重組pac1受體激動劑rmmax及其表達方法與應用的製作方法

2023-05-14 21:08:41

專利名稱：：重組pac1受體激動劑rmmax及其表達方法與應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及基因工程領域，具體的說，涉及重組PAC1受體激動劑RMMAX及其表達方法與應用。
背景技術：
：PAC1受體是垂體腺苷酸環化酶激活多肽(pituitaryadenylatecyclaseactivatingpolypeptide,PACAP)的特定受體，參與介導PACAP的多種生物學功能。PACAP是1989年發現的，由腦垂體分泌的或目的組織自分泌和旁分泌的具有重要生物學功能的神經多肽，屬於是促胰液素/高血糖素/VIP家族中的新成員。PACAP的具有3個受體PAC1是PACAP的特異受體；VPAC1和VPAC2是PACAP和血管活性腸肽(VIP)的共同受體；PACAP對3個受體具有相同的激動功能。其中PAC1受體主要分布於中樞神經系統、周圍神經系統以及睪丸、卵巢、呼吸道、肺、胰腺等非神經組織內等。目前已證實由PAC1介導的PACAP生物學功能有神經遞質/調質、保護神經細胞；神經損傷修復(眼角膜敏感度恢復，眼部手術後神經細胞突出形成)；調節血管；促進激素分泌，調節內分泌平衡；調節性腺功能和生殖細胞的產生；參與消化活動，調節能量代謝平衡；參與調節免疫系統；調節細胞增殖分化；與攝食睡眠有關；與學習和記憶有關；與某些心理感受有；與動物的生物鐘有關；等等。鑑於PAC1介導了PACAP的多種生物學功能，因此開發PAC1的特異激動劑和特異結抗劑具有巨大的藥用開發的價值。例如PAC1受體在眼部三叉神經特異高表達，而RMMAX通過PAC1有效促進角膜手術后角膜敏感性的恢復及眼部三叉神經細胞突起的形成(神經產生)；因此在眼睛角膜修復、神經修復及保護方面具有極大的應用價值。目前已發現的PACl特異激動劑maxadilan是從白蛉唾液腺中分離的由61個胺基酸組成的多肽，本專利公開的RMMAX，由73個胺基酸組成，與maxadilan有80^同源性，但是是通過基因工程方法製備獲得的重組多肽；而且RMMAX與maxadilan相比具有不同的N端和C端序列及修飾，賦予RMMAX更高的穩定性和活性。RMMAX與PACAP基本沒有同源性，但能有效激活PACAP的特異受體PAC1，發揮相應的生物學功能。
發明內容本發明的目的在於克服現有技術存在的不足，提供一種具有高穩定性和高活性的PAC1受體激動劑RMMAX。本發明的另一個目的是提供上述重組PAC1受體激動劑RMMAX的表達方法。本發明的進一步目的是提供上述重組PAC1受體激動劑RMMAX的應用。根據RMMAX的胺基酸序列，設計在原核表達的基因，採用基因工程的原理和技術，結合蛋白內含肽(intdn)的可誘導剪切功能實現兩條目的多肽的高效製備，具體包括如下步驟(1)設計併合成RMMAX基因，如SEQIDNO:l所示。採用6條引物三步法合成RMMAX基因引物F3和F4進行鏈延伸反應；然後以其產物為模板，以F2和F5為引物，進行第一輪PCR;最後以此PCR產物為模板，以F1和F6為引物，進行第二輪PCR，獲得RMMAX基因；所述引物Fl-6的核苷酸序列如下所示Fl:CAGGCGCATCATAGCAACGTGCTGCAGACCAGCGTGCAGACCACCGCGACCTTTACCAACGTGATCCATF5:GGTGGTGTCATATGGGCAGCATTCTGTGCGATGCGACCTGCCAGTTTCGTAAAGCGATTF6:GGTGGTTCTCGAGTTTGCCCGCTTTAAATTCTTTTTTTTTCTGTTTCATGCATTCTTT其中，N代表保護鹼基，CATATG為Ndel酶切位點，CTCGAG為XhoI酶切位點。(2)用NdeI和XhoI進行酶切，將RMMAX基因隆到質粒pKYB的Ndel和Xhol位點間，構建重組質粒pKY-RMMAX;(3)兩個重組質粒轉化表達宿主菌Eco//StrainER2566,構建表達工程菌；(4)誘導劑IPTG誘導由目的多肽、蛋白內含肽和幾丁質結合域(Chitinbindingdomain,CBD)組成的"三元"融合蛋白的表達；(5)融合蛋白經幾丁質柱純化，硫醇誘導蛋白內含肽的N端切割，釋放目的多肽C端硫酯；(6)透析多肽硫酯，使其在適當條件下水解產生穩定的C端硫代羧酸水解產物。本發明的有益效果本發明所製備的PAC1受體特異激動劑RMMAX(73AA)與現有的PACl特異激動劑(68AA)相比，其C端和N端均具有特殊的胺基酸序列，並且在C端通過硫代羧酸修飾，有效提高多肽的穩定性。本發明的RMMAX是新型的PACl受體的特異激動劑，與PACl受體結合更強，具有更高激活PACl受體功能。RMMAX可應用於與PACl受體密切相關的疾病的診斷和治療。特別是已有研究顯示PACl介導神經生長與修復的功能，因此作為PACl受體特異激動劑，本專利公開的重組多肽在神經修複方面(眼部手術神經損傷修復)，將具有巨大的應用前景。本專利還首次發現RMMAX具有高效升糖的作用，顯示RMMAX可用於能量代謝相關疾病的研究、診斷及治療，例如高血糖、低血糖、糖尿病等。同時，利用本發明的方法合成的RMMAX多肽硫脂的水解產物比化學合成的多肽的穩定性高10倍以上。本發明的表達方法效率高、成本低，應用前景廣闊。圖1為RMMAX的製備示意圖；圖2為RMMAX基因的合成示意圖；圖3為pKY-MAX質粒的構建示意圖；圖4為pKY-MAX質粒的測序鑑定圖；圖5為RMMAX的表達和幾丁質柱純化；圖6為RMMAX飛行質譜結果；圖7為RMMAX調節血糖活性測定。其中，圖5中，1:蛋白marker;2:菌體IPTG誘導前；3:菌體EPTG誘導後；4:破碎上清；5:上樣流出液l;6:上樣流出液2;7:洗柱流出液；8:目的多肽洗脫樣品前10ml柱體積；9:目的多肽洗脫樣品後10ml柱體積；10:柱填料上結合的融合蛋。具體實施方式實施例l特異激動劑RMMAX的製備l.RMMAX基因的製備具體步驟見圖1，按大腸桿菌的密碼偏好性設計編碼RMMAX的基因；設計6條引物，採用三步法獲得RMMAX的基因(如圖2):①鏈延伸反應引物F3(0.1A/uL)5uLl，F4(0.1A/iiL)5uL，10XTaKaRaLABuffer(含有4mMMgCl2),10uL，dNTP16uL，H2063pL，94°C，10min;降至55。C，力QTaKaRaLATaq酶1uL，保溫5min;72°C，5min;所得為延伸反應液。②PCR反應引物F2(0.01A/uL)lyL，F5(0.01A/ul)luL，①所得延伸反應液luL，dNTP10pL，10XTaKaRaExBuffer10uL，TaKaRaExTaq酶1yL，H2076uL，94°C，4min;94°C，45sec、55°C，45sec、72°C，60sec，35個循環；72°C，10min;③以第②步PCR反應產物為模板，引物Fl(0.01A/yL)1yL，F6(0.01A/u1)1uL，延伸反應液1uL，dNTP10yL，10XTaKaRaExBuffer10uL，TaKaRaExTaq酶1uL，H2076lxL，94°C，4min;94°C，45sec、58°C，45sec、72°C，60sec，35個循環；72°C，10min。Fl:NNNNNNCATCATAGCAACGTGCTGCAGACCAGCGTGCAGACCACCGCGACCTTTACCF2:CGGCAGCTGGCTGGTATCCATGCTGGTAAAGGTCGCGGTGGTCTGF3:TGCCAGTTTCGTAAAGCGATTGATGATTGCCAGAAACAGGCGCATCATAGCAACGTGGCTGGTATCCATF5:GGTGGTGTCATATGGGCAGCATTCTGTGCGATGCGACCTGCCAGTTTCGTAAAGCGATTF6:NNNNNNNCTCGAGTTTGCCCGCTTTAAATTCTTTTTTTTTCTGTTTCATGCATTCTTT其中，N代表保護鹼基，CATATG為Ndel酶切位點，CTCGAG為Xhol酶切位點。RMMAX基因的合成示意圖如圖2所示。2.用Ndel和Xhol進行酶切，將RMMAX基因克隆到質粒pKYB的NdeI和XhoI位點間，構建重組質粒pKY-MAX，構建圖如圖3，測序鑑定圖如圖4。3.重組質粒pKY-MAX轉化表達宿主菌co"StrainER2566,構建表達工程菌pKY-BAY-ER;挑取單克隆於5mL含50jig/mL卡那黴素的LB培養基，搖菌培養過夜，以1:20接於1L含50mg/L卡那黴素的LB培養基，37。C搖菌至OD6(X)為0.5-0.8，加入IPTG至終濃度lmmol/L，3(TC誘導4h。離心收集菌體，重懸於60mL的溶液A(20mMTris.HCl,500mMNaCl，lmMEDTA，pH8.0)，然後超聲破碎，20，000g離心30min，收集上清。取10mL幾丁質珠裝填2.5X10cm層析柱，不少於10倍體積的溶液A(20mMTris-HCl，0.5MNaCl，1mMEDTA，pH8.0)洗柱；以0.5mL/min的流速上破碎上清；大於10倍體積的溶液A以2mL/min洗去雜蛋白，30mL溶液B(20mMTris-HCl，0.5MNaCl，1mMEDTA，50mMp-巰基乙醇，pH8.0)快速過柱，使P-巰基乙醇均勻分布並浸泡柱內填料，16'C誘導蛋白肽切割16h。溶液A洗脫目的多肽，分管收集，每2mL為一管，目的多肽大多存在於前10管中。Tricine-SDS-PAGE鑑定目的多肽；4。C透析過夜除去p-巰基乙醇。採用濾過分子量為10kD的超濾管濾除大分子蛋白雜蛋白。RMMAX製備過程的SDS-PAGE檢測如圖5。重組多肽RMMAX送北京軍事醫學科學院進行飛行質譜檢測，分子量為8056.78(圖6)，與理論值相符。實施例2重組多肽RMMAX提升血糖的功能清潔級(SPF級)KM雄性小鼠(使用許可證號粵檢證字2002一2009;合格證號粵檢證字2003A076)，由第一軍醫大學實驗動物中心提供，體重25士5g，按體重隨機分組，每組8隻。稱重，編號，禁食18h，5nmol/kg的重組RMMAX與高濃度葡萄糖(1.8mmol/kg)同時腹腔注射KW小鼠，注射溶媒作為空白對照。用OneTouchUltra血糖自動分析儀(美國JOHNSON公司)測定注射後一小時內血糖的變化，組間比較採用t檢驗。實驗結果(見表l、表2和圖7)顯示與注射溶酶的對照組相比，RMMAX組小鼠血糖一直在升高，沒有降低的趨勢，並且在注射後90min，其各個個體血糖均超過儀器測量上限，顯示RMMAX具有強烈的，持續的升血糖的作用。_表l.對照組_tableseeoriginaldocumentpage10表2.RMMAX組tableseeoriginaldocumentpage11*表示超出了儀器最高測量限度，沒有讀數，以儀器上限值代替Untitled.ST25.txtSEQUENCELISTING〈110〉暨南大學〈120〉重組PACl受體激動劑RMMAX及其表達方法與應用3Patentlnversion3.2〈210〉1人工序列<220〉<221〉CDS〈222〉(1)..(219)1atgggcageauucugugcgaugcgaccugcMetGlySerlieLeuCysAspAlaThrCys1510caguuucguaaagcgauuGinPheArgLysAlalie15gaugauugccagaaacaggcgcaucauageaacgugcugcagaccageAspAspCysGinLysGinAlaHisHisSerAsnValLeuGinThrSer202530gugcagaccaccgcgaccuuuaccageauggauaccagecagcugccgValGinThrThrAlaThrPheThrSerMetAspThrSerGinLeuPro354045ggcaacageguguuuaaagaaugcaugaaacagaaaaaaaaagaauuuGlyAsnSerValPheLysGluCysMetLysGinLysLysLysGluPhe505560aaagcgggcaaaetcgagggctcttecLvsAlaGlyLysLeuGluGlySerSer6^702〈211>73PRT人工序列2MetGlySerlieLeuCysAspAlaThrCys1510GinPheArgLysAlalie15AspAspCysGinLysGinAlaHisHisSerAsnValLeuGinThrSer202530ValGinThrThrAlaThrPheThrSerMetAspThrSerGinLeuPro354045GlyAsnSerValPheLysGluCysMetLysGinLysLysLysGluPhe5055LysAlaGlyLysLeuGluGlySerSer657060〈210〉3<211〉〈212〉DNA〈213〉人工序列4896144192219Untitled.ST25.txt〈400〉3Fl:CAGGCGCATCATAGCAACCTGCTGCAGACCAGCGTGCAOACCACCGCGACCTTTACCF2:CGGCAGCTGGCTGGTATCCATGCTGGTAAAGGTCGCGGTGGTCTGF3:TGCCAGTTTCGTAAAGCGATTGATGATTGCCAGAAACAGGCGCATCATAGCAACGTGF4:TTTCTGTTTCATGCATTCTTTAAACACGCTGTTGCCCGGCAGCTGGCTGGTATCCATF5:GGTGGTGTCATATGGGCAGCATTCTGTGCGATGCGACCTGCCAGTTTCGTAAAGCGATTF6:GGTGGTTCTCGAGTTTGCCCGCTTTAAATTCTTTTTTTTTCTGTTTCATGCATTCTTT權利要求1.重組PAC1受體激動劑RMMAX，其胺基酸序列如SEQIDNO2所示。2.編碼權利要求1所述胺基酸序列的核苷酸序列，如SEQIDNO:l所示。3.—種權利要求1所述重組PAC1受體激動劑RMMAX的表達方法，其特徵在於包括如下步驟(1)設計併合成RMMAX的基因(2)將RMMAX基因克隆到質粒pKYB的Ndel和Xhol位點間，構建重組質粒pKY-RMMAX;(3)重組質粒轉化表達宿主菌Eco//StrainER2566，構建表達工程菌；(4)用誘導劑IPTG誘導由目的多肽、蛋白內含肽和幾丁質結合域組成的"三元"融合蛋白的表達；(5)融合蛋白經幾丁質柱純化，硫醇誘導蛋白內含肽的N端切割，釋放目的多肽C端硫酯，多肽C端硫酯水解得到重組多肽RMMAX。4.如權利要求3所述的表達方法，其特徵在於步驟(1)所述RMMAX基因的核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。5.權利要求1所述重組PAC1受體激動劑RMMAX在製備提升血糖藥物中的應用。6.如權利要求5所述的應用，其特徵在於所述重組PAC1受體激動劑RMMAX在製備治療低血糖或中毒性休克藥物中的應用。7.權利要求1所述重組PAC1受體激動劑RMMAX在製備治療神經發育、神經再生、神經修復藥物或PAC1受體相關疾病藥物中的應用。8.如權利要求7所述的應用，其特徵在於所述PAC1受體相關疾病為腦損傷、腦缺血、防止神經細胞死亡、抗炎、角膜敏感性恢復、眼部神經損傷修復、男性陽痿、性冷淡、不孕不育、神經痛、神經病、神經混亂、焦慮症、記憶損傷、痴呆、認知混亂、中樞神經系統疾病、偏頭痛、神經畏縮、心肌缺血、心肌梗死/纖維化、與生物鐘睡眠及痛覺相關的疾病、動脈硬化、糖尿病、胃腸功能紊亂、肌萎縮症、胃潰瘍、高血壓、內毒性休克、血栓症、視網膜病變、心血管疾病、腎衰竭、心衰竭或脫髮。全文摘要本發明公開了一種重組PAC1受體激動劑RMMAX及其表達方法與應用。其C端和N端均具有特殊的胺基酸序列，並且在C端通過硫代羧酸修飾，有效提高多肽的穩定性。本發明的RMMAX是新型的PAC1受體的特異激動劑，與PAC1受體結合更強，具有更高激活PAC1受體功能。RMMAX可應用於與PAC1受體密切相關的疾病的診斷和治療。本發明還首次發現RMMAX具有高效升糖的作用，顯示RMMAX可用於能量代謝相關疾病的研究、診斷及治療，例如高血糖、低血糖、糖尿病等。利用本發明的方法合成的RMMAX多肽硫脂的水解產物比化學合成的多肽的穩定性高10倍以上。本發明的表達方法效率高、成本低，應用前景廣闊。文檔編號C07H21/04GK101125882SQ20071002928公開日2008年2月20日申請日期2007年7月20日優先權日2007年7月20日發明者餘榕捷,岸洪申請人:暨南大學