一種致病疫黴的lamp檢測引物組合物及其lamp檢測試劑盒和lamp檢測方法
2023-05-11 23:50:11 4
一種致病疫黴的lamp檢測引物組合物及其lamp檢測試劑盒和lamp檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種致病疫黴菌的LAMP檢測引物組合物及其LAMP檢測試劑盒和LAMP檢測方法。該LAMP檢測引物組合物由正向內引物FIP、反向內引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向環引物LB組成。本發明的檢測方法準確性高、特異性強、操作方便、實用性好、實現了恆溫擴增，同時還為致病疫黴菌的檢測提供了新的技術平臺，可用於致病疫黴菌的高靈敏度快速檢測，同時在病害侵染初期鑑定出病原物，能夠對田間土壤中的病原物進行檢測，本發明對馬鈴薯、番茄的晚疫病防治和對減少農藥盲目使用，降低生產成本，減少農藥的環境汙染也具有重要意義。
【專利說明】-種致病疫黴的LAMP檢測引物組合物及其LAMP檢測試劑 盒和LAMP檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及一種致病疫黴的LAMP檢測引物組合物及其 LAMP檢測試劑盒和LAMP檢測方法。
【背景技術】
[0002] 致病疫黴（Phytophthora infetans)是疫黴屬發現的第一個種，能夠引起馬鈴薯 晚疫病，主要侵染馬鈴薯、番茄等多種農作物，造成嚴重減產甚至絕收。馬鈴薯晚疫病是導 致馬鈴薯塊莖腐爛和莖葉死亡的一種毀滅性卵菌病害，是嚴重影響馬鈴薯產量、品質和產 業化發展的世界性病害，1847年在愛爾蘭曾因該病的大發生使馬鈴薯歉收而導致大饑荒。 致病疫黴一直是馬鈴薯和番茄生產上的最嚴重的病害之一，近年來，馬鈴薯晚疫病在我國 有逐年加重的趨勢，其危害性、防治難度及對社會造成的影響已經超過了水稻稻瘟病和小 麥條銹病，被視為世界第一大作物病害，特別是近年來由於抗病品種的推廣、交配型的出現 以及病菌的遷移，新的基因型群體取代了舊的基因型群體，形成了更具侵染力和適合度更 高的生理小種，使得晚疫病的控制異常困難，其危害也越來越嚴重，因此應該引起高度重 視。為了阻止致病疫黴傳播範圍的不斷擴大，使致病疫黴引起的晚疫病得到控制，需要對其 進行快速、準確地檢測。
[0003] 傳統的致病疫黴的分類鑑定主要是基於形態學特徵、致病性測定、生理生化特徵 等。傳統方法在致病疫黴檢測中發揮了重要作用，但是費時費力而且要求操作者具備專業 的疫黴分離、形態學鑑定知識和豐富的經驗。隨著核酸相關的鑑定方法的發展，PCR技術為 植物病原診斷提供了快速、靈敏、準確的優勢，雖然PCR法在特異性和敏感性上有較大的提 高，但是檢測時間仍然比較長，大概4?5h，同時PCR方法依賴精密的溫度循環裝置。其檢 測靈敏度比較高，但是檢測過程複雜，不能滿足快速檢測的需求。
[0004] 環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本 的榮研株式會發明的一種新的核酸擴增技術，因為其操作簡單、快速、特異性高、成本低等 優點，成為可以替代PCR的新的核酸擴增技術。它是針對靶基因的6個區域設計4種特異 的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循環鏈置換反應，60?65°C範圍80min內，大 量合成目標DNA的同時伴隨有副產物--白色的焦磷酸鎂沉澱產生。由於LAMP擴增過程 依賴識別靶序列6個獨立區域，所以反應特異性很強，並且核酸擴增過程是在恆溫條件下 進行，普通水浴鍋或者有穩定熱源的設備就能滿足反應要求，檢測成本大大降低。由於LAMP 反應簡單、快速、高效、經濟等特徵，因而具有極為廣泛的應用前景。自LAMP檢測技術建立 14年以來，該技術已經廣泛應用於對病毒、細菌、寄生蟲、真菌等病原菌的檢測研究，但在植 物病原卵菌的檢測報導很少，致病疫黴菌的檢測國內外均未見報導。
【發明內容】
[0005] 發明目的：針對現有技術中致病疫黴生物學檢測方法所需周期長、檢測方法特異 性差、靈敏度低的問題，本發明的目的是提供一種致病疫黴菌的LAMP檢測引物組合物。本 發明的另一目的是提供上述致病疫黴菌的LAMP檢測試劑盒。本發明還有一目的是提供上 述致病疫黴菌的LAMP檢測方法。
[0006] 技術方案：為了實現上述發明目的，本發明採用的技術方案為：
[0007] -種用於檢測致病疫黴菌的LAMP檢測引物組合物：由正向內引物FIP、反向內引 物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向環引物LB組成；各引物序列具體如下：
[0008] FIP:5， -AATCGCGAAAGCCATGTGAGCCAAACGACCTTTTGTAAGG-3，；
[0009] BIPiSi -TTGCTTAGAAAATCCGTACGATCGGACAAATGTTTTTTTAGCGGC-3/ ；
[0010] F3:5， -TGTGAGTGTCTAACATATTTTACG-3';
[0011] B3 :5，-GTTAGTTAAATAGGAAATCACGC-3，；
[0012] LB:5，-GGCAAGACCATCAAGCTCCAA-S，。
[0013] 所述的LAMP檢測引物組合物在檢測致病疫黴菌的中的應用。
[0014] 一種檢測致病疫黴菌的LAMP檢測試劑盒：包含ImL檢測溶液，所述的檢測溶液包 括：32mM正向內引物FIP、32mM反向內引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM 環引物 LF、8mM 環引物 LB、56mM dNTPs、0. 8M Tris-HC、0. 4mMKCl、0. 4mM(NH4) 2S04、0. 24mM MgS04、4% Triton X-100、Bst DNA polymerase 320 單位，180mM 羥基萘酚藍；其中，各引物 序列具體如下：
[0015] FIP:5， -AATCGCGAAAGCCATGTGAGCCAAACGACCTTTTGTAAGG-3，；
[0016] BIPiSi -TTGCTTAGAAAATCCGTACGATCGGACAAATGTTTTTTTAGCGGC-3/ ；
[0017] F3:5，-TGTGAGTGTCTAACATATTTTACG-3';
[0018] B3:5，-GTTAGTTAAATAGGAAATCACGC-3，；
[0019] LB:5，-GGCAAGACCATCAAGCTCCAA-S，。
[0020] 所述的檢測致病疫黴菌的LAMP試劑盒在檢測致病疫黴菌的中的應用。
[0021] 一種檢測致病疫黴菌的LAMP檢測方法：包括提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA 為模板，利用LAMP檢測引物組合物或LAMP檢測試劑盒進行LAMP ;擴增產物進行瓊脂糖凝 膠電泳，在紫外光下檢測結果，如果存在特徵性階梯狀條帶，則證明所檢測樣品中存在致病 疫黴菌；無特徵性階梯狀條帶，則所檢測樣品中無致病疫黴菌；或觀察LAMP反應溶液顏色 變化，天藍色表示檢測為陽性，存在致病疫黴菌；紫色表示檢測結果為陰性，不存在致病疫 黴菌。
[0022] 所述的檢測致病疫黴菌的LAMP檢測方法：提取待檢微生物的DNA，取1 μ L DNA溶 液，加入23 μ LLAMP試劑盒中的檢測溶液和1 μ L滅菌去離子水進行LAMP，LAMP反應程序 為：6(TC?65°C，55 ?85min。
[0023] 本發明的檢測致病疫黴菌的方法，包括提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA為模 板，利用所述的LAMP引物組合物進行LAMP ;擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下檢 測結果（羥基萘酚藍不會影響電泳結果），如果存在特徵性階梯狀條帶，則證明所檢測樣品 中存在致病疫黴菌；輕基萘酚藍（hydroxylnaphthol blue，HNB)屬於金屬離子指示劑的一 種。HNB是Mg2+的滴定劑，其顏色隨溶液pH變化而改變，因此可以通過監測LAMP反應體系 中Mg 2+濃度的變化及溶液pH而起到顏色指示劑的作用。反應前將HNB加入到反應液中，反 應體系呈紫色，反應過程中Mg 2+與LAMP反應的副產物P2 074_結合產生大量沉澱，溶液中Mg2+ 濃度降低，pH發生變化,從而使HNB的顏色由紫色變為天藍色。因此，反應結束後通過反應 體系的顏色變化，來判斷致病疫黴的有無：天藍色表示檢測為陽性，存在致病疫黴菌；紫色 表示檢測結果為陰性，不存在致病疫黴菌。
[0024] 本發明的關鍵性技術之一是致病疫黴的高效特異擴增的引物序列及其擴增方法。 為了驗證致病疫黴的特異性引物序列，本發明以我國江蘇、山東和福建等省份的30株致病 疫黴菌株和13種其它卵菌以及19種病原真菌為供試材料（表1)，採用CTAB法提取發病組 織中致病疫黴的DNA。具體方法如下：取少量菌絲粉，加900 μ L 2% CTAB提取液和90 μ L 10% SDS，漩渦混勻，於55°C水浴lh，中間每IOmin上下顛倒幾次。12000rpm離心lOmin，取 上清加等體積酚/氯仿/異戊醇（25 :24 :1)，顛倒混勻，12000rpm離心IOmin ;將上清轉移 至新管，加等體積氯仿，輕輕顛倒混勻，12000rpm離心5min。上清轉移至新管中，加2倍體積 的無水乙醇和 1/10 體積的 3M NaAc (pH 5. 2)，-20°C沉澱（>lh)。12000rpm 離心 IOminJtIi 去上清，沉澱用70%乙醇洗滌兩次，室溫晾乾。加適量滅菌超純水或TE (pH 8.0)溶解沉澱 (含20μ8/ιΛ RNase)，37°C處理Ih後，-20°C保存備用。所有的土壤樣品採用FastDNAw SPIN試劑盒（Q-Biogene Ltd, USA)進行DNA的提取。土壤DNA提取步驟參見試劑盒說明 書。這一商用土壤微生物DNA提取試劑盒可以在0. 5h內提取到土壤中的微生物。
[0025] 當發生LAMP擴增反應時，產生大量的焦磷酸鎂白色沉澱導致反應液的濁度上升， 通過HNB的顯色反應結果所示，致病疫黴菌的反應管均呈天藍色，其為陽性結果，而其它疫 黴種、真菌、腐黴和陰性對照菌反應管均呈紫色，為陰性結果，證明所設計的LAMP特異性引 物具有種的特異性。同時，反應產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，成像觀察擴增的反應產物，致 病疫黴菌的反應管中的反應液出現了典型階梯形狀條帶，而其它疫黴種、真菌、腐黴和陰性 對照菌反應管沒有出現梯形條帶。這說明該引物組可被用於生產實踐中發病組織及土壤中 致病疫黴菌的快速可靠的檢測盒鑑定。當用於發病組織中存在致病疫黴菌時，採用NaOH快 速裂解法提取致病疫黴菌的DNA，具體過程如下：取一段發病的植株組織，每毫克組織加入 IOyL 0. 5M NaOH，在研缽中充分研磨後轉移至1.5mL的EP管中，12000rpm離心5min，取 5yL上清液加入495yL 0. ImM Tris(pH8. 0)，混勻後取IyL直接用於PCR反應。每個反 應至少重複三次，同時為確定植株中無 PCR抑制物存在。
[0026] 表1用於檢測致病疫黴特異性的真菌和卵菌菌株
[0027]
【權利要求】
1. 一種用於檢測致病疫黴菌的LAMP引物組合物，其特徵在於：由正向內引物FIP、反向 內引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向環引物LB組成；各引物序列具體如下 ： FIP:5, -AATCGCGAAAGCCATGTGAGCCAAACGACCTTTTGTAAGG-3,; BIP:5' -TTGCTTAGAAAATCCGTACGATCGGACAAATGTTTTTTTAGCGGC-3'; F3:5' -TGTGAGTGTCTAACATATTTTACG-3'; B3:5' -GTTAGTTAAATAGGAAATCACGC-3^ ; LB:5, -GGCAAGACCATCAAGCTCCAA-3,。
2. 權利要求I所述的LAMP引物組合物在檢測致病疫黴菌的中的應用。
3. -種檢測致病疫黴菌的LAMP試劑盒，其特徵在於：包含ImL檢測溶液，所述的檢測 溶液包括：32 mM正向內引物FIP、32 mM反向內引物BIP、8 mM正向外引物F3、8 mM反向外 引物B3、8 mM環引物LB、56 mM dNTPs、0.8 M Tris-HC、0.4 mM KC1、0.4 mM (NH4)2S04、0.24 mM MgS04、4%Triton X-100、Bst DNA polymerase 320 單位，180mM 羥基萘酚藍；其中，各引 物序列具體如下： FIP:5, -AATCGCGAAAGCCATGTGAGCCAAACGACCTTTTGTAAGG-3,; BIP:5' -TTGCTTAGAAAATCCGTACGATCGGACAAATGTTTTTTTAGCGGC-3'; F3:5' -TGTGAGTGTCTAACATATTTTACG-3'; B3:5' -GTTAGTTAAATAGGAAATCACGC-3^ ; LB:5, -GGCAAGACCATCAAGCTCCAA-3,。
4. 權利要求3所述的檢測致病疫黴菌的LAMP試劑盒在檢測致病疫黴菌的中的應用。
5. -種檢測致病疫黴菌的方法，其特徵在於：包括提取待檢微生物的DNA，以提取的 DNA為模板，利用LAMP引物組合物或LAMP試劑盒進行LAMP ;擴增產物進行瓊脂糖凝膠電 泳，在紫外光下檢測結果，如果存在特徵性階梯狀條帶，則證明所檢測樣品中存在致病疫 黴；無特徵性階梯狀條帶，則所檢測樣品中無致病疫黴；或觀察LAMP反應溶液顏色變化，天 藍色表示檢測為陽性，存在致病疫黴；紫色表示檢測結果為陰性，不存在致病疫黴菌。
6. 根據權利要求5所述的檢測致病疫黴菌的方法，其特徵在於：提取待檢微生物的 DNA，取I ii L DNA溶液，加入23 ii LLAMP試劑盒中的檢測溶液和I ii L滅菌去離子水進行 LAMP，LAMP反應程序為：60°C?65°C，55~85min，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下 檢測結果。
【文檔編號】C12R1/645GK104313175SQ201410639817
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月13日 優先權日:2014年11月13日
【發明者】戴婷婷, 鄭小波, 吳小芹 申請人:南京林業大學