*蛋白腖部分的製作方法

2023-05-14 06:02:36 1

專利名稱：*蛋白腖部分的製作方法
脈蛋白腖部分本發明一般涉及包含脈蛋白腖部分(PPf)的組合物。特別地，本發明涉及包含 β -乳球蛋白缺乏且富含PPf的去礦質蛋白部分的提取物的生產方法及這些提取物的用 途。儘管起泡(foaming)是乳蛋白(milk protein)的典型特徵，但是已知奶在去除 酪蛋白、α-乳清蛋白和β-乳球蛋白後仍具有相當大的表面活性(R. Aschaffenburg， J. Dairy Res. 14 (1945)，316-328)。剩餘部分包括脈蛋白腖部分(PPf)，其包含大量表面活 性組分。PPf表示特徵不明顯的蛋白質化合物的非均質混合物，其由Girardet等人， J. Dairy Res. 63 (1996)，333-350在該主題綜述中所概述，該文獻通過引用併入本文。描述了 PPf中的多種蛋白，如β-乳球蛋白、α-乳清蛋白和β-酪蛋白與Cisl-酪 蛋白以及血清白蛋白。兩種糖蛋白PP 16k和pp20k，對大腸桿菌的腸毒素具有結合親合力， 分別被鑑定為α-乳清蛋白和β-乳球蛋白的糖基化形式。骨橋蛋白-酸性60kDa磷糖蛋 白-和88kDa乳鐵蛋白是由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測出的較 大蛋白質。奶樣品中主要PPf組分(被命名為組分3、5和8(PP3、PP5、PP8))的量與其纖溶 酶活性相關。以下組分是纖溶酶活性對β-酪蛋白的結果PP5或i3-CN-5P f (1-105/7 ； β-酪蛋白的N端肽1-105和1-107)、PP8-fast或β-CN-4P f (1-28 ； β -酪蛋白的N端肽 1-28)。組分 PP8-slow 和 β-CN-IPf (29-105/7 ； β-酪蛋白的N 端肽29-105和 29-107)是 單獨的實體，通過電泳遷移率難以區分。ΡΡ3組分的非均質分子結構通過以下觀察來說明。ΡΡ3磷糖蛋白形成大小為 163kDa(通過超速離心法在ρΗ 8. 6測定)的複合物，使用5Μ-胍可以將該複合物解離成表 觀MW為40kDa的亞單元。SDS-PAGE在二硫鍵還原劑2-巰基乙醇存在下進行時，顯示存在 兩種主要糖蛋白組分24. 6-33. 4kDa和17-20. QkDa0實際上總是觀察到並發現表觀分子 量為28kDa和ISkDa的重要糖蛋白與IlkDa的帶有關。當通過二維聚丙烯醯胺凝膠電泳 (2D-PAGE)拆分時，它們分別表現為4個點和2個點，表觀等電點範圍為ρΗ 4. 9至6. 1。該 複合物由分子量為28kDa、18kDa和IlkDa的糖蛋白組成，與分子量為約7kDa的非糖基化多 肽相關聯。通過凝集素親和層析法用伴刀豆球蛋白A(ConA)進行分離，顯示IlkDaUSkDa 和28kDa糖蛋白的複合物行為。IlkDa糖蛋白不與ConA結合，而較大的18kDa和28kDa形 式在非結合部分(稱為糖蛋白PPl8_*pp28_)與結合部分(稱為糖蛋白ppl8+和pp28+)之 間分布。在本領域中，PPf從脫脂乳獲得。但是，從脫脂乳中分離PPf包括熱處理(例如在90°C加熱IOmin)以及將奶酸化 以通過沉澱/離心去除酪蛋白和變性乳清蛋白。這種常規方法非常昂貴且不適用於工業規 模。因此，本發明的目的是為本領域提供一種獲得PPf的方法，該方法可以在工業上 應用。本發明的另一個目的是為本領域提供一種富含PPf的提取物，該提取物顯示與從奶中分離的PPf不同的蛋白組成，且呈現優良的性質和額外的益處。本發明人驚訝地觀察到這些目的可以通過各獨立權利要求的主題來實現。本發明人發現，如果用去礦質蛋白部分、例如去礦質球狀蛋白部分、特別是用與脫 脂乳相對的乳清蛋白濃縮物(WPC)或乳清蛋白分離物(WPI)生產富含PPf的提取物，那麼 應用本發明的方法時將實現本發明的目的。非常具體的本發明方法使得可以生產具有特別有益性質的提取物。所得提取物例如是熱穩定的，並且含有酸溶性和酸不溶性蛋白。此外，乳清是便宜的原料，通常是例如乳酪生產的廢產物。製備乳酪的方法需要加 入粗製凝乳酶_蛋白水解酶，這種酶使奶凝固，使其分離成凝乳(未來的乳酪)和可溶的乳 清部分。相比之下，奶是昂貴的原料。而且，因為WPI幾乎是不含脂肪的，所以根據我們的發明在生產PPf的過程中，不 需要去除脂肪步驟，簡化了方法並且進一步使PPf免遭汙染。因此，本發明的一個實施方案是提取物的生產方法，其包括以下步驟-將去礦質的含水天然蛋白分散液的pH調節至約5.6至8. 4或約3. 5至5. 0，-將含水天然蛋白分散液加熱至約70至95°C達約10秒至60分鐘，-在加熱後將至少一部分直徑至少IOOnm的所形成的固體大分子量凝聚物從含水 蛋白分散液中去除，以及-收集分散液的剩餘液體部分。所得提取物包含β -乳球蛋白缺乏且富含PPf的蛋白部分。所得提取物也被去礦 質。對本發明來說，「去礦質的(Demineralised)」意指與甜或酸乳清中任一種相比， 礦質含量減少至少25%，優選至少50%，更優選至少75%。甜或酸乳清的乾物質平均含有 8. 8%礦質，包括 0. 9%鈣、0. 8%鈉、2. 2%鉀、0. 鎂、0. 7%磷和 2. 0%氯。在本發明的上下文中，「 β -乳球蛋白缺乏」意指與β "乳球蛋白相對於天然球狀 蛋白溶液中蛋白總重量的重量含量相比，乳球蛋白相對於提取物中蛋白質總重量的重 量含量為至多70%，優選至多50%，進一步更優選至多20%。因此，β-乳球蛋白缺乏的提取物包含至多70重量％、優選至多50重量％、進一 步更優選至多20重量％的存在於天然球狀蛋白溶液中的β _乳球蛋白的量。「富含PPf」意指與PPf相對於天然球狀蛋白分散液中蛋白總重量的重量含量相 比，PPf相對於提取物中蛋白總重量的重量含量增加至少2倍，優選至少5倍，進一步更優 選至少10倍。本發明的提取物還可以富含α-乳清蛋白。富含α-乳清蛋白意指與α -乳清蛋 白相對於初始天然球狀蛋白分散液中蛋白總重量的重量含量相比，α-乳清蛋白相對於提 取物中蛋白總重量的重量含量增加至少1. 2倍，優選至少1. 5倍，進一步更優選至少2倍。本發明的提取物優選用去礦質球狀蛋白分散液製備，特別用乳清製備。去礦質蛋 白部分優選為去礦質球狀蛋白部分，特別是乳清蛋白部分。在本發明的一個實施方案中，去礦質的含水天然蛋白分散液為去礦質的乳清或去 礦質的乳清蛋白部分。
一般而言，所形成的直徑至少IOOnm的固體大分子量凝聚物可以在加熱後通過任 何本領域已知的方法從含水乳清蛋白分散液中去除。但是，大分子量凝聚物的去除可以優 選通過沉降、離心、過濾、微量過濾或這些方法的組合進行。這種去除步驟可以伴隨另外的 pH調節。沉降具有下述優點所需實驗裝置最小且其可以在最低能量輸入下進行。離心是快速方法，這種方法不管怎樣都包括能量輸入。連續離心是已經用於工廠 的方法，例如用於白乳酪製備。過濾和微量過濾可廣泛應用於大規模生產，在去除大分子量凝集物中是非常值得 信賴的。通過將這些方法中的數種組合，則可以組合它們各自的優點。例如，通過應用最後步驟的微量過濾方法，可以實現基本上完全去除直徑至少 IOOnm的大分子量凝聚物。在加熱後，從含水乳清蛋白分散液中去除優選至少90%、更優選95%、最優選至 少99%且最理想100%的直徑至少IOOnm的固體大分子量凝聚物。本發明的方法還可進一步包括超濾和/或蒸發步驟。超濾是利用液體靜壓力來迫使液體通過半滲透性膜的膜過濾技術。懸浮固體和高 分子量溶質被攔截，而水和低分子量溶質跨過膜。在工業和研究中使用該分離方法來純化 和濃縮含有大分子量分子(IO3至IO6Da)、尤其是蛋白質的溶液。超濾具有以下優點在工 業環境中廣為接受，允許有效且同時溫和地分離大分子量蛋白質，避免應力誘導的蛋白質 變性。蒸發是溫和的方法，其允許濃縮蛋白溶液。蒸發可以例如通過加熱來觸發，例如加 熱至至少40°C或優選至少60°C。例如，可以將包含PPf的組合物乾燥以使水含量降至基 於總組合物重量以重量計10%以下，優選以重量計5%以下，進一步更優選以重量計2%以 下。該乾燥步驟具有以下優點所得的富含PPf的提取物可以以高濃度貯存，使組合物的 重量減少同時保持其全部活性。通過蒸發而提供的低水活性也確保了產物具有較高的穩定 性。在本發明的方法中，優選將含水天然乳清蛋白分散液加熱約15分鐘至約85°C。優 選將PH調節至約3. 5至5. 0，或約5. 6至6. 4，優選約5. 8至6. 0，或約7. 5至8. 4，優選約 7. 6至8. 0，或約6. 4至7. 4，優選約6. 6至7. 2。在獲得本發明的廣泛實驗的過程中，本發明人令人驚訝地注意到，當在熱處理之 前將PH調節至非常精確的pH值(士 0. IpH單位)時，獲得球形顆粒的乳清蛋白凝聚物，其 顯示直徑小於1 μ m。發現最佳pH值取決於原料例如WPI的濃度和組成。這種方法具有在 缺乏任何機械應力例如剪切下產生乳清蛋白顆粒的優點。所得微粒提供以下優點容易從 本發明的含PPf提取物中去除形成這些顆粒的化合物。本發現表明，pH和離子強度是所示方法的兩個重要因素。因此，經廣泛透析的樣品 極其缺乏游離陽離子如Ca++、K+、Na+、Mg++，該樣品在應用所述的熱處理之後易於在低於5. 4 的PH產生凝乳，在高於6. 8的pH產生可溶的乳清蛋白凝聚物。因此，僅有相當窄的pH值 範圍提供PPf提取物製備所需的固體乳清蛋白顆粒類型。類似的乳清蛋白顆粒通過使用對 稱位於乳清的等電PH之下的pH值來製備，即3. 5至5. 0。
如果就低濃度(對於IOOg初始乳清蛋白粉末，低於0.2g) 二價陽離子而言將pH 調節至5. 6至6. 4、更優選5. 8至6. 0的pH範圍，則獲得帶負電荷的顆粒。根據乳清蛋白源 (例如WPC或WPI)的礦質含量，可以增加pH到8. 4。特別地，可以將pH調節至7. 5至8. 4， 優選7. 6至8. 0，以在大量游離礦質存在下獲得帶負電荷的顆粒。可以將pH調節至6. 4至 7. 4，優選6. 6至7. 2，以在適當濃度的游離礦質存在下獲得帶負電荷的顆粒。當然，顆粒電荷可用作從本發明含有PPf的乳清提取物中分離這些顆粒的工具。一般通過加入酸來調節pH，所述酸優選為食品級的，例如鹽酸、磷酸、乙酸、檸檬 酸、葡糖酸或乳酸。當礦質含量較高時，一般通過加入鹼性溶液來調節PH，所述鹼性溶液優 選為食品級的，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化銨。就本發明的方法而言，優選基本上不含鹽的含水天然乳清蛋白分散液。「基本上無 鹽的」意指對於約4重量％的蛋白濃度而言，鹽含量為lg/L或更低。例如，含水乳清蛋白溶 液可以含有少於2. 5重量％、更優選少於2重量％的其總乾物質為二價陽離子。天然蛋白、優選天然球狀蛋白、進一步更優選乳清蛋白存在於含水天然蛋白分散 液中，其量基於溶液總重量以重量計約0. 至12%、優選約0. 1 %至8%、更優選約0.2% 至7%、進一步更優選約1%至5%。含水乳清蛋白分散液可以包含來自牛或水牛、或綿羊或山羊、或馬、或駱駝來源或 其混合物的乳清。本發明的一個實施方案是包含由本發明方法可得的PPf、特別是乳清PPf的組合 物。由本發明方法可得的乳清PPf不同於現有技術中可用的PPf，特別是那些從奶中 可得的PPf，因為在本發明中乳清用作原料且使用特定的方法。由本發明方法可得的乳清PPf具有如下總胺基酸組成百分比的胺基酸組成約 6-9 % ASP、約 4-7 % THR、約 4-7 % SER、約 22-25 % GLU、約 9-12 % PRO、約 0-3 % GLY、約 1. 5-4. 5% ALA、約 4-7% VAL、約 0-2% CYS、約 1-4% MET、約 4-7% ILE、約 7. 5-10. 5% LEU、 約 0-3% TYR、約 6. 7-9. 7% LYS、約 1. 5-4. 5% HIS、約 1-4% ARG。該組成不同於通過常規方法可得的典型的PPf組成。在表1中，提供了根據常規 方法(樣品1)和乳清PPf (本發明，樣品2)的典型PPf-胺基酸譜，並可以進行比較。樣品1應用如下常規方法從相同WPI製備大體上，常規PPf 根據由 Paquet, D. Nejjar, Y. &Linden，G. (1988)；「從奶穌蛋白 腖中分離的疏水蛋白部分的研究」，Journal of Dairy Science，71，1464-1471提出的方法 製備。使用Prolacta 90 作為原料。將 Prolacta 90 (428g)在 5L Milli-Q 級 H2O 中重 建。測量該溶液的PH為6. 43，然後通過加入約15mL IN NaOH將pH調節至7. 00。將溶液 體積調至6L(終蛋白濃度為6% (w/w))並平等地分配至6個IL瓶中，將瓶在設為93°C的 水浴中放置30min，以使蛋白質變性。孵育20min之後使瓶內溫度達到90°C。在孵育結束 時，將瓶放置在冰浴中，冷卻至20°C。通過將pH調節至4. 6，完成蛋白質化合物的等電沉 澱。在實踐中，將3個IL瓶的內容物混合(pH 7. 17)，用約88mL IN HCl將pH調節至4. 6。 同樣地處理其它3個IL瓶。將所得兩組酸化溶液混合，在4°C貯存18小時，平等地分配至 6個IL塑料瓶中。將瓶離心(在6°C進行60min，5000rpm/7200g，配備有H 6000A轉子的Sorval RC3C Plus)之後，回收含有PPf的上清液。然後在半飽和(313g/L)下於2小時內 完成PPf的硫酸銨沉澱。離心(在6°C進行60min，5000rpm,使用Sorval RC3CPlus)之後 回收沉澱，混合，重新分散於350mL 1^11^級吐0中。使用截留MW為1000的Spectrapor 膜管(Spectrum Laboratories公司)、用22LMilli_Q級H2O對混濁的懸液/溶液進行透 析4次。透析之後，對含PPf的提取物進行離心(在6°C進行60min，5000rpm)，過濾上清液 (0. 22 μ m 過濾器，來自 Millipore 的 GP Stericup Express plus )，冷凍乾燥。由 360g 總乳清蛋白載荷，PPf的產量為6g(l. 6% )。例如，提供兩種下述標準來區分這兩種PPf 胺基酸譜(表1)和由2D-PAGE測定 的蛋白質譜(

圖1和2)。表1 常規PPf (樣品1)和乳清蛋白PPf (樣品2)的胺基酸組成，表示為g每種氨 基酸/IOOg粉末，或總胺基酸組成的百分比。
權利要求
富含蛋白腖部分(PPf)的提取物的生產方法，其包括以下步驟 將去礦質的含水天然蛋白分散液的pH調節至約5.6至8.4或約3.5至5.0， 將所述含水天然蛋白分散液加熱至約70 95℃達約10秒至60分鐘， 在加熱後將至少一部分直徑為至少100nm的所形成的固體大分子量凝聚物從所述含水蛋白分散液中去除，以及 收集所述分散液的剩餘液體部分。FPA00001229444600011.tif
2.根據權利要求1的方法，其中所述去礦質的含水天然蛋白分散液是去礦質的乳清蛋 白部分。
3.根據前述權利要求中任一項的方法，其中在加熱後將至少90%、優選95%、最優選 至少99%的直徑為至少IOOnm的固體大分子量凝聚物從所述含水蛋白分散液中去除。
4.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述pH被調節至約3.5至5. 0， 或約5. 6至6. 4，優選約5. 8至6. 0，或約7. 5至8. 4，優選約7. 6至8. 0，或 約6. 4至7. 4，優選約6. 6至7. 2。
5.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述含水天然蛋白分散液基本上不含鹽。
6.根據前述權利要求中任一項的方法，其中蛋白質存在於含水蛋白分散液中的量為基 於分散液總重以重量計約0. 至12%、優選約0. 至8%、更優選約0.2%至7%、進一 步更優選約1%至5%。
7.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述含水蛋白分散液包含少於以重量計 2. 5%、更優選少於以重量計2%的其總乾物質為二價陽離子。
8.根據前述權利要求中任一項的方法，其中將所述分散液的剩餘液體部分乾燥以使水 含量降至基於總組合物重量以重量計10%以下，優選5%以下，進一步更優選2%以下。
9.包含乳清PPf的組合物，所述乳清PPf可根據權利要求1-8中任一項的方法得到。
10.根據權利要求9的組合物，其具有如下總胺基酸組成百分比的胺基酸組成約 6-9 % ASP、約 4-7 % THR、約 4-7 % SER、約 22-25 % GLU、約 9-12 % PRO,約 0-3 % GLY、約 1. 5-4. 5% ALA、約 4-7% VAL、約 0-2% CYS、約 1-4% MET、約 4-7% ILE、約 7. 5-10. 5% LEU、 約 0-3% TYR、約 6. 7-9. 7% LYS、約 1. 5-4. 5% HIS、約 1-4% ARG。
11.根據權利要求9-10的組合物，其在經受以下方法後產生類似於圖1中所示的凝膠-將來自蛋白質溶液、特別是PPf的250 μ g蛋白質當量溶於340 μ 1變性溶液中，所述 變性溶液由終濃度分別為7M、2M、65mM、20mM、65mM、0. 4% (w/v)的脲、硫脲、CHAPS、Tris, DTT、兩性電解質和用於著色的溴酚藍組成，-將所述樣品裝載到PH 3至pH 10的pH梯度固定化電解質條帶上，所述條帶位於用 1. 5M Tris緩衝液製備的9至16%丙烯醯胺凝膠上，-施加300伏特的電壓達11. 6小時，然後施加5000伏特的電壓達12. 4小時通過所述 固定化電解質條帶凝膠，以藉助電荷分離蛋白質，-將所述固定化電解質條帶凝膠定位在丙烯醯胺範圍為9至16%的丙烯醯胺梯度凝膠 上，所述凝膠位於25mM Tris/192mM甘氨酸/0. 1% SDS (w/v)，pH 8. 3的緩衝液中，-施加40mA電流通過所述凝膠過夜，以將此前在固定化電解質條帶凝膠上分離的蛋白質拖到丙烯醯胺基質中，進而根據尺寸將其分離，「用考馬斯亮藍染色使凝膠蛋白點顯影。
12.根據權利要求9至11中任一項的組合物在製備食品、食物補充劑、營養劑、藥物和 /或美容組合物中的用途。
13.根據權利要求9至11中任一項的組合物作為乳化劑、作為起泡劑和/或用於低脂 肪產品的用途。
14.根據權利要求12至13中任一項的用途，用於製備以下產品奶精、特別是咖啡奶 精，發泡飲料如熱牛奶咖啡、拿鐵咖啡、巧克力、酸乳酪、巴氏殺菌UHT奶、甜煉乳、發酵乳、 基於奶的發酵產品、牛奶巧克力、慕斯、泡沫、乳狀液、冰淇淋、酸性飲料、碳酸飲料、果汁、制 備飲料的團聚粉、奶制粉末、嬰兒配方食品、飲食強化產品、寵物食品、片劑、乾燥的口服補 充劑、溼的口服補充劑、衛生保健營養配方、化妝品。
15.根據權利要求9至11中任一項的組合物用於提取和/或穩定疏水或脂溶性組分的 用途，如來自生物材料如植物、水果、生物組織或流體、發酵產品、細胞培養物、細菌、酵母的 色素、生物活性劑或抗氧化劑。
全文摘要
本發明一般涉及包含蛋白腖部分(PPf)的組合物。特別地，本發明涉及包含β-乳球蛋白缺乏且富含PPf的去礦質蛋白部分的提取物的生產方法及這些提取物例如在食品、食物補充劑、營養劑、藥物和/或美容組合物中的用途、例如作為乳化劑或起泡劑的用途。本發明的PPf部分可以如下獲得將含水天然蛋白分散液的pH調節至約5.6至8.4或約3.5至5.0，將含水天然蛋白分散液加熱至約70至95℃達約10秒至60分鐘，在加熱後將至少一部分直徑至少100nm的所形成的固體大分子量凝聚物從含水蛋白分散液中去除，以及收集分散液的剩餘液體部分。
文檔編號A23J1/20GK101977515SQ200980110017
公開日2011年2月16日 申請日期2009年2月18日 優先權日2008年2月20日
發明者C·施米特, L·J·R·博韋託, M·福雷, P·蒙塔馮 申請人:雀巢產品技術援助有限公司