一種檢測倍他米松的試紙條及其應用的製作方法

2023-05-11 21:14:51

一種檢測倍他米松的試紙條及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測倍他米松的試紙條及其應用。試紙條包括樣品吸收墊（1）、結合物釋放墊（2）、反應膜（3）、吸水墊（4）和底板（7），所述反應膜上具有包被有倍他米松半抗原-載體蛋白偶聯物的檢測線（5）和包被有羊抗鼠抗抗體的質控線（6），所述結合物釋放墊（2）噴塗有倍他米松單克隆抗體-膠體金標記物。本發明還提供了一種應用上述倍他米松試紙條檢測化妝品中倍他米松殘留的方法。本發明所提供的試紙條具有操作簡單、靈敏度高、檢測速度快、成本低等特點，適合大量樣本的篩查和現場監控。
【專利說明】一種檢測倍他米松的試紙條及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測倍他米松的試紙條及其應用，具體涉及一種用於檢測倍他米松的膠體金試紙條，其特別適用於化妝品中倍他米松殘留的檢測。
【背景技術】
[0002]倍他米松屬於腎上腺皮質激素類藥物，具有抗菌、消炎的作用。由於其具有廣譜高效的殺菌作用，常被添加到祛痘類產品中以達到消炎、祛痘、除蟎及抗粉刺的目的。但這種藥物的不良反應較多，有滁鈉作用，對生長的抑制作用較強；還能引起皮質炎固醇激素引起的各種不良反應，如肌肉骨骼、胃腸道、皮膚、神經系統、內分泌系統的異常和水電解質紊亂等。鑑於以上這些不良反應，長期使用添加有倍他米松的化妝品或皮膚性接觸此種藥物可嚴重影響人體健康，因此，我國衛生部頒布的2007年版《化妝品衛生規範》中規定，化妝品中不得添加倍他米松。
[0003]目前關於倍他米松檢測的文獻報導大都是針對倍他米松原料和藥品，也有關於動物組織中倍他米松檢測的研究，主要有旋光法、分光光度法、高效液相色譜法和液相色譜-串聯質譜法等。旋光法影響因素較多，需要標準對照品和樣品的量較多，不適宜微量分析；分光光度法操作繁瑣，樣品處理過程中損失較多，且檢出限較高，重複性較差；高效液相色譜法和液相色譜-串聯質譜法靈敏、準確，特異性強、分離度好，可以同時測定多種藥物，但需要昂貴的儀器、樣品的前處理複雜、繁瑣費時、檢測的成本較高，不能現場操作，而且需專業人員操作，所以限制了其應用。因此，針對現有倍他米松檢測技術上的不足，我們設計了一種用膠體金免疫層析技術檢測化妝品中倍他米松的方法，該方法特異性好、靈敏度高、操作簡便、檢測成本低、適合於批量樣品的篩選檢測，是理想的快速篩選手段，能夠更好地滿足我國化妝品企業、政府職能監管部門等開展檢測工作。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種靈敏度高、操作簡單、成本低、檢測時間短的倍他米松殘留檢測試紙條。
[0005]本發明所提供的檢測倍他米松殘留的試紙條，包括樣品吸收墊(I)、結合物釋放墊(2 )、反應膜(3 )、吸水墊(4 )和底板(7 );所述反應膜上具有包被有倍他米松半抗原-載體蛋白偶聯物的檢測線(5 )和包被有羊抗鼠抗抗體的質控線(6 )，所述結合物釋放墊(2 )噴塗有倍他米松單克隆抗體-膠體金標記物。
[0006]所述倍他米松半抗原-載體蛋白偶聯物是由倍他米松半抗原與載體蛋白偶聯得至IJ，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。
[0007]所述倍他米松單克隆抗體是以倍他米松半抗原-載體蛋白偶聯物作為免疫原製備獲得，是由倍他米松單克隆抗體雜交瘤細胞株E-3-1 CGMCC N0.6501分泌獲得；所述羊抗鼠抗抗體是將鼠源抗體免疫羊得到。
[0008]所述樣品吸收墊(I)、結合物釋放墊(2)、反應膜(3)、吸水墊(4)依次粘貼在底板(7 )上，所述結合物釋放墊1/3~1/2被覆蓋於樣品吸收墊下。
[0009]所述底板可為PVC底板或其他硬質不吸水的材料；所述樣品吸收墊可為吸濾紙或濾油紙；所述結合物釋放墊可為玻璃棉或聚酯材料；所述吸水墊為吸水紙；所述反應膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜。
[0010]本發明的另一個目的是提供一種製備上述試紙條的方法，其包括步驟:
[0011]1)製備噴塗有倍他米松單克隆抗體-膠體金標記物的結合物釋放墊；
[0012]2)製備具有包被有倍他米松半抗原-載體蛋白偶聯物的檢測線和包被有羊抗鼠抗抗體的質控線的反應膜；
[0013]3)將1)和2)製備好的結合物釋放墊、反應膜與樣品吸收墊、吸水墊和底板組裝成試紙條。
[0014]具體地說,步驟包括:
[0015]1)半抗原製備:將倍他米松與丙二胺反應得到倍他米松半抗原；
[0016]2)將倍他米松半抗原與載體蛋白偶聯，得到倍他米松半抗原-載體蛋白偶聯物；
[0017]3)用倍他米松半抗原-載體蛋白偶聯物免疫小鼠，將小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞通過融合、篩選，得到倍他米松單克隆雜交瘤細胞株；
[0018]4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗體；
[0019]5)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應製備膠體金；
[0020]6)將步驟3)製備的倍他米松單克隆抗體加入步驟5)製備的膠體金中，得到倍他米松單克隆抗體-膠體金標記物；
[0021]7)將倍他米松單克隆抗體-膠體金標記物噴塗在結合物釋放墊上，37°C烘Ih後取出，置於乾燥環境中保存備用；
[0022]8)將倍他米松半抗原-載體蛋白偶聯物包被在反應膜上構成檢測線，將羊抗鼠抗抗體包被在反應膜上構成質控線；
[0023]9)將樣品吸收墊用含0.5%牛血清白蛋白(體積分數)、pH為7.2,0.lmol/L磷酸鹽緩衝液浸泡2h，37°C下烘乾2h ；
[0024]10)在底板上按順序粘貼上樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜、吸水墊，樣品吸收墊蓋住結合物釋放墊，最後切成3mm寬的小條，加塑料盒，真空包裝，30?條件下可保存12個月。
[0025]本發明的另一個目的是提供一種應用上述試紙條檢測化妝品中倍他米松殘留的方法，它包括步驟:
[0026](1)樣品前處理；
[0027](2)用試紙條進行檢測；
[0028](3)分析檢測結果。
[0029]本發明的倍他米鬆快速檢測試紙條採用高度特異性的抗體抗原反應及免疫層析分析技術，將倍他米松單克隆抗體-膠體金標記物固定於結合物釋放墊上，樣品中的倍他米松在流動過程中，與結合物釋放墊上的倍他米松單克隆抗體-膠體金標記物結合，形成藥物-抗體-膠體金標記物。樣本中的藥物與反應膜檢測線上的倍他米松半抗原-載體蛋白偶聯物競爭結合倍他米松單克隆抗體-膠體金標記物，根據檢測線紅色條帶有無或顏色深淺來判斷待測樣品液中是否含有倍他米松殘留。[0030]檢測時，樣品經處理後滴入試紙條卡孔內，當倍他米松在樣品中的濃度低於檢測限或為零時，單克隆抗體-膠體金標記物在層析過程中會與固定在反應膜上的倍他米松半抗原-載體蛋白偶聯物結合，在檢測線(T)和質控線(C)內各出現一條紅色條帶；如果倍他米松在樣品中的濃度等於或高於檢測限，單克隆抗體-膠體金標記物會與倍他米松全部結合，從而在T線處因為競爭反應不會與倍他米松半抗原-載體蛋白偶聯物結合而不出現紅色條帶。如圖2所示。
[0031]陰性:當質控線(C)顯示出紅色條帶，檢測線(T)同時也顯示出紅色條帶，判為陰性。
[0032]陽性:當質控線(C)顯示出紅色條帶，而檢測線(T )不顯色，判為陽性。
[0033]無效:當質控線(C)不顯示出紅色條帶，則無論檢測線(T)顯示出紅色條帶與否，該試紙條均判為無效。
[0034]本發明的試紙條具有靈敏度高、特異性強、成本低、操作簡單、檢測時間短、適合各種單位使用、儲存簡單、保質期長的優點。用本發明試紙條檢測倍他米松殘留的方法簡便、快速、直觀、準確、適用範圍廣、成本低、易推廣使用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1為試紙條剖面結構示意圖。
[0036]圖2為試紙條檢測結果判定圖。
[0037]圖3為倍他米松半抗原合成圖。
[0038]圖4為倍他米松半抗原核磁共振氫譜圖。
【具體實施方式】
[0039]下面結合具體的實施例來進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明，而不用來限制本發明的範圍。
[0040]實施例1倍他米松檢測試紙條的製備
[0041]該試紙條的製備方法主要包括以下步驟:
[0042]I)製備噴塗有倍他米松單克隆抗體-膠體金標記物的結合物釋放墊；
[0043]2)製備具有包被有倍他米松半抗原-載體蛋白偶聯物的檢測線和包被有羊抗鼠抗抗體的質控線的反應膜；
[0044]3)將I)和2)製備好的結合物釋放墊、反應膜與樣品吸收墊、吸水墊和PVC底板組裝成試紙條。
[0045]下面分步詳細敘述:
[0046]1、倍他米松半抗原的製備
[0047]將0.39g倍他米松溶解在10 ml吡啶中，室溫下緩慢滴加入0.3ml I, 3_丙二胺，滴加完畢後，升溫至60°C，繼續反應20h，旋蒸除去吡啶和未反應的丙二胺，在正己烷-乙酸乙酯體系中重結晶得到白色結晶，即為目標半抗原倍他米松-3-氨丙基烯胺，合成路線如圖3。
[0048]取上述產物經核磁共振氫譜測定，如圖4所示，1.0-2.7ppm間增加的3組峰為丙二胺片段上的烷基信號峰，說明目標半抗原合成成功。[0049]2、免疫原的製備
[0050]取半抗原15mg用2.2ml 二甲基甲醯胺(DMF)溶解完全，製成溶液I ;取牛血清白蛋白(BSA) 70mg用6.8ml 0.lmol/L PBS (ρΗ7.0)溶解完全，製成溶液II ;將溶液I加入溶液II中，製成溶液III ;取碳化二亞胺(EDC) IOOmg用Iml水溶解後加入溶液III中，室溫反應24h ;用0.01mol/L PBS透析三天，每天換液三次，得到免疫原。
[0051]3、包被原的製備
[0052]取半抗原15mg用2.2ml DMF溶解完全，製成溶液I ;取卵清蛋白(OVA) 70mg用
6.8ml 0.lmol/L PBS(pH7.0)溶解完全，製成溶液II ;將溶液I加入溶液II中，製成溶液III ；取EDC IOOmg用Iml水溶解後加入溶液III中，室溫反應24h ;用0.01mol/L PBS透析三天，每天換液三次，得到包被原。
[0053]4、倍他米松單克隆抗體的製備
[0054]( I)動物免疫
[0055]將步驟2得到的免疫原注入Balb/c小鼠體內，免疫劑量為150 μ g/只，使其產生
抗血清。
[0056](2)細胞融合和克隆化
[0057]取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按8:1 (數量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，採用間接競爭ELISA法測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，並意外發現，其中一株效價顯著高於其它雜交瘤細胞株，將該倍他米松單克隆抗體雜交瘤細胞株命名為E-3-1，該細胞株已於2012年8月28日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏號為CGMCC N0.6501。
[0058](3)細胞凍存和復甦
[0059]將雜交瘤細胞用凍存液製成IX IO6個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復甦時取出凍存管，立即放入37 °C水浴中速融，離心去除凍存液後，移入培養瓶內培養。
[0060](4)單克隆抗體的製備與純化
[0061]增量培養法:將雜交瘤細胞置於細胞培養基中，在37°C條件下進行培養，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養液進行純化，得到單克隆抗體，_20°C保存。
[0062]所述細胞培養基為向RPMI1640培養基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細胞培養基中的終濃度為20%(質量分數)，碳酸氫鈉在細胞培養基中的終濃度為0.2%(質量分數)；所述細胞培養基的PH為7.4。
[0063]5、羊抗鼠抗抗體的製備
[0064]以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。
[0065]6、倍他米松單克隆抗體-膠體金標記物的製備
[0066](I)膠體金的製備
[0067]用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01% (質量分數)，取IOOml置於錐形瓶中，用恆溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續高溫、持續攪拌下加入2.5ml 1%檸檬酸三鈉，繼續勻速攪拌加熱至溶液呈透亮的紅色時停止，冷卻至室溫後用去離子水恢復到原體積，4°C保存。製備好的膠體金外觀純淨、透亮、無沉澱和漂浮物。[0068](2)倍他米松單克隆抗體-膠體金標記物的製備
[0069]在磁力攪拌下，用0.2mol/L碳酸鉀溶液調膠體金的pH值至7.0，按每毫升膠體金溶液中加入20-50μ g的標準向膠體金溶液中加入倍他米松單克隆抗體，繼續攪拌混勻30min，加入10%BSA，使其在膠體金溶液中的終濃度為1% (體積分數)，靜置lOmin。12000r/min、4°C離心40min，棄上清液，沉澱用復溶緩衝液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/10的復溶緩衝液將沉澱重懸，置4°C備用。
[0070]復溶緩衝液:含酪蛋白0.02%~0.1%(質量分數)、吐溫-80 0.059Π).2%(質量分數)、ρΗ7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩衝液。
[0071]7、結合物釋放墊的製備
[0072]將結合物釋放墊浸泡於含有牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩衝液中的濃度為0.5%)、pH為7.2,0.5mol/L的磷酸鹽緩衝液中，均勻浸溼lh，37°C烘3h備用。用Isoflow噴膜儀將製備好的倍他米松單克隆抗體-膠體金標記物均勻噴塗在結合物釋放墊上，每Icm結合物釋放墊噴塗0.01ml倍他米松單克隆抗體-膠體金標記物後，置於37°C環境中(溼度< 20%) 60min後取出，置於乾燥環境(溼度< 20%)中保存備用。
[0073]8、反應膜的製備
[0074]將倍他米松半抗原-卵清蛋白偶聯物包被到反應膜上構成檢測線，將羊抗鼠抗抗體包被在反應膜上構成質控線。 [0075]包被過程:用磷酸緩衝液將倍他米松半抗原-卵清蛋白偶聯物稀釋到10mg/ml,用Isoflow點膜儀將其包被於硝酸纖維素膜上的檢測線(T線)，包被量為0.8 μ Ι/cm ;用0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩衝液將羊抗鼠抗抗體稀釋到200 μ g/ml,用Isoflow點膜儀將其包被於硝酸纖維素膜上的質控線(C線)，包被量為1.0 μ Ι/cm。將包被好的反應膜置於37°C條件下乾燥2h，備用。
[0076]9、樣品吸收墊的製備
[0077]將樣品吸收墊置於含0.5%牛血清白蛋白(體積分數)、pH7.2,0.lmol/L磷酸鹽緩衝液中浸泡2h，37°C烘2h備用。
[0078]10、試紙條的組裝
[0079]將樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜、吸水墊依次按順序粘貼在PVC底板上；結合物釋放墊從起始端有1/3區域被樣品吸收墊覆蓋，結合物釋放墊的末端與反應膜的始端連接，反應膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與PVC底板的始端對齊，吸水墊的末端與PVC底板的末端對齊；所述反應膜上有檢測線和質控線，檢測線(T線)和質控線(C線)均為與所述試紙條的長相垂直的條狀帶；檢測線位於靠近結合物釋放墊的末端的一側；質控線位於遠離結合物釋放墊的末端的一側；將試紙條用機器切成3_寬的小條，裝在特製的塑料制卡中，4~30°C條件下可保存12個月。
[0080]實施例2樣品中倍他米松殘留的檢測
[0081]1、樣品的前處理
[0082]稱取0.lg±0.01g (霜狀、乳液)或0.1ml (化妝水)樣品於IOml離心管中，加入10ml 0.02mol/L的磷酸鹽緩衝溶液，渦動lmin，待檢。
[0083]2、用試紙條進行檢測
[0084]用吸管吸取待檢樣品溶液垂直滴加2~3滴於加樣孔，液體流動時開始計時，反應5~IOmin,判定結果。
[0085]3、分析檢測結果
[0086]陰性(-):T線和C線都顯色，表示樣品中倍他米松濃度低於檢測限，如圖2 (a)。
[0087]陽性( + ):T線無顯色C線顯色，表示樣品中倍他米松濃度等於或高於檢測限，如圖
2(b)。
[0088]無效:未出現C線，表明不正確的操作過程或試紙條已變質失效，如圖2 (C)。在此情況下，應再次仔細閱讀說明書，並用新的試紙條重新測試。
[0089]實施例3樣品檢測實例
[0090]1、檢測限試驗
[0091]取空白化妝品樣本(霜、乳液或化妝水)，在其中分別添加倍他米松至終濃度為0.5、l、2mg/kg(L),取試紙條進行檢測,每個樣本重複測定三次。
[0092]用試紙條檢測化妝品樣本時，當其中倍他米松添加濃度為0.5mg/kg(L)時，試紙條上顯示出肉眼可見的兩條紅色線條，呈陰性；當其中倍他米松添加濃度為l、2mg/kg(L)時，試紙條質控線顯色，檢測線不顯色，呈陽性，表明本試紙條對化妝品中倍他米松的檢測限為 lmg/kg(L)。
[0093]2、假陽性率、假陰性率試驗
[0094]取已知倍他米松含量大於lmg/kg(L)的化妝品陽性樣本20份和含量小於Img/kg(L)的化妝品陰性樣本20份，用三批試紙條進行檢測，計算其陰陽性率。結果見表1。
[0095]表1檢測樣本結果
[0096]
【權利要求】
1.一種檢測倍他米松的試紙條，包括樣品吸收墊(I)、結合物釋放墊(2)、反應膜(3)、吸水墊(4 )和底板(7 )，其特徵在於所述反應膜上具有包被有倍他米松半抗原-載體蛋白偶聯物的檢測線(5 )和包被有羊抗鼠抗抗體的質控線(6 )，所述結合物釋放墊(2 )噴塗有倍他米松單克隆抗體-膠體金標記物。
2.如權利要求1所述的試紙條，其特徵在於所述樣品吸收墊(I)、結合物釋放墊(2)、反應膜(3 )、吸水墊(4 )依次粘貼在底板(7 )上。
3.如權利要求1-2任一項所述的試紙條，其特徵在於所述結合物釋放墊1/3~1/2被覆蓋於樣品吸收墊下。
4.如權利要求1所述的試紙條，其特徵在於所述倍他米松半抗原-載體蛋白偶聯物由倍他米松半抗原與載體蛋白偶聯得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。
5.如權利要求1或4任一項所述的試紙條，其特徵在於所述倍他米松半抗原是由倍他米松與丙二胺反應得到，其分子結構式為:

6.如權利要求1所述的試紙條，其特徵在於所述倍他米松單克隆抗體是以倍他米松半抗原-載體蛋白偶聯物作為免疫原製備獲得，所述羊抗鼠抗抗體是將鼠源抗體免疫羊得到。
7.如權利要求1或6任一項所述的試紙條，其特徵在於所述倍他米松單克隆抗體是由倍他米松單克隆抗體雜交瘤細胞株E-3-1 CGMCC N0.6501分泌獲得。
8.一種製備權利要求1-7任一項所述試紙條的方法，其包括步驟: O製備噴塗有倍他米松單克隆抗體-膠體金標記物的結合物釋放墊； 2)製備具有包被有倍他米松半抗原-載體蛋白偶聯物的檢測線和包被有羊抗鼠抗抗體的質控線的反應膜； 3)將I)和2)製備好的結合物釋放墊、反應膜與樣品吸收墊、吸水墊和底板組裝成試紙條。
9.一種檢測化妝品中倍他米松殘留的方法，其包括步驟: 1)樣本前處理； 2)用權利要求1-7任一項所述的試紙條進行檢測； 3)分析檢測結果。
【文檔編號】G01N33/577GK103940999SQ201310020352
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月19日 優先權日:2013年1月19日
【發明者】何方洋, 萬宇平, 羅曉琴, 吳鵬, 付軍權, 蒲小容, 馮靜, 彭鴿 申請人:北京勤邦生物技術有限公司