附睪特異的抗菌肽Bin1b在精子成熟方面的用途的製作方法

2023-05-14 16:17:01

專利名稱：附睪特異的抗菌肽Bin1b在精子成熟方面的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及附睪特異的抗菌肽Bin1b(一種β防衛素)在精子成熟方面的用途。
背景技術：
附睪作為一個男性附屬生殖器官，多年以來被證明與精子的成熟有關.但從來未將這成熟過程和附睪來源的某個特定分子相聯繫1。
哺乳動物的精子是在睪丸中生成的，但它們離開睪丸的時候既不能遊動又不能使卵子受精。它們在通過和睪丸相連的附睪時逐步成熟並獲得向前運動和受精的能力1，3。附睪的分泌液，由附睪的各個特定區域生成——分別叫做caput(頭)，corpus(體)，cauda(尾)，對精子的成熟至關重要；然後對這個成熟過程的分子機制所知甚少。在不同種屬發現的大約200個已知附睪蛋白中，很少有被證明直接參與附睪中精子的成熟的4，5。
Bin1b是一個大鼠附睪特異的抗菌肽2，在人類中也發現了它的同源物6。張永蓮和陳小章等證明了Bin1b有類似於beta-defensin的分子結構和抗菌活性2。
此外，WO02/68463和中國專利申請CN 01105283.X中還公開了附睪特異的抗菌肽Bin1b的DNA和胺基酸序列、製備方法和作為抗菌肽的用途。其實驗表明，Bin1b是一個大鼠附睪特異的beta-defensin，有抗菌活性。但沒有發現或公開過Bin1b與精子成熟的相關性。
鑑於精子成熟對於男性不育和生育力低下等疾病存在極其密切的聯繫，因此本領域迫切需要尋找和開發與精子成熟有關的物質。

發明內容
本發明的目的就是提供一種與精子成熟有關的多肽β-防衛素(beta-defensin)。
本發明的另一目的是提供β-防衛素等在促進精子成熟等方面的用途。
在本發明的第一方面，提供了一種β-防衛素的用途，它被用於製備促進精子成熟的藥物。
在本發明的第二方面，提供了一種β-防衛素的用途，它被用於製備提高精子運動性的藥物。
在本發明的第三方面，提供了一種β-防衛素的用途，它被用於製備提高精子前向運動百分比的藥物。
在本發明的第四方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的β-防衛素和鈣離子源以及藥學上可接受的載體，其中所述的鈣離子源是鈣離子或能夠產生鈣離子的物質。
在本發明第五方面，提供了一種體外促進精子成熟的方法，包括步驟(a)在精子細胞的培養液中添加β-防衛素；(b)繼續培養精子細胞，從而獲得成熟的精子。
在另一優選例中，所述的β-防衛素是附睪特異的β-防衛素。更佳地，所述的β-防衛素是Bin1b。
在本發明的第六方面，提供了β-防衛素拮抗劑(如抗體、反義核酸等)的用途，它們可用於抑制精子的成熟化。


圖1顯示了免疫螢光試驗結果，表明Bin1b結合到大鼠附睪不同區段來源的精子。抗Bin1b的兔源多抗血清由重組Bin1b蛋白製備。抗體的專一性通過WESTERN BLOT檢查。
其中圖a抗體(1∶1000)和Bin1b抗原雜交，以及兩個陽性對照，DHFR-Bin1b融合蛋白(26KD)，和TrxA-Bin1b融合蛋白22KD，以及陰性對照，DHFR蛋白。
圖b免疫染色顯示Bin1b結合到大鼠附睪不同區段的來源的精子。其中ini＝起始區(initial segment)；cap＝頭部(caput)；cor＝體部(corpus)；cau＝尾部(cauda)。
圖c流式細胞儀分析結合到不同區段精子上的Bin1b的百分比。
圖2顯示了表達Bin1b的上皮細胞對精子動性的影響以及共孵育後Bin1b的結合。
其中，圖a和b與附睪頭部上皮細胞共孵育誘導的精子運動性(a)，前向運動百分比(b)經Bin1b(1∶800)抗體處理後顯著減弱。實心方框 與頭部細胞共育；實心三角，與尾部細胞共育；實心下三角，與Bin1b抗體處理的頭部細胞共育；菱形，與免疫前血清處理的頭部細胞共育；空心方框，EMEM培養基中孵育；實心菱形，精子基質中孵育。
圖cRT-PCR顯示Bin1b在轉染的T84細胞Bin-T84中表達而不在載體轉染的T84細胞Vet-T84中表達。
圖d和e與Bin-T84共育誘導的精子運動性(d)和前向運動性(e)被抗Bin1b的抗體(1∶800)極大的減弱。實心方框，與Bin-T84共育；實心三角，精子與Vet-T84共育；空心倒三角，與Bin1b抗體處理的Bin-T84共育；空心菱形，與免疫前血清處理的Bin-T84共育；均值(mean)±SEM(N＝4-6，ONEWAY ANOVA分析法)，p＜0.0001，與對照比較。
圖f與Bin-T84培養前(1)後(2)的以及與和Vet-T84共育(3)的未成熟精子上的Bin1b的免疫染色，陰性對照用免疫前血清(4)。
圖g與Bin-T84共育前(1)後(2)的未成熟精子上的Bin1b結合百分比。
圖h與Bin-T84培養前(1)後(2)的基質共育的尾部成熟精子Bin1b結合百分比。
圖3顯示了Bin1b在未成熟和成熟精子鈣離子吸收中的不同效應。
其中，圖a和b細胞外的鈣離子對頭部的(a)和Bin-T84共育誘導的(b)未成熟精子運動性的效應。箭頭所指為2mM Ca2+加入到無鈣的基質中，實心方框，無鈣離子；實心三角，無鈣離子，後加鈣離子；圖c不同稀釋度的Bin-T84誘導了未成熟精子細胞內鈣的增加，100％紅，50％藍，(可以被Bin1b抗體阻斷，黑100％和粉紅50％)，而Vet-T84沒有該誘導效應，綠。(注從上至下，各曲線的顏色分別是紅、藍、黑、綠和粉紅)圖d對應於c的細胞內鈣測量，L型鈣通道阻斷劑nifedipine0.5UM，verapamil 1UM和T型鈣通道阻斷劑pimozide 1um。圖中，control＝對照，antibody＝抗體。
圖eBin-T84共育誘導的未成熟精子運動性(9小時)被nifedipineverapamil抑制，而不被pimozide抑制。
圖f成熟尾部精子細胞內鈣測量表明對Bin-T84和Vet-T84沒有反應。
圖g尾部精子運動對3小時共育的Bin1b抗體和nifedipine的敏感性，均值±SEM(n＝3-6；不成對t-測試)，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.0001對應於相應對照組。
圖4顯示了Bin1b反義RNA引起體內Bin1b表達抑制，以及精子運動性和前向運動的顯著減弱。
圖a反義Bin1b RNA處理48小時後，半定量RT-PCR表明附睪頭部Bin1bMrna表達減少，GAPDH作為內標。
圖b-gBin1b免疫螢光，精子來自遠端頭部，以正義核酸處理，作為對照(b)，反義核酸處理(c)，對應於流式細胞儀測得的正義核酸(d)，反義核酸(e)處理的樣品。精子運動結果的分布(f)以及前向運動的百分數(g)。均值±SEM(n＝5-15；不成對t-測試)。P＜0.05，P＜0.01，P＜0.0001。
具體實施例方式
本發明經過廣泛而深入的研究發現，附睪特異性β-防衛素Bin1b在附睪的不同區域能夠以不同的方式和精子頭部結合，而且附睪來源或轉染了Bin1b的細胞株，能夠誘導本來不具有運動能力的未成熟精子向前運動。這一效應是由Bin1b誘導的Ca2+的吸收介導的(這一機制在維持未成熟精子的運動能力中起重要作用，但在維持成熟精子的運動能力中不起重要作用)。體內的反義核酸實驗表明通過抑制Bin1b的表達來減少Bin1b和附睪頭部的精子結合，會導致精子活性和向前運動的能力大大下降，進一步肯定了beta-defensin參與了精子運動能力的獲得和起始了精子的成熟。
如本文所用，術語「β-防衛素」指β-防衛素家族的蛋白，特別優選的是在附睪特異性表達或存在的β-防衛素。代表性的例子包括(但並不限於)Bin1b，來自大鼠；BNBD9(AAB25872)，BNBD3(AAB25866)，BNBD7(AAB25870)，TAP(P25068)，LAP(Q28880)，EBD(O02775)來自牛；HBD1(Q09753)，HBD2(O15263)，HBD3(NP061131)來自人；EP2E(AF263555_1)CBD1(AF188607_1)，CBD2(AF209855_1)來自黑猩猩；MBD1(AAB72003)，MBD2(CAB42815)，MBD3(AF092929_1)，MBD4(AF155882_1)來自小鼠；RBD1(AAC28071)，RBD2(AAC28072)來自大鼠；GBD1(CAA76811)，GBD2(CAA08905)來自山羊；SBD1(O19038)，SBD2(O19039)來自綿羊；PBD1(O62697)來自豬。這些物質的核酸序列和胺基酸序列都是已知的，可以用本領域常規的DNA重組技術而獲得其蛋白。
另一類特別優選的蛋白是Bin1b類似物，即在其他哺乳動物(如牛、羊、兔、狗、猴、人等)中Bin1b的同源蛋白。這些其他物種的同源蛋白的編碼序列，可根據WO02/68463公開的序列，通過雜交或擴增的方法而獲得，進而通過常規重組方法獲得這些同源蛋白。
在本發明中，術語「Bin1b多肽」指具有Bin1b蛋白活性的，WO02/68463中SEQ ID NO.2或3序列的多肽。該術語還包括具有與Bin1b蛋白相同功能的、SEQID NO.2或3序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-20個，較佳地1-10個，更佳地1-5個，最佳地1-3個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括Bin1b蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與Bin1b DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗Bin1b多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含Bin1b多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了Bin1b多肽的可溶性片段。通常，該片段具有Bin1b多肽序列的至少約15個連續胺基酸，通常至少約25個連續胺基酸，更佳地至少約35個連續胺基酸，最佳地至少約40個連續胺基酸。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的β-防衛素和鈣離子源(如0.1μm-100mM Ca2+)以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊、藥膏宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的β-防衛素施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
本發明還涉及β-防衛素拮抗劑(如抗體、反義核酸等)的用途，它們可用於抑制精子的成熟化。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1Bin1b抗體製備以及在附睪來源精子上的免疫定位用WO02/68463實施例所述的方法，獲得對應於成熟Bin1b基因45個胺基酸殘基135bp鹼基的cDNA，如下所示135bp鹼基的cDNAGGAATCAGAAACACCGTGTGCTTCATGCAGCGGGGCCACTGTAGGCTCTTCATGTGCCGTTCTGGGGAGAGAAAGGGGGATATTTGCTCTGACCCCTGGAACAGATGCTGCGTATCCAGTTCCATTAAAAACAGATGA(SEQ ID NO1)45個胺基酸殘基GIRNTVCFMQRGHCRLFMCRSGERKGDICSDPWNRCCVSSSIKNR(SEQ ID NO2)將145bp片段插入PET-28a克隆載體(購自Invitrogen公司)。用Novagen pET表達試劑盒(試劑盒購自Invitrogen公司)表達並純化重組蛋白。針對該重組蛋白的抗體的製備按照參考文獻Hu，Y.X.et al.Get effective polyclonalantisera in one month.Cell Res.12，157-160(2002).中所述的方法。
精子的Bin1b基因免疫定位，附睪被分為起始區以及頭體尾總共四部分，精子分別從這四部分洗出，用4％的多聚甲醛作用30分鐘固定精子，免疫染色方法參考文獻Welch，J.E.et al.Human glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase-2 gene is expressed specifically in spermatogenic cells.J.Androl 21，328-338(2000)。Bin1b的多克隆抗體的稀釋度為1∶600。用螢光顯微鏡(OlypusBM50型)進行圖片採集。
結果如圖1所示。圖1a抗體的特異性由western雜交得到證明。1b來源於附睪所有區域——除了起始區的精子都有Bin1b的免疫反應性。1c與Bin1b抗體結合的精子，在不同的區域有差異。
實施例2Bin1b基因真核轉染Bin1b基因克隆於pCMV-tag表達載體。T84細胞以1×105細胞密度傳於35mm培養皿，當細胞生長鋪滿60-80％，使用脂質體lipofectin轉染試劑轉染。轉染後細胞在選擇性抗生素G418(濃度400ug/ml)篩選，操作過程按參考文獻Jiang，J.L.et al.The involvement of HAb18G/CD147 in regulation ofstoreoperated calcium entry and metastasis of human hepatoma cells.J.Biol.Chem.276，46870-46877(2001)中所述的方法進行。
實施例3Bin1b對精子成熟的促進作用一、實驗方法精子-上皮細胞共培養從成年的SD大鼠(3月齡)收集不成熟的附睪頭部精子。近端附睪頭被溫和地剪碎放入0.4ml經溫育的精子培養液(123mM氯化鈉，4mM氯化鉀，2mM氯化鈣，0.4mM硫酸鎂，0.3mM磷酸氫二鈉，25mM碳酸氫鈉，5mM葡萄糖，12.5mM乳酸鈉，0.5mM丙酮酸，8ug酚紅，4mg/ml牛血清白蛋白，最終pH值為7.4，粘度為310mOsm/kg.)5分鐘使精子擴散到培養基裡。精子濃度調整為6000萬/毫升。分離和培養附睪上皮細胞的方法如前所述。在上皮細胞長滿後(培養後四天)，在進行共培養細胞實驗兩小時前，將培養的上層培養液去掉。3微升的精子(6000萬/毫升)加入培養上層，37度，5％二氧化碳的條件下，培養不同時間，取出10微升精子進行精子運動力測試。
精子運動力測試測試時用HTM-IVOS系統(版本10.8，Hamiltion-Thorn Research公司，Beverly，MA)。設定參數如下4倍物鏡，最低細胞大小為6象素，最低對照值為65，最低靜止對照值為30，最低VAP基值為30.0，最低VSL基值為20.0，直線參數50％，靜止頭部大小為0.29-10，靜止頭部深度為0.29-1.11，放大值為0.82。六個視野以每視野60Hz的頻率進行分析。每個樣品至少200個精子運動軌跡在37度分析，每個運動軌跡記錄30個點。系統的回放功能被用來檢查分析的精度。
附睪頭部精子的細胞內鈣離子濃度的測定精子置於2uM Fura-2/AM在37度5％二氧化碳培養45分鐘，洗滌兩遍，懸浮於精子培養液。Fura-2處理的精子重懸於不同稀釋度的Bin-T84細胞培養液。Vet-T84細胞培養液被用做對照。340納米和380納米的激發螢光輪流用LS-50B螢光光譜儀(Perkin Elmer公司，Shelton，CN)記錄並根據Grynkiewicz等人(1985)30(Grynkiewicz，G.，Poenie，M.Tsien，R.Y.A new generationof Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.J BiolChem.260，3440-50(1985).)的方法以340/380的比例進行計算。
流式細胞分析大鼠精子用Bin1b多克隆抗體以1∶200比例進行染色，以免疫前血清作為對照。4度培養過夜後精子用含有4mg/ml的牛血清白蛋白的PBS洗滌兩遍，以1∶50加二抗-羊抗兔FITC標記的IgG(Zymed實驗室，South San Francisco，CA)室溫保溫45分鐘。洗滌三遍後，精子用流式細胞儀分析(Beckman Coulter，Krefeld，Germany)。每份樣品10000個獨立精子用FITC發出的螢光分析。以正常兔血清染色作為負對照以此作為特異精子Bin1b染色的本底。減去背景螢光就得到特異性精子染色的百分率。
體內反義寡核苷酸處理在麻醉條件下切開雄性SD大鼠(＞3月齡)的睪丸表面的皮膚。30微升的Bin1b反義寡核苷酸(20ug/ml)(5』-AGAGTAACAAAACCTTCTAG-3』)或正義對照(5』-CATGAAGGTTTTGTTACTCT-3』)被注射入附睪頭部中間邊側，注射後48小時收集精子分析。
二、結果結果如圖2-4以及表1所示。
圖2a原本不運動的精子與附睪頭部上皮細胞，而不是體部和尾部的細胞，共同培養後3小時開始運動，運動在5小時達到平臺並能保持到9小時。
圖2b在附睪頭部細胞存在時，精子在3小時獲得緩慢的前向運動能力，這運動能力逐漸增強並保持到9小時，而其它的處理未觀察到前向運動的明顯變化。
圖2cBin1b的表達通過RT-PCR得到了確認。
圖2d-e而利用Vet-T84細胞或Bin1b抗體存在時，則無明顯增加。
圖2h起初不含Bin1b的未成熟精子，與Bin-T84培養液(本發明人假定它含有分泌的Bin1b)溫育1小時以後80％有Bin1b的陽性免疫反應。
圖3a-b當在共培養實驗中使用不含鈣離子的培養液時，利用附睪頭部細胞或Bin-T84細胞，溫育時間長達9小時，都未見到精子運動性或前向運動能力的提高。
圖3c-d將未成熟的精子與含Bin1b的培養液，而不是對照的Vet-T84培養液溫育，導致濃度依賴的鈣離子吸收的增強，這效應能夠被Bin1b的抗體或鈣離子通道的抑制劑，nifedipine(0.5uM)和verapamil(1uM)(已知是抑制L型鈣通道)強烈抑制。而T型鈣通道的抑制劑pimozide(1uM)則無此作用。
圖3enifedipine和verapamil明顯減弱了Bin1b誘導的精子運動；而T型鈣通道的特異抑制劑，pimozide則不那麼有效。
圖3g含Bin1b的培養液對附睪尾部成熟精子鈣離子吸收的影響，在整個溫育過程中未發現鈣離子吸收的明顯增強。從附睪尾部收集的精子具有旺盛的活力，其活力只有大約20％被Bin1b抗體抑制.nifedipine在0.5uM的濃度時能在未成熟的精子中強烈抑制Bin1b誘導的精子運動，對附睪尾部精子的運動能力沒有作用，至少還不如Bin1b抗體。
圖4b-c其結果是導致了附睪頭部遠端(distal)區域Bin1b對精子結合的明顯下降.免疫螢光。
4d-e其結果是導致了附睪頭部遠端區域Bin1b對精子結合的明顯下降.流式細胞計數。
4f-g與Bin1b表達和精子結合的下降相符合，從Bin1b反義核酸處理過的大鼠附睪頭部遠端區域取出的精子與來自正義核酸處理的對照大鼠的精子相比，其活力和前向運動的能力明顯下降了。
表1未成熟大鼠精子與附睪頭/尾上皮細胞共育後的運動參數比較。

注數據由CASA系統得到。VAP＝平均路徑速度，VSL＝直線速度討論Bin1b的表達具有區域特異性，只存在於頭部中間，而在其它區域都不存在，使得本發明人推測它除了作為一個抗菌肽，可能在精子成熟過程中起到作用，因為有證據表明附睪頭部的微環境對精子獲得向前運動的能力有重要作用7，8。Bin1b的信號肽序列表明它是一個分泌蛋白，它可能直接和精子結合影響它的運動。本發明人用Bin1b的抗體進行免疫組化來驗證這個假設，抗體的特異性由western雜交得到證明(圖1a)。來源於附睪所有區域¨D¨D除了起始區(initial segment)(圖1b)的精子都有Bin1b的免疫反應性，與Bin1b抗體結合的精子，在不同的區域有差異(圖1c)。精子結合的方式也因區域而異，附睪頭部的精子整個精子頭部都有免疫反應，而附睪尾部的精子主要的信號集中在頂體後(post-acrosome)區域。Bin1b因區域而變的精子結合方式表明它在精子通過附睪時，可能修飾了精子的特定功能。
本發明人用體外培養的附睪上皮細胞來研究Bin1b對精子成熟的可能作用，這種細胞過去曾用來證明Bin1b的抗菌活性2。對表達Bin1b的附睪頭部細胞和作為對照的尾部細胞進行了培養，讓它們在一個流動的過濾裝置上長滿，以保證形成上皮的極性和正常的附睪分泌。將從附睪initial segment搜集的未成熟的精子加在附睪培養物的頂上部分並溫育不同的時間。精子運動的動力學，是精子成熟最顯著的變化9，通過計算機輔助的精子分析(CASA)來檢測。首先進入精子培養液的未成熟精子不具有向前運動的能力，在幾分鐘內就停止了擺動，這與過去的觀察相符10。然而，原本不運動的精子與附睪頭部上皮細胞，而不是體部和尾部的細胞，共同培養後3小時開始運動，運動在5小時達到平臺並能保持到9小時(圖2a).精子運動參數的分析表明，與附睪頭部細胞共培養的精子，其平均通道速率averaged-path(VAP)和直線速率straight-linevelocities(VSL)與和附睪尾部細胞共培養的精子相比有顯著提高.(表1)然而，當精子和精子培養液或來自上皮細胞的新鮮培養液共培養時，基本未觀察到精子運動。由於精子的前向運動是與精子成熟相關的特徵之一9，前向運動的百分數也被用來衡量Bin1b的效果。就象圖2b所顯示的，在附睪頭部細胞存在時，精子在3小時獲得緩慢的前向運動能力，這運動能力逐漸增強並保持到9小時，而其它的處理未觀察到前向運動的明顯變化。這表明通過與附睪頭部上皮細胞的體外共培養，非運動的未成熟精子能被誘導獲得和保持前向運動性。為了弄清精子運動能力的提高和獲得前向運動的能力是否因於Bin1b的作用，本發明人使用了Bin1b的抗體，結果表明Bin1b的抗體逆轉了附睪上皮細胞誘導的精子運動能力增強和獲得前向運動的能力，而使用免疫前血清這些參數則無變化(圖2a，b)。這些結果表明Bin1b可能在誘導未成熟精子的運動能力方面起作用。
為了確認Bin1b的作用並排除附睪頭部上皮細胞分泌的其它因子的參與，Bin1b cDNA被轉染到一個小腸上皮細胞株，T84，它本身不表達Bin1b。從而得到穩定表達Bin1b的細胞株(Bin-T84)，和一個只轉染了載體的對照細胞株(Vet-T84)，Bin1b的表達通過RT-PCR得到了確認(圖2c)。用同樣不具有運動能力的未成熟精子進行了精子共培養試驗。如圖2d-e所示，與Bin-T84共培養的精子，隨時間的增長，精子運動性和前向運動的百分數也在增加，這與和附睪頭部上皮細胞共培養的精子相似(圖2a-b)，而利用Vet-T84細胞或Bin1b抗體存在時(Fig2d-e)則無明顯增加。起初不含Bin1b的未成熟精子，與Bin-T84培養液(本發明人假定它含有分泌的Bin1b)(圖2h)溫育1小時以後80％有Bin1b的陽性免疫反應。然而，對於原本就有Bin1b著色的來自附睪尾部的成熟精子，未發現Bin1b免疫反應的顯著增強。總之，從附睪頭部細胞或Bin-T84細胞共培養實驗得到的結果，肯定了本發明人的假設，Bin1b參與了精子的成熟過程——未成熟的精子開始獲得前向運動的能力，這也是來自附睪頭部起始區精子的一個典型變化9。Bin1b參與起始精子的成熟可以用來解釋為何這個beta-防衛素只在頭部中間區域表達。
Bin1b是怎樣起作用的？防衛素(defensin)是帶正電荷(極性)的分子，具有空間上分割的疏水和帶點區域，這能使它們能夠插入磷脂膜，在生物膜上形成孔/通道。這是防衛素的抗菌能力作用機制之一11。也有證據表明防衛素能通過激活L型鈣通道調節膜的離子通道12，13。因此，Bin1b可能通過形成鈣通透的通道，或激活精子上的鈣通道，而使精子能夠積累鈣離子，而鈣離子是眾所周知對精子功能——包括精子運動性，精子獲能和頂體反應起重要作用的14，15。有報導精子在通過附睪時，其儲存鈣離子的能力有明顯的變化16，附睪頭部精子的鈣濃度比尾部的精子高兩倍17。也有證據表明附睪頭部精子從外部介質儲存鈣離子的能力比附睪尾部的精子強2-4倍18。而且，鈣離子依賴的機制也被包含在附睪頭部的精子在精子成熟中從無規運動到前向運動的轉變過程中19，20；然而，精子成熟過程中鈣離子轉運穿過精子膜的機制還不清楚。
因而，本發明人假設Bin1b形成了離子通道或Bin1b激活了鈣通道，提供了鈣離子流的通路，這是誘導精子運動所必需的。為了驗證這個假設，本發明人首先檢驗了Bin1b對精子運動作用的鈣離子依賴性。當在共培養實驗中使用不含鈣離子的培養液時，利用附睪頭部細胞或Bin-T84細胞，溫育時間長達9小時，都未見到精子運動性或前向運動能力的提高(圖3a-b)。然而，當在3小時將鈣離子加回培養液時，在加入鈣離子兩個小時之後，觀察到精子運動能力的增強並得到了向前運動的能力，表明Bin1b對精子運動的作用依賴於細胞外的鈣離子。這些結果表明Bin1b可能能夠調節精子鈣的吸收。入圖3c-d所示，將未成熟的精子與含Bin1b的培養液，而不是對照的Vet-T84培養液溫育，導致濃度依賴的鈣離子吸收的增強，這效應能夠被Bin1b的抗體或鈣離子通道的抑制劑，nifedipine(0.5uM)和verapamil(1uM)(已知是抑制L型鈣通道)強烈抑制。而T型鈣通道的抑制劑pimozide(1uM)則無此作用。同樣的，nifedipine和verapamil明顯減弱了Bin1b誘導的精子運動；而T型鈣通道的特異抑制劑，pimozide則不那麼有效(圖3e)。Bin1b誘導精子運動對胞外鈣離子的依賴性，含Bin1b培養液誘導精子吸收鈣離子的能力，以及Bin1b的作用被鈣離子通道抑制劑抑制表明Bin1b可能激活了精子的鈣離子通道，導致鈣離子內流，這是未成熟精子獲得運動能力所必需的。
Bin1b對附睪不同區域精子結合方式的有改變，也就是，相比附睪頭部的精子Bin1b在精子頭部廣泛分布，附睪尾部的精子Bin1b更加集中在後頂體區域。這使本發明人提出第二個問題Bin1b對附睪尾部的成熟精子的運動能力的維持有作用嗎？本發明人檢驗了含Bin1b的培養液對附睪尾部成熟精子鈣離子吸收的影響，在整個溫育過程中未發現鈣離子吸收的明顯增強。從附睪尾部收集的精子具有旺盛的活力，其活力只有大約20％被Bin1b抗體抑制(圖3g)，與此相反在刺激過的未成熟精子中有大於90％的被抑制了(圖2a，d)。有趣的是，nifedipine在0.5uM的濃度時能在未成熟的精子中強烈抑制Bin1b誘導的精子運動，對附睪尾部精子的運動能力沒有作用，至少還不如Bin1b抗體(圖3g)。這些結果說明了兩點1與誘導未成熟精子運動的關鍵作用不同，Bin1b在維持成熟精子的運動中起到相對次要的作用；2.Bin1b對附睪尾部精子的作用可能與包含鈣離子通道的對附睪頭部精子的作用不同。總之，在精子成熟過程中，可能產生了不同於Bin1b的機制來維持成熟精子的運動能力。
為了在生理狀態下確認Bin1b對精子運動的作用，本發明人利用針對Bin1b的反義寡聚核酸來降低Bin1b在體內的表達，並檢驗了它對精子活力和前向運動能力的作用。與正義的對照相比，Bin1b的反義核酸(20ug/ml)在附睪頭部明顯降低了Bin1bmRNA的水平，這由半定量RT-PCR來驗證了，其結果是導致了附睪頭部遠端區域Bin1b對精子結合的明顯下降，這由免疫螢光(圖4b-c)加上流式細胞計數(圖d-e)表明了。與Bin1b表達和精子結合的下降相符合，從Bin1b反義核酸處理過的大鼠附睪頭部遠端區域取出的精子與來自正義核酸處理的對照大鼠的精子相比，其活力和前向運動的能力明顯下降了(圖4f，g)。總之，體外和體內實驗證明Bin1b對精子獲得運動能力並起始精子成熟起重要作用。
目前的發現與長期以來公認的鈣離子在精子運動中的作用是吻合的，並為與精子獲得運動能力相關的精子鈣離子吸收的調節機制提供了新的認識。Bin1b結合到精子上活化了鈣離子通道，使得鈣離子被吸收而起始未成熟精子的運動。精子對鈣離子的吸收被認為是與附睪中精子成熟相伴的變化之一，而目前的發現與過去觀察到的附睪頭部精子與尾部精子相比，鈣離子累積的速度18和鈣離子濃度17都要高的多相吻合。Bin1b對未成熟和成熟精子作用的差異可能是由於Bin1b對精子結合方式的不同，這可能反映了對精子膜的修飾，這是一個眾所周知的與精子成熟相關的過程21。總之，Bin1b的功能是參與了未成熟精子獲得運動能力所必須的鈣離子吸收，而相對次要的是維持成熟精子的運動能力。
最新的發現表明附睪特異抗菌肽Bin1b，不僅僅具有抗菌活力2，而且也參與附睪內精子成熟過程。Bin1b在不同的條件下發揮不同的功能的推測還需要進一步研究，比如因為抗菌肽的起始功能所需要的細胞間靜電相互作用取決於流體環境中離子強度11，因此在附睪內不同區域液體的不斷改變，以及細菌感染後的環境都可能導致Bin1b基因不同的功能。雖然Bin1b功能的具體機制有待闡明，Bin1b的兩種功能證明了抗菌肽在附睪中的重要性。他人的最新研究也發現一些在人和小鼠附睪區域特異表達的抗菌肽，強有力的支持了它們可能參與附睪調控和先天免疫過程22，23。值得注意的是最初從精液中獲得的一種抗菌肽caltrin，也顯示了對精子獲能和受精的作用24。因此，對抗菌肽的進一步研究，可能有助於本發明人理解精子成熟過程和它的調控。包括Bin1b在內的抗菌肽，可能具有不僅對性傳播疾病的治療的期望11，25，而且也提供了男性不育與男性避孕的研究方向。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
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權利要求
1.一種β-防衛素的用途，其特徵在於，用於製備促進精子成熟的藥物。
2.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的β-防衛素是附睪特異的β-防衛素。
3.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的β-防衛素是Bin1b。
4.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的藥物還含有鈣離子。
5.一種β-防衛素的用途，其特徵在於，用於製備提高精子運動性的藥物。
6.一種β-防衛素的用途，其特徵在於，用於製備提高精子前向運動百分比的藥物。
7.一種藥物組合物，其特徵在於，它含有安全有效量的β-防衛素和鈣離子源以及藥學上可接受的載體，其中所述的鈣離子源是鈣離子或能夠產生鈣離子的物質。
8.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的β-防衛素是附睪特異的β-防衛素。
9.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的β-防衛素是Bin1b。
10.一種體外促進精子成熟的方法，其特徵在於，包括步驟(a)在精子細胞的培養液中添加β-防衛素；(b)繼續培養精子細胞，從而獲得成熟的精子。
全文摘要
本發明公開了附睪特異性的β－防衛素的用途，它們被用於製備促進精子成熟的藥物。優選的β－防衛素是Bin1b。還提供了一種促進精子成熟的組合物，它含有安全有效量的β－防衛素和鈣離子源以及藥學上可接受的載體。
文檔編號A61K38/17GK1689640SQ20041001810
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月30日 優先權日2004年4月30日
發明者陳小章, 張永蓮, 周晨曦, 蕭蒞勍, 鄭敏, 曾麗玲, 黃巧茵, 何樂思, 鍾耀華 申請人:中國科學院上海生命科學研究院