一種雙中性蛋白酶分步酶解花生分離蛋白製備花生肽的方法

2023-05-14 06:59:41

專利名稱：一種雙中性蛋白酶分步酶解花生分離蛋白製備花生肽的方法
技術領域：
本發明涉及一種雙中性蛋白酶分步酶解花生分離蛋白製備花生肽的方法。
背景技術：
花生是我國重要的油料作物和食用作物，產量和出口量高居世界首位。目前，中國對花生的利用多在食用油脂的提取方面，對花生蛋白的利用較少。花生的蛋白質含量為25 % 30 %，花生蛋白含有人體必需的八種胺基酸，精氨酸含量高於其它堅果，生物學效價高於大豆。目前國內市場上的花生蛋白產品主要是花生蛋白粉，其一般是作為食品加工中的基礎原料。花生蛋白粉存在著不易吸收、生理潔性較差等缺點，所以在花生蛋白粉的基礎上，進一步開發和利用這一巨大的潛在蛋白資源生產高附加值產品成了當務之急。多項研究表明，花生蛋白經蛋白酶水解製備成花生肽後具有多種生理活性，包括抗氧化作用、抗菌作用、降血壓作用等。因此，研究花生蛋白粉酶解工藝製備花生肽，可以開發和利用花生蛋白粉這一巨大的潛在蛋白資源，生產高附加值蛋白產品。採用生物酶法在溫和條件下對蛋白進行水解，生成的多肽具有很高營養價值。現代營養研究表明，分子量小於IOOOu的短膚極易被人體吸收利用，而且具有較強的功能活性，這就要求所選用的酶解工藝在保證短肽得率的前提下儘量提高蛋白的水解度。

目前，蛋白水解製備短肽的工藝中，酶解時間一般在360 960min，短肽得率在60% 65%左右，體系水解度在12% 16%左右，且多存在脫鹽等繁瑣步驟。因此如何簡化工藝並在短時間獲得高水解度高得率的短肽成為生產工藝中需要解決的一大難題。

發明內容
本發明的目的是提供一種酶解花生分離蛋白製備花生肽的方法。本發明所提供的製備花生肽的方法，包括下述步驟:I)將花生分離蛋白粉用水溶解，得到花生分離蛋白溶液，將所述花生分離蛋白溶液置於80 85°C水浴中保持10 15min，使花生分離蛋白高度壓縮、緊密的結構鬆散開，暴露出分子內部的酶作用位點，以利於蛋白酶的結合；2)將步驟I)處理後的花生分離蛋白溶液取出，待溫度降至中性蛋白酶酶解適合的溫度後加入中性蛋白酶進行酶解，得到酶解液，記為酶解液I ;3)向所述酶解液I中加入複合蛋白酶，繼續進行酶解，得到酶解液2 ；4)使所述酶解液2中的中性蛋白酶和複合蛋白酶失活，離心取上清液，即得花生肽的溶液。其中，步驟I)中所述花生分離蛋白溶液中花生分離蛋白的質量濃度為6 8%，優選質量濃度為8%。所述花生分離蛋白粉中，蛋白含量不低於90 %，脂肪含量不高於I %。步驟2)中所述中性蛋白酶的加入量為5200 6500U/g蛋白。所述酶解的條件為:酶解溫度40 50°C，酶解時間1.5 2.0h ;優選酶解的條件為:酶解溫度45°C，酶解時間120min。所述酶解在恆溫水浴振蕩器中進行。步驟3)中所述複合蛋白酶的加入量為216 648U/g蛋白。所述酶解的條件為:酶解溫度40 50°C，酶解時間2.0 2.5h ;優選酶解的條件為:酶解溫度45°C，酶解時間120min。所述酶解在恆溫水浴振蕩器中進行。本發明中所述中性蛋白酶是由枯草芽孢桿菌經發酵提取而得的，屬於單一酶類，無特異性酶切位點；所述複合蛋白酶由內切酶和外切酶複合而成。本發明對中性蛋白酶酶活定義為:酪蛋白底物在特定條件下經酶水解，每分鐘產生I μ g酪氨酸為一個活力單位，以U表示。對複合蛋白酶酶活的定義為:酪蛋白底物在特定條件下經酶水解，每分鐘產生
Iμ g酪氨酸為一個活力單位，以U表示。步驟4)中可按照下述方法使所述中性蛋白酶和複合蛋白酶滅活:將酶解液2升溫至90 95°C，保持10 20min。步驟4)中所述離心的條件為4000 4500rpm離心20 30min。上述方法還包括對步驟4)得到的花生肽的溶液進行乾燥的步驟。所述乾燥可採用冷凍乾燥或噴霧乾燥。本發明提供了一種方法簡單、條件溫和、製備時間短、花生肽製備成本低，花生肽得率高且純度高的花生肽的製備方法。所得花生肽的分子量集中分布於IOOODa以下；最終水解度達到38.23 %，短肽得率達到88.52 %，其中分子量小於IOOODa佔98.88 %，並具有較強的ACE抑制活性，其IC5tl 值為0.842mg/ml。


圖1為本發明中測得的中性蛋白酶加酶量與水解關係曲線圖。圖2為本發明中測得的復配酶種類與水解關係曲線圖。圖3為本發明中測得的複合蛋白酶加酶量與水解關係曲線圖。圖4為本發明中測得的酶解溫度與水解關係曲線圖。圖5為本發明中測得的酶解時間與水解關係曲線圖。圖6為本發明中測得的短肽分子量分布的GPC圖譜。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明的方法進行說明，但本發明並不局限於此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。下述實施例中所採用的中性蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司，商品目錄號:Z8030，酶活為6.0OX 104U/g;所採用的複合蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司，商品目錄號:C8800，酶活為1.20X 105U/g;所採用的木瓜蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司，商品目錄號:G8430，酶活為5.00X 105U/g ;所採用的風味蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司，商品目錄號:F8250，酶活為2.00X 104U/g。下述實施例中所採用的花生分離蛋白粉，其蛋白含量為90%，脂肪含量為1%。
下述實施例中可溶性氮的測定:folin_酚法；短肽得率測定:三氯乙酸可溶性氮法=N1ZXX 100% ；式中，TCA-NS1-三氯乙酸可溶性氮得率，％ ;N「在10% TCA中可溶性氮，mg ；N0原料中總氮，mg。水解度(DH)的測定:鄰苯二甲醛(OPA)法。花生肽分子量分布的測定:採用高效液相色譜(HPLC)對酶解物的分子量分布進行分析，條件為:色譜柱:TSKgel2000SWXL300mmX7.8mm ;流動相:45%乙睛+55 %水+0.1 %三氟乙酸；流速:0.5ml/min ;溫度:30°C ;檢測波長:220nm。ACE抑制活性的測定:採用高效液相色譜(HPLC)對酶解物的ACE抑制活性進行分析，條件為:實驗色譜柱SunfireTM-C18 (250mmX4.6mm),流動相乙腈-水-三氟乙酸,體積比 50: 50: 0.05，檢測波長 228nm，流速 0.4mL/min，柱溫 30°C，進樣量 20yL。實施例1、考察不同蛋白酶復配對水解度及短肽得率的影響第一步:取花生分離蛋白粉，加入蒸餾水，使之溶解後，得到質量濃度8%的花生分離蛋白溶液；將其加入80°C恆溫水浴中保持lOmin，使花生分離蛋白高度壓縮、緊密的結構鬆散開，暴露出分子內部的酶作用位點，以利於蛋白酶的結合；第二步:第一步完成後取出花生分離蛋白溶液，恢復溫度到中性蛋白酶適合溫度(450C )後加入中性蛋白酶(5200U/g底物)，在45°C的恆溫水浴振蕩器中反應120min ；第三步:第二步反應結束後，加入複合蛋白酶(432U/g底物)混合均勻，繼續在45 C的恆溫水浴振湯器中反應120min ；第四步:第三步反應結束後取出，放入90°C恆溫水浴中保持lOmin，使中性蛋白酶失活，4500轉離心20min後噴霧乾燥得到花生肽。第五步:採用高效液相色譜(HPLC)對第四步所得花生肽的分子量分布進行分析，測得的短肽分子量分布如圖6所不，分子量小於IOOODa佔98.88%。第六步:採用高效液相色譜(HPLC)對酶解物的ACE抑制活性進行分析，ACE抑制活性的 IC5tl 值為 0.842mg/ml。採用上述方法製備花生肽，最終水解度達到38.23%，短肽得率達到88.52% (以蛋白含量計)，分子量小於IOOODa佔98.88%, ACE抑制活性的IC50值為0.842mg/ml。上述第二步中不同中性蛋白酶的用量所對應的花生分離蛋白的水解度和短肽得率的結果，見圖1。由圖1中可以看出:酶用量在2600 3900U/g濃度範圍內，酶解液的DH和TCA-NSI上升緩慢，當酶用量在3900 6500U/g濃度範圍內時，酶解液的DH和TCA-NSI隨酶用量的升高上升迅速，當酶用量達到5200U/g時，TCA-NSI達到43.93 ±0.40%，之後上升均趨於平緩，所以選擇中性蛋白酶加酶量為5200U/g底物。將上述第三步中的複合蛋白酶分別替換成木瓜蛋白酶(3000U/g底物)、風味蛋白酶(3000U/g底物)，考察不同蛋白酶與中性蛋白酶復配，水解花生分離蛋白的水解度和短肽得率。結果見圖2。由圖2中可以看出:在各種蛋白酶的推薦使用條件下(木瓜蛋白酶、風味蛋白酶的酶解條件為:溫度50°C，加酶量3000U/g底物，酶解時間120min)，複合蛋白酶與中性蛋白酶復配水解花生分離蛋白的水解度和短肽得率顯著高於其他兩種蛋白酶，所以選擇複合蛋白酶作 為中性蛋白酶的復配酶。實施例2、考察複合蛋白酶用量對水解度及短肽得率的影響
第一步:取花生分離蛋白粉，加入蒸餾水，使之溶解後，得到質量濃度8%的花生分離蛋白溶液；將其加入80°C恆溫水浴中保持lOmin，使花生分離蛋白高度壓縮、緊密的結構鬆散開，暴露出分子內部的酶作用位點，以利於蛋白酶的結合；第二步:第一步完成後取出花生分離蛋白溶液，恢復溫度到中性蛋白酶適合溫度(450C )後加入中性蛋白酶(5200U/g底物)，在45°C的恆溫水浴振蕩器中反應120min ；第三步:第二步反應結束後，加入不同量的複合蛋白酶(216U/g底物_8640U/g底物)混合均勻，繼續在45°C的恆溫水浴振蕩器中反應120min ；第四步:第三步反應結束後取出，放入90°C恆溫水浴中保持lOmin，使中性蛋白酶失活，4500轉離心20min後噴霧乾燥得到花生肽。不同複合蛋白酶的用量所對應的花生分離蛋白的水解度和短肽得率的結果，見圖
3。由圖3中可以看出:水解液中水解度和短肽得率呈先上升後下降的趨勢。隨著加酶量增大，酶的水解作用加強，反應後水解度和短肽得率上升，但當加酶量繼續增加，酶的抑制作用導致水解度和短肽得率均不同程度下降。所以選擇複合蛋白酶加酶量為216 648U/g底物，最優選432U/g底物。

實施例3、考察不同酶解溫度對水解度及短肽得率的影響第一步:取花生分離蛋白粉，加入蒸餾水，使之溶解後，得到質量濃度8%的花生分離蛋白溶液；將其加入80°C恆溫水浴中保持lOmin，使花生分離蛋白高度壓縮、緊密的結構鬆散開，暴露出分子內部的酶作用位點，以利於蛋白酶的結合；第二步:第一步完成後取出花生分離蛋白溶液，恢復溫度到中性蛋白酶適合溫度(450C )後加入中性蛋白酶(5200U/g底物)，在45°C的恆溫水浴振蕩器中反應120min ；第三步:第二步反應結束後，加入複合蛋白酶(432U/g底物)混合均勻，繼續在45 C的恆溫水浴振湯器中反應120min ；第四步:第三步反應結束後取出，放入90°C恆溫水浴中保持lOmin，使中性蛋白酶失活，4500轉離心20min後噴霧乾燥得到花生肽。不同酶解溫度所對應的花生分離蛋白的水解度和短肽得率的結果，見圖4。由圖4可以看出:酶的作用效果受到溫度影響較大。一般情況下，在酶的適用溫度範圍內，增加反應體系的溫度，則酶解的速度加快，酶解產物增多。如圖4所示，在35 45°C溫度範圍內，水解度和短肽得率隨著溫度升高而增加。45°C後水解度和短肽得率隨著溫度的升高逐漸降低。因此，選擇40 50°C作為酶解溫度，45°C作為酶解最佳溫度。實施例4、考察不同酶解時間對水解度及短肽得率的影響第一步:取花生分離蛋白粉，加入蒸餾水，使之溶解後，得到質量濃度8%的花生分離蛋白溶液；將其加入80°C恆溫水浴中保持lOmin，使花生分離蛋白高度壓縮、緊密的結構鬆散開，暴露出分子內部的酶作用位點，以利於蛋白酶的結合；第二步:第一步完成後取出花生分離蛋白溶液，恢復溫度到中性蛋白酶適合溫度後加入中性蛋白酶(5200U/g底物)，在45°C的恆溫水浴振蕩器中反應若干時間(1.0h\l.5h\2.0h\2.5h\)；第三步:第二步反應結束後，加入複合蛋白酶(432U/g底物)混合均勻，繼續在45°C的恆溫水浴振蕩器中反應若干時間(3.0h\2.5h\2.0h\l.5h\)；第四步:第三步反應結束後取出，放入90°C恆溫水浴中保持lOmin，使中性蛋白酶失活，4500轉離心20min後噴霧乾燥得到花生肽。不同酶解時間所對應的花生分離蛋白的水解度和短肽得率的結果，見圖5。由圖5可以看出:當加酶量、底物濃度和酶解溫度一定時,調整複合蛋白酶加入時間，酶解效果不同。由圖5可知，水解度在中性蛋白酶反應90min後加入複合蛋白酶繼續反應150min時達到最大，短肽得率在中性蛋白酶反應120min後再加入複合蛋白酶反應120min時達到最大值，而後上述兩指標均有不同程度下降，考慮短肽的得率因素，因此酶解最佳時間為中性蛋白酶反應120min後加入複合蛋白酶繼續反應120min。採用上述方法製備花生肽具有以下有益效果:製備方法簡單，製備條件溫和，製備時間短，花生肽製備成本低，花生肽得率高，純度高，分子量集中分布於IOOODa以下；最終水解度達到38.23%，短肽得率達到88.52%，分子量小於IOOODa佔98.99%, ACE(血管緊張素轉化酶)抑制活性的IC5tl值為0.842mg/ml。本文具體說明了本發明示例性實施實例和目前的優選實施方式，應當理解，本發明的構思可以按其他種種 形式實施運用，它們同樣落在本發明的保護範圍內。
權利要求
1.一種製備花生肽的方法，包括下述步驟: 1)將花生分離蛋白粉用水溶解，得到花生分離蛋白溶液，將所述花生分離蛋白溶液置於80 85°C水浴中保持10 15min ； 2)將步驟I)處理後的花生分離蛋白溶液取出，待溫度降至中性蛋白酶酶解適合的溫度後加入中性蛋白酶進行酶解，得到酶解液，記為酶解液I ; 3)向所述酶解液I中加入複合蛋白酶，繼續進行酶解，得到酶解液2; 4)使所述酶解液2中的中性蛋白酶和複合蛋白酶失活，離心取上清液，即得花生肽的溶液。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:步驟I)中所述花生分離蛋白粉中，蛋白含量不低於90%，脂肪含量不高於1%。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於:步驟I)中所述花生分離蛋白溶液中花生分離蛋白的質 量濃度為6 8%，優選質量濃度為8%。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其特徵在於:步驟2)中所述中性蛋白酶的加入量為5200 6500U/g蛋白，優選5200U/g蛋白；所述酶解條件為:酶解溫度40 50°C，酶解時間1.5 2.0h ;優選的酶解條件為:酶解溫度45°C，酶解時間120min。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其特徵在於:步驟3)中所述複合蛋白酶的加入量為216 648U/g蛋白，優選432U/g蛋白；所述酶解條件為:酶解溫度40 50°C，酶解時間2.0 2.5h ;優選的酶解條件為:酶解溫度45°C，酶解時間120min。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其特徵在於:步驟4)中使所述中性蛋白酶和複合蛋白酶滅活的方法如下:將所述酶解液2升溫至90 95°C,保持10 20min ； 步驟4)中所述離心的條件為4000 4500rpm離心20 30min。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其特徵在於:所述方法還包括對步驟4)得到的花生肽的溶液進行乾燥的步驟；所述乾燥的方式為冷凍乾燥或噴霧乾燥。
8.權利要求1-7中任一所述的方法製備得到的花生肽。
9.根據權利要求8所述的花生肽，其特徵在於:所述花生肽中分子量小於IOOODa的肽的含量彡98.88%。
全文摘要
本發明公開了一種雙中性蛋白酶酶解花生分離蛋白製備花生肽的方法。該方法包括下述步驟1)將花生分離蛋白粉用水溶解，得到花生分離蛋白溶液，將花生分離蛋白溶液置於80～85℃水浴中保持10～15min；2)將步驟1)處理後的花生分離蛋白溶液取出，待溫度降至中性蛋白酶酶解適合的溫度後加入中性蛋白酶進行酶解，得到酶解液，記為酶解液1；3)向酶解液1中加入複合蛋白酶，繼續進行酶解，得到酶解液2；4)使酶解液2中的中性蛋白酶和複合蛋白酶失活，離心取上清液，噴霧乾燥得到花生肽。本發明的方法具有花生肽得率高，純度高，分子量集中分布於1000Da以下，具有較強的ACE抑制活性，且具有製備成本低，製備時間短，製備方法簡單、製備條件溫和等優點。
文檔編號A23J3/34GK103222537SQ20131016700
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月8日 優先權日2013年5月8日
發明者王強, 劉芳友, 劉紅芝, 張文鐠, 劉麗, 李寧, 胡暉 申請人:中國農業科學院農產品加工研究所, 華隆(乳山)食品工業有限公司