼續培養24h。
[0054]4) 24h 後加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT)，繼續培養 4h。
[0055]5) 4h後扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍幹，每孔如入200 μ I 二甲基亞碸，置搖床上低速振蕩lOmin，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0056]6)同時設置本底(不加細胞，只加培養液)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞碸)，每組設定6個復孔。
[0057]7)結果以藥物對細胞的抑制率表示:細胞增值抑制率(%)=(對照孔OD值-給藥孔OD值)、對照孔OD值X 100%。實驗重複3次。
[0058]3.統計處理
[0059]採用Microsoft Excel 2007軟體中的相關分析和Student t檢驗，數據以mean + S.D.表不。
[0060]4.實驗結果
[0061]MTT法實驗後統計結果顯示，與對照組比較，當劑量達到5mg/ml時，對B16細胞增殖抑制有差異(p〈0.05)，劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性(P〈0.01)，當劑量達到15-20mg/ml時有極顯著性差異(P〈0.001)。
[0062]表1膽石通利片對B16細胞增殖抑制影響研究(X土 SD)
[0063]
【權利要求】
1.一種膽石通利片的製備方法，由金錢草225g、茵陳225g、鬱金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三稜45g、桅子45g、甘草25g、沒藥35g作為原料藥製成，其特徵在於，所述的製備方法由下列步驟組成:芒硝、白礬超微粉碎成粒度範圍5-45 μ m的細粉備用；取乳香、沒藥，粉碎成細粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑佔總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_501:，0)2流量l-3ml/g生藥.min，萃取時間180_220min，得超臨界萃取物，備用；萃取後的乳香、沒藥殘渣與其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合併萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮並乾燥，得微波提取物，將超微粉碎後的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入澱粉，70%乙醇制顆粒，乾燥，壓片，製成500片，每片重0.3g。
2.根據權利要求1所述的膽石通利片的製備方法，其特徵在於，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑佔總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3.根據權利要求1所述的膽石通利片的製備方法，其特徵在於，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25MPa。
4.根據權利要求1所述的膽石通利片的製備方法，其特徵在於，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為60°C。
5.根據權利要求1所述的膽石通利片的製備方法，其特徵在於，所述CO2超臨界萃取中CO2 流量 2ml/g 生藥.min。
6.據權利要求1所述的膽石通利片的製備方法，其特徵在於，所述CO2超臨界萃取中萃取時間為200min。
7.根據權利要求1所述的膽石通利片的製備方法，其特徵在於，所述微波萃取功率為700W。
8.根據權利要求1所述的膽石通利片的製備方法，其特徵在於，所述微波萃取每次萃取時間為8分鐘。
9.權利要求1所述的膽石通利片在製備抑制小鼠黑色素瘤細胞B16細胞增殖藥物中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK103800817SQ201310670117
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年12月10日 優先權日:2013年12月10日
【發明者】孫波 申請人:濟南新起點醫藥科技有限公司