利用包含非編碼可檢測標記的質量標籤試劑進行的分析物測定的製作方法
2023-05-11 22:32:26
專利名稱::利用包含非編碼可檢測標記的質量標籤試劑進行的分析物測定的製作方法
技術領域:
:本發明涉及與使用質鐠技術進行分析物測定相關的方法、混合物、試劑盒和組合物。
背景技術:
:本發明涉及通過質譜分析來測定分析物。在多個實施方案中,所M譜分析可以與電泳分離技術聯用。分析物可以是任何目的分子。(天然和/或合成)分析物的非限制性實例包括但不僅限於蛋白質、肽、核酸、糖、脂質、胺基酸、維生素、類固醇、前列腺素類和/或其它質量小於1500道爾頓(Da)的小分子。可使用獨特的標記試劑來測定分析物,所述標記試劑使得能夠對複雜混合物中的分析物進行相對和/或絕對定量。所述標記試劑可在同分異構和/或同量異位(isobaric)組中使用以分析複雜的樣品混合物,其中所述標記試劑可以是同分異構的和/或同量異位的。下述同分異構和/或同量異位標記試劑是已知的,其包含報告物部分、平衡物(或連接物)部分和反應基團,其中在該組成物的與分析物反應後的形式中所述反應基團可被該分析物取代。包含這三種要素的標記試劑和被標記分析物的實例例如已經公開於以下文獻中已公開的共同未決並且共同擁有的美國專利申請序列號US2004-0219685Al、US2005-0114042Al、US2005-0147982Al、US2005-0147985Al、US2005-0147987Al、US2005-0148771Al、US2005-0148773Al和US2005-0148774Al。同分異構和/或同量異位標記試劑組可用於標記例如兩種或更多種不同樣品的分析物,其中組中的不同標記試劑均具有相同的粗略質量(grossmass),但可以獨特地編碼每種l艮告物部分,使得該組中的每種報告物部分具有獨特的粗略質量並產生具有獨特粗略質量的相應特徵離子(signatureion)。由於該組中所有的試劑均具有相同的粗略質量但包含獨特粗略質量的報告物部分,因此所述平衡物(或連接物)部分一般(但不一定)也包含一個或多個重原子同位素,由此來"平衡"每種獨特才艮告物的質量,使得該組中每種報告物/連接物組合具有相同的粗略質量。本文描述了可在同分異構和/或同量異位組中使用的新標記試劑,其中所述標記試劑包含非編碼的可檢測標記。圖la展示了本發明示例性標記試劑(和被標記分析物)的要素以及關於該分子在質鐠儀中可能的斷裂特徵的一些信息。如圖所示,連接物部分可以線性或分支模式與標記試劑(或被標記分析物)的要素連接。在同分異構和/或同量異位組中使用時,組中標記試劑的多種非編碼可檢測標記可以全部均具有以下特徵1)可獨立檢測;2)包含相同的粗略質量;和3)包含相同的淨電荷。因此,本文公開的標記試劑可同時包含可通過非質鐠方法獨立檢測的部分以及可在質鐠儀中獨立檢測的不同部分。特別地,本文所述的新標記試劑可用於例如與質譜分析聯用的電泳分離方法中,其中所述非編碼可檢測標記的特性可用於在電泳分離時和/或電泳分離後定位和/或定量被標記分析物的混合物,並且其中質鐠法可用於鑑定和/或定量樣品中的目的分析物或其片段。在一些實施方案中,所述標記試劑和/或被標記分析物可以是與支持物結合的。圖lb展示了本發明示例性的與支持物結合的標記試劑(和與支持物結合的被標記分析物)的要素以及關於該分子在質鐠儀中斷裂特徵的一些信息。如圖所示,連接物部分可以線性或分支模式與支持物上結合的標記試劑(或與支持物結合的被標記分析物)的要素連接。本發明的實施方案特別適用於複雜樣品混合物的多重分析。例如,本發明的一些實施方案可用於蛋白質組分析和/或基因組分析以及用於與基因組和/或蛋白質組分析相關的關聯性研究。本發明的一些實施方案可用於小分子分析,例如脂質、類固醇、維生素、前列腺素和/或M酸分析。可以使用同分異構和/或同量異位試劑的實驗分析包括但不僅限於時程研究、生物標記研究、多重蛋白質組分析、多維蛋白質鑑定技術實驗(mudpitexperiment)、親和捕獲測定(affinitypull-down)、翻譯後修飾(post-translationalmodification,PTM)測定(參閱如已公開的美國專利申請No.US2005-0208550Al)和多重對照實驗。本領域技術人員會理解,下文描述的附圖僅用於說明目的。這些附圖並不旨在以任何方式限制本發明教導的範圍。圖la是以其要素形式表示的示例性標記試劑的多種斷裂特徵的圖示。圖lb是以其要素形式表示的示例性的與支持物結合的標記試劑的特定斷裂特徵的圖示。圖2a是以通式表示的多種標記試劑的特定斷裂特徵的圖示。圖2b是多種標記試劑的特定斷裂特徵的圖示。圖2c是多種標記試劑的特定斷裂特徵的圖示。圖3a是以通式表示的多種被標記分析物的特定斷裂特徵的圖示。圖3b是多種被標記分析物的特定斷裂特徵的圖示。圖3c是多種與支持物結合的被標記分析物的特定斷裂特徵的圖示。圖3d是已從固相支持物上釋放的多種被標記分析物的特定斷裂特徵的圖示。圖4a是示例性同量異位化合物的圖示。圖4b是示例性同分異構同量異位化合物的圖示。圖5是可由某些基於N-甲基P底喚的報告物部分產生的多種可能的報告物離子(特徵離子)的圖示。圖6是使用與支持物結合的標記試劑來製備與支持物結合的被標記分析物、1^從該固相支持物上釋放所示被標記分析物的方法的圖示。圖7是合成多種活性酯的方案的圖示。圖8a是用於式II和III標記試劑的可能的同位素編碼策略的圖示。圖8b是用於式ir和nr標記試劑的可能的同位素編碼策略的圖示。圖9a展示了代表性標記試劑的預計合成途徑的一部分。圖9b展示了代表性標記試劑的預計合成途徑的其餘部分(相對於圖9a)。圖10a至10d展示了合成編碼的N-Fmoc、N,-甲基乙基二胺的多個步^^。圖11展示了合成經編碼的報告物/連接物部分的一部分。圖12展示了合成經編碼的報告物/連接物部分的一部分。圖13a展示了代表性標記試劑的預計合成途徑的一部分。圖13b展示了代表性標記試劑的預計合成途徑的其餘部分(相對於圖13a)。圖14展示了所提出的非編碼可檢測標記的合成途徑。本申請中引用的所有文獻和類似材料(包括但不僅限於專利、專利申請、文章、書籍、論文和網頁)無論其形式如何均明確地通過參考整體併入本文用於任何和所有目的。定義A於v^^^:說坊4^芽^,摔炎^7"迷定義/^:^適^W,^^^語^摔逸括4《炎多^;,乂之。A於)醉禪^:說銀泉炎^^^^我w要《力'殆厚辨,在錄7迷定乂與任它爻斧廣逸括為摩才芽辨w任^r遞過參孝^A本^:辨^:斧,尹該詢語^法^^敎辨橫況T,摔,惑^i"r迷定乂^^,餘#銀確措^*反辨含義^辨如在席斧處初炎^該4語時義斧^義本丈#"4"辨^法看措"斧/4",餘#^#說坊4者4炎>^"々/減"坊i不合適的緣況T。本義中不^數量艱定^者炎^"一"廣V,9^;t措"一個4,個",餘#^#說銀44^炎>^"一個4/個"適^',況T。"6括"、"逸舍",^r互^炎^,##砉4艱夢/。#,在一個4>個,滋才黃種潘迷#炎^7^語"6含"辨',況7,本銀試戎術乂^摔^^^^,在一些4傳緣況T,摩迷關滋才黃^r炎^語擴"#丄洽...逸成";^/4"由…i成"4^^迷。還應^理莽,4一些姿滋才黃哞,5^紫辨義一減迷^f^些動羋付^:^並不^"要,^要本發'勞辨教f^^r,滋,就^f。而i,在一些-滋才黃尹'^"以^^進^兩個或^,個翔4動來a)本文使用的"分析物"指可以測定的任何目的分子。分析物的非限制性實例包括但不僅限於蛋白質、肽、核酸(例如DNA或RNA)、JLS^酸、糖、脂質、類固醇、維生素(例如維生素D2(有時稱為麥角鈣化醇)、維生素D3(有時稱為膽釣化醇)、維生素82、維生素B6、維生素A、維生素A2、維生素E、維生素K及^f《謝物)、前列腺素和其它W量低於1500道爾頓(Da)的小分子。分析物的來源或含有分析物的樣品並無P艮制,因為它可來自,來源。所述分析物可以是天然或合成的。分析物的來源或含有分析物的樣品的非限制性實例包括但不僅P艮於細胞或組織或者其培養物(或其繼代培養物)。分析物來源的非限制性實例包括但不僅限於粗製或經處理的細胞裂解物、體液、組織提取物、細lfe^取物或者分離處理(例如色鐠分離、1D電泳分離、2D電泳分離或毛細管電泳分離)的級分(或部分)。體液包括但不僅限於血、尿、排洩物、M液、腦液、羊水、淋巴液或來自腺體分泌物的流體。我們用"經處理的細胞SJ^物"*^示除了^#細;3^斤需的處理以夕卜,該細胞^物ai^h理以對收集的材^Mi行其它處理。例如,所述樣品可以是包含一種或多種分析物的細胞絲物,所述分析物A^—種或多種蛋白7jC解缺理所述細胞^J^物以消化前體JMW或蛋白質而形成的。b)除了在其使用語境中明確表示並非如此以外(例如提到其它的特定結構時),"酯"表示酯和/或;危酯。c)本文使用的"可切割連接物"指與固相支持物共價連接的部分,它將標記試劑或被標記分析物與支持物可切割地連接起來,其中所述可切割連接物中的至少一個鍵可通過光、熱或化學試劑(為消除疑義,"化學試劑"旨在包括酶)處理進行切割,從而從該支持物上釋放該標記或被標記分析物或者其片段。d)本文使用的"斷裂"指共價鍵的斷開。e)本文使用的"片段"指斷裂產物,或"斷裂"指導致斷裂的^Mt。i)本文使用的"7JC合物形式"指化合物的任何水合狀態或者化合物的多於一種水合狀態的混合物。例如,本文所述標記試劑可以是半7JC合物、一水合物、二7jc合物等。此外,例如,本文所述標記試劑的樣品可以同時包含一水合物、二水合物和半水合物的形式。g)本文使用的滷素基團或滷素指-F(氟)、-C1(氯)、-Br(溴)或-I(碘)。h)本文中涉及化合物使用時,"同位素富集的"指富集了一種或多種重原子同位素(例如穩定同位素,例如氘(即2H)、13C、15N、lsO、MS、37C1或"Br)的4t^(例如才射己試劑)。同位素富集的4t^可以是以合成方式富集的。在一些實施方案中,也可以^^不穩定的同位素(例如"C或311)。"富集的,,指重原子同位素的量超過了天然同位素豐度。在多個實施方案中,同位素富集的^^可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個同位素富集位點。由於同位素富集不是100%有效,因此化合物樣品中可能有富集程度較低並具有較低質量的雜質。類似地,由於過富集(例如不想要的富集)和天然同位素豐度,化合物樣品中可能有質量較大的雜質。在一些實施方案中,每種摻入的重原子同位素在同位素富集位點可以至少80%的同位素純度存在。在一些實施方案中,每種摻入的重原子同位素在同位素富集位點可以至少93%的同位素純>^存在。在一些實施方案中,每種摻入的重原子同位素在同位素富集位點可以至少96%的同位素純度存在。在一些實施方案中,每種摻入的重原子同位素在同位素富集位點可以至少98%的同位素純度存在。i)本文使用的"同位素富集位點"指化合物中重原子同位素替代輕形式原子(例如13C替代12C、180替代"O、15N替代"N或者氘替代氫)的位置。j)本文中涉及化合物時使用的"輕"指該化合物未富集重原子同位素。本文中涉及原子時使用的"輕"指該原子的最低質量同位素。本文中涉及化合物時使用的"重"指該化合物富集了至少一種重原子同位素。本文中涉及原子時使用的"重"指該原子的重質量同位素。k)本文使用的"標記試劑,,指適於標記分析物以用於測定的部分。術語"標記"與術語"標籤"和"標誌"以及其它等同術語及短語意義相同。例如,被標記分析物也可以稱為有標籤的分析物或有標誌的分析物。因此,術語"標記"、"標籤"、"質量標籤"、"標誌"和這些術語的衍生形式是等同的並可互換,指適於對分析物進行標記或標誌以用於測定的部分。有時,標記試劑可稱為標籤試劑或質量標籤試劑。1)本文使用的"天然同位素豐度"指基於同位素在自然界中的天然出現率而可見於化合物中的一種或多種重同位素的水平(或分布)。例如,得自活植物材料的天然化合物可含有約1.08%的13C(相對於12C)。m)本文使用的同量異位物是具有相同標稱粗略質量而在結構上不可區分(除了同位素含量和/或重原子同位素分布以外)的化合物。為消除任何疑義,圖4a的化合物1-4就本文所述定義而言是同量異位的。相比之下,本文使用的同分異構體是具有相同標稱粗略質量而在結構上可區分的化合物。示例性異構的同量異位物示於圖4b。n)本文使用的"支持物"、"固相支持物"、"固相載體"或"樹脂"指任何固相材料。固相支持物涵蓋諸如"支持物"、"合成支持物"、"固相"、"表面"、"膜"和/或"支持物"的術語。固相支持物可由有機聚合物構成,例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯醚和聚丙烯醯胺以及它們的共聚物和接枝物。固相支持物還可以是無機的,例如玻璃、二氧化矽、可控孔徑玻璃(controlled-pore-glass,CPG)或者>^相二氧化珪。固相支持物的構造可以為珠、球、微粒、顆粗、凝膠、膜或表面的形式。表面可以是平的、基本平的或者是不平的。固相支持物可以是多孔的或者不是多孔的,並可具有膨脹或非膨脹的特徵。固相支持物可以構建為孔、凹坑或其它容器、管、圖案或單元的形式。多個固相支持物可以設置為不同位置上的陣列,其對試劑的自動遞送是可尋址的,或者通過檢測方法和/或設備而尋址。o)本文使用的"與支持物結合"指以共價方式固定在固相支持物上的化合物。p)本文使用的"樣品或其級分"或"樣品級分"可用於表示樣品的級分。該樣品的級分可通過簡單地取出樣品的級分來產生,或者可通過實施使樣品分成兩個或更多個級分的分離方法來產生。除非i兌明書的內容表明為其它含義,否則這些短語均為等同的並可互換,指以任一類型方法來產生樣品的級分(或部分)。q)本文使用的"特徵離子"和"報告物離子"可互換,均指在質鐠儀中通過斷裂標記試劑或被標記分析物而由報告物部分產生的具有獨特質量的特徵離子。特徵離子或報告物離子可用於鑑定用於標記分析物的獨特標記試劑,並可將其在MS/MS分析中的峰強度與所分析樣品(或其級分)中所存在的被標記分析物的量相關聯。本文使用的特徵離子或報告物離子有時僅稱為報告物。本文所使用的報告物部分有時也僅僅指報告物。應該理解,報告物部分指連接在標記試劑、被標記分析物或其片段上的基團,而才艮告物離子指在連接該報告物部分與所述標記試劑、被標記分析物或其片段的鍵斷^所產生的片段離子。因此,使用"報告物"的情況表示其暗含的含義。還應該理解,短語"獨特的報告物部分"與"獨特質量的報告物部分"是等同的並可互換,而"獨特的報告物離子"或"獨特的特徵離子"則與"獨特質量的報告物離子"或"獨特質量的特徵離子"是等同的並可互換。r)本文使用的術語"鹽形式"包括化合物的鹽或化合物鹽的混合物。此外,化合物的兩性形式也包括在術語"鹽形式,,中。具有胺或其它鹼性基團的化合物的鹽可通過例如與合適的有機酸或無機酸(比如鹽酸、氫溴酸、醋酸、高氯酸等,包括其任意組合)反應得到。具有季銨基團的化合物還可含有反陰離子,比如氯離子、溴離子、碘離子、乙酸根、高氯酸根等(包括其任意組合)。具有羧酸或其它酸性官能團的化合物的鹽可通過使所述化合物與合適的鹼(例如氫氧化物鹼)進行反應而製得。因此,酸性官能團的鹽可具有反陽離子,例如鈉、鉀、鎂、釣等(包括其任意組合)。s)本文使用的術語"類固醇"旨在包括但不僅限於皮質醇、11-去氧皮質醇(化合物S)、皮質酮、睪酮、表睪酮、去氧甲基睪酮、四氫孕三烯酮(THG)、雌二醇、雌酮、4-羥基雌酮、2-甲H&雌酮、2-羥基雌酮、16-酮基雄二醇、16a-羥基雌酮、2-羥基雌酮-3-甲醚、潑尼松、潑;M^龍、孕烯醇酮、孕酮、去氫表維酮(DHEA)、170H孕烯醇酮、170H孕酮、170H孕酮、雄酮、表雄酮、A4雄烯二酮(D4A)、豆甾醇、以及膽固醇。t)本文使用的"合成化合物"指通過對過程進行操作(包括操作天然存在的途徑)而產生的化合物。因此,可使用合成化學技術產生合成化合物。然而,本文使用的"合成化合物"還旨在包括通過例如酶促方法產生的化合物,所述方法包括如向生物(如細菌或酵母)中添加同位素富集的化合物,所述同位素富集的化合物可改變它們從而產生本文所述同位素富集的標記試劑或該標記試劑的中間體。u)本文使用的"以合成方式富集"或"合成富集"指操作合成或天然方法來產生合成化合物,例如本文所述同位素富集的標記試劑或所述標記試劑的中間體。v)公認的是,原子或分子的質量可以取近似,常近似到最接近的整數原子質量單位或最接近的原子質量單位的十分之一或百分之一。本文中所用的"粗略質量"指在一定範圍內的絕對質量和近似質量,在所述範圍內使用質量接近的不同原子類型的同位素,使得對於平衡所述報告物和/或連接物部分的質量的目的(使得在同分異構和/或同量異位的標記試劑的組和試劑盒中所述報告物/連接物組合的粗略質量是相同的)它們在功能上是等價的,而不論所用的不同同位素類型在質量上的極小差異是否能被檢測到。例如,常見的疏同位素的粗略質量為32(實際質量31.9720)和34(實際質量33.9678),常見的氧同位素的粗略質量是16.0(實際質量15.9949)和18.0(實際質量17.9992),常見的碳同位素的粗略質量是12.0(實際質量12.00000)和13.0(實際質量13.00336),最常見的氮同位素的粗略質量是14.0(實際質量14.0031)和15.0(實際質量15.0001)。雖然這些值是近似的,但本領域技術人員將會理解,如果在組中一種標記的同位素富集位點使用180同位素(或34S同位素),則(比粗略質量16.0的氧同位素)多出的兩個質量單位可在例如含有160(或"S同位素)的不同標己中以如下方式進行4卜償,即在該標記中的其它位點摻入兩個碳13C原子來代替兩個12C原子、摻入兩個151>[原子來代替兩個14]\原子,或者甚至摻入一個"C原子和一個151\原子來代替一個12C和一個14N,來補償所述18CX或34S同位素)。這樣,該組中兩種不同的標記可具有相同的粗略質量,因為使用兩個碳"C原子(代替兩個"C原子)、兩個"N原子(代替兩個"N原子)、一個"C原子和一個15N原子(代替12C和"N)或者使用一個180原子(代替一個"O原子,或者用一個"S代替一個^S)的實際差異極小,這樣在該組或試劑盒的所有標記中實現2道爾頓的質量增加,而不損害該分析的性質。這可參考圖4a來說明。在圖4a中,化合物3(圖4a;分子式C513CHu15N20)的報告物/連接物組合含有兩個15N原子和一個13C原子,總理論質量為130.085。相比之下,同量異位物1(圖4a;分子式C,CHnN0)含有一個MO和一個"C,總理論質量為130.095。儘管報告物/連接物部分可存在輕微的^J"質量差異(質量分別為130.095和130.085),但^ft^物1和3可以是^重原子同位素含量不同而在結構上不可區分的同量異位物。然而,化合物1和3的才艮告物/連,部^^t^發明目的而言的^as^質量均為130.1,因為無論質i棘的靈^A否足以測量同量將物1和3所產生報告物離子之間^t質量的微小差異,姊不損害分析。參考圖4b類^i^說明了兩種同分異構試劑,其中化^詠5和6中報告物/連,部分的質量分別為144.111和144.100。對於本發明目的,這些^^的報告物/連,部分的粗略質量均為144.1,因為無論質i沐的靈lt^l否足以測量4^物5和6所產生報告物離子之間鍵對質量的微小差異,i^P不損害分析。從圖4a和圖4b中可明顯看出,結構中相同重原子同位素的分布不是產生同分異構和/或同量異位標記試劑組時的惟一考量因素。有可能混合重原子同位素的類型來實現期望粗略質量的同分異構體和/或同量異位物。這樣,重原子同位素的選擇(組合)及其分布在產生可用於本發明實施方案的同分異構和/或同量異位標記試劑時都可以考慮。W)本文使用的術語"烷基"指完全飽和的直鏈或支鏈的C2-Q烴或環狀CVC8烴(即環烷基例如環丙基、環丁基、環戊基、環己基或環己基亞曱基(cyclohexylmethylenegroup))。本文使用的術語"烷基,,指可以被取代或未取代的基團。在一些實施方案中,術語"烷基"還旨在表示烷基鏈中一個或多個亞曱基被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替換的化合物。在一些實施方案中,烷基可以是完全飽和的直鏈或支鏈的c2-c6烴或環狀cvc6烴。x)本文使用的術語"亞烷基"指包含連接至少兩個部分的至少兩個連接點的直鏈或支鏈的烷基鏈或環狀烷基(例如-(CH+(亞甲基)、-{CH2CH2}-(亞乙基)、CH3等,其中大括號表示連接點。在本文中使用時,術語"亞烷基"指可以被取代或未取代的基團。在一些實施方案中,術語"亞烷基"還旨在表示亞烷基的烷基鏈中一個或多個亞甲基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替換的化合物。在一些實施方案中,亞烷基可以是CVd。烴。在一些實施方案中,亞烷基可以是CVC6烴。y)本文使用的術語"烯基,,指包含一個或多個雙鍵的直鏈或支鏈的CrC8烴或環狀CVCs烴。在本文中使用時,術語"烯基"指可以被取代或未取代的基團。在一些實施方案中,術語"烯基"還旨在表示烯基的烷基鏈中一個或多個亞甲基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替換的化合物。在一些實施方案中,烯基可以是包含一個或多個雙鍵的直鏈或支鏈的CrC6烴或環狀CVC6烴。z)本文使用的術語"亞烯基"指包含連接至少兩個部分的兩個連接點的烯基。在本文中使用時,術語"亞烯基"指可以被取代或未取代的基團。在一些實施方案中,術語"亞烯基"還旨在表示亞烯基的烷基鏈中一個或多個亞曱基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替換的化合物。aa)本文使用的術語"炔基"指包含一個或多個三鍵的直鏈或支鏈的CrC8烴或環狀C3-Q烴。在本文中使用時,術語"炔基"指可以被取代或未取代的基團。在一些實施方案中,術語"炔基"還旨在表示炔基的烷基鏈中一個或多個亞甲基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替換的化合物。在一些實施方案中,炔基可以是包含一個或多個三鍵的直鏈或支鏈的CrC6烴或環狀CVQ烴。ab)本文使用的術語"亞炔基"指包含連接至少兩個部分的兩個連接點的炔基。在本文中使用時,術語"亞炔基"指可以被取代或未取代的基團。在一些實施方案中,術語"亞炔基"還旨在表示亞炔基的烷基鏈中一個或多個亞曱基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替換的化合物。ac)本文使用的術語"脂肪族"指如上文定義的任何直鏈、支鏈或環狀的烷基、烯基和炔基部分。在本文中使用時,術語"脂肪族"指可以被取代或未取代的基團。ad)本文使用的術語"芳基"(單獨的或作為其它部分的一部分(例如芳基烷基等))指碳環芳族基團,例如苯基。芳基還包括稠環多環芳環系,其中碳環芳環與另一碳環芳環稠合(例如l-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基等),或者碳環芳環與一個或多個碳環非芳環稠合(例如四氫亞萘基、茚滿基等)。本文使用的術語"芳基"指可以被取代或未取代的基團。ae)本文使用的術語"雜芳基"指包含l、2、3或4個雜原子的芳族雜環,所述雜原子各自獨立地選自氮、硫和氧。本文使用的術語"雜芳基"指可以被取代或未取代的基團。雜芳基可以與一個或兩個環(如環烷基、芳基或雜芳基環)稠合。雜芳基與分子連接的點可以在雜芳基、環烷基、雜環烷基或芳基環上,所述雜芳基可通過碳或雜原子連接。雜芳基的實例包括咪唑基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、異喁唑基、異噻唑基、噻二唑基(thiadiazolyl)、^二唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、喹啉基、異喹啉基、吲唑基、苯並喁唑基、苯並異喁唑基、苯並呋喃基、苯並噢唑基、中氮茚基(indolizinyl)、咪唑並吡咬基、吡唑基、三唑基、嚅唑基、四唑基、苯並咪唑基、苯丙異噻唑基、苯並噻二唑基、苯丙嚅二唑基、吲哚基、四氫吲咮基、氮雜吲哚基、咪唑並吡咬基、查唑啉基、嘌呤基、吡咯並[2,3嘧咬基、吡唑並[3,4嘧啶基或苯並(b)噻吩基,它們均任選地可被取代。af)本文使用的術語"亞芳基"指包含連接至少兩個部分的至少兩個連接點的芳基或雜芳基(例如亞苯基等)。亞芳基與碳環非芳環稠合的連接點可以在芳環或非芳環上。本文使用的術語"亞芳基,,指可以被取代或未取代的基團。ag)本文使用的術語"芳基烷基"指通過亞烷基連接物連接至另一部分的芳基或雜芳基。本文使用的術語"芳基烷基"指可以被取代或未取代的基團。在一些實施方案中,術語"芳基烷基"還旨在表示芳基烷基的烷基鏈中一個或多個亞甲基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替換的化合物。ah)本文使用的術語"芳基亞烷基,,指具有連接至少兩個部分的至少兩個連接點的芳烷基。第二個連接點可以在芳環或亞烷基上。本文使用的術語"芳基亞烷基"指可以被取代或未取代的基團。在一些實施方案中,術語"芳基亞烷基"還旨在表示芳基亞烷基的烷基鏈中一個或多個亞甲基(如果有的話)被雜原子(如-O-、-Si-或-S-)替換的化合物。當芳基亞烷基發生取代時,取代基可以在該芳基亞烷基的芳環或亞烷基部分中的一個或兩個上。ai)本文使用的術語"任選取代的"以及"取代或未取代的"是等同的並可互換。任何烷基、亞烷基、烯基、亞烯基、炔基、亞炔基、芳基、芳基烷基、亞芳基、雜芳基或芳基亞烷基的合適取代基包括在本發明實施方案所用反應條件下穩定的任何取代基。合適取代基的非限制性實例可包括烷基(如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、環己基等)、g代烷基(如三氟甲基、2,2,2-三氟乙基等)、烷氧基(如曱氧基、乙氧基等)、芳基(如苯基)、芳基烷基(如節基)、硝基(-NOj、氰基(-CN)、季銨氮原子或滷素基(如氟、氯、溴和/或碘)。此外,烷基、亞烷基、烯基、亞烯基、炔基、亞炔基、芳基、芳基烷基、亞芳基、雜芳基或芳基亞烷基的一部分可任選地被=0或-S取代。aj)本文使用的術語"活性酯"指在鹼性條件下易於與胺、醇和某些硫醇反應以分別提供醯胺、酯和硫酯的化合物。還可參考LeoAPaquette,^EVicj;c/o/7ei/,Vi</及eflgewto6^"w/ciS^fi^s/s1,岸2巻JohnWileyandSons,NewYork,1995作為活性酯是有機化學領域的公認術語的證據。ak)本文使用的術語"雜環"指在環中包含至少兩種不同元素的任何環狀分子結構。還可參考Ox/on/D/"/o麗fj^BiVc/re附/欲j;楊/ecw/"r所o/收y,OxfordUniversityPress,Oxford,1997作為雜環是有機化學領域的公認術語的證據。al)本文使用的術語"離去基團"指在取代或置換反應中從被認為是反應底物的殘基或主要部分上離去的任何帶電或不帶電的原子或基團。還可參考Ox/on/Z)/c"Vw"ij5iVc/re挑f's^vMo/ec"/flr必/(/o^j,OxfordUniversityPress,Oxford,1997作為離去基團是有機化學領域的公認術語的證據。am)本文使用的術語"保護基團"指與分子中的官能團反應並結合從而防止該官能團參與該分子的後續反應的化學基團,所述基團隨後可被除去,從而重新產生非保護的官能團。還可參考OK/iw^Z)/",V麗o;o/5Zoc/rewi&^jfl/irfMo/ecw/flf5iV/o^y,OxfordUniversityPress,Oxford,1997作為保護基團是有機化學領域的公認術語的證據。多個實施方案描述^該理席,r"jt"凝迷"章^—辨:^論^r,及本^:^時/神泉遂才隸f辨一些^全卑。/森迷標記試劑如上文所述,使用質鐠法對分析物進行分析時可使用的標記試劑可包括報告物部分、平衡物部分(或連接物部分)和反應基團。本文所述的新標記試劑還可包含至少一個非編碼可檢測標記,例如生色團、螢光團、自旋標記(spinlabel)、酶或化學發光化合物,在一些實施方案中可由式I表示,formulaseeoriginaldocumentpage33包括其鹽形式和/或水合物形式。RG是下文更詳細描述的反應基團。RP是下文更詳細描述的報告物部分。DL是非編碼可檢測標記。LK是下文更詳細描述的連接物部分。X是下文更詳細描述的共價鍵。Y和W各自獨立地是下文更詳細描述的共價鍵或連接基團,m和n各為0或1,條件是m+n=l。在一些實施方案中,所述標記試劑可以是與支持物結合的。因此,在一些實施方案中,所述標記試劑可由通式rs表示,formulaseeoriginaldocumentpage33包括其鹽形式和/或水合物形式。RG是下文更詳細描述的反應基團。RP是下文更詳細描述的報告物部分。DL是非編碼可檢測標記。LK是下文更詳細描述的連接物部分。SS是通過下文更詳細描述的可切割連接物與該標記試劑的報告物部分"RP"共價連接的固相支持物。X是下文更詳細描述的共價鍵。Y和W各自獨立地是下文更詳細描述的共價鍵或連接基團,m和n各為0或l,條件是m+n-l。反應基團多個實施方案中所使用標記試劑的反應基團(有時以縮寫"RG,,代表)可包含能與樣品中一種或多種反應性分析物的一個或多個官能團反應的任何親電或親核基團。反應基團與分析物的官能團反應,從而將該分析物與標記試劑共價連接。因此,每種標記試劑能與樣品中一種或多種反應性分析物反應,從而形成一種或多種來自該樣品的被標記分析物。應該理解,在一些實施方案中,反應基團應認為是包括與連接物部分(即平衡物部分)相連的原子或基團。例如,如果反應基團是活性酯或羧醯卣化物基團(carboxylicacidhalide),則在一些實施方案中,該活性酯或羧醯卣化物的羰基也可以考慮與所述連接物部分相連,這是為了在標記試劑和被標記分析物中均存在羰基碳的一組同分異構和/或同量異位標記試劑中平衡報告物部分的質量。這在一組同分異構和/或同量異位標記試劑中一些或全部標記試劑中所包含的羰基中含有重原子同位素時通常是顯而易見的。因此,在一些實施方案中,反應基團可理解成僅代表反應基團的離去基團;而在另一些實施方案中,反應基團可包含與連接物部分相連的其它原子或部分。因此,應該理解,當反應基團表示為一些下文所述具體部分時,分析物可以通過一個或多個其它原子或基團與連接物部分(即平衡物部分)連接,所述其它原子或基團可被認為或不可被認為是該連接物部分的一部分均可。反應基團可以是預先存在的,或者可以原位製備。可在不存在反應性分析物的情況下進行或者可以在反應性分析物存在下進行反應基團的原位製備。例如,可以用水溶性碳二亞胺(如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽;EDC)原位修飾羧酸基,由此製備可與親核體(如分析物的烷基或芳基氨基)反應的親電基團。在一些實施方案中,可在存在含有胺(或其它親核體)的分析物的情況下用EDC對標記試劑中羧酸基進行活化。在一些實施方案中,還可以在用EDC進行起始反應後加入含有胺(或其它親核體)的分析物。在另一些實施方案中,可以通過原位除去保護基團在原位產生反應基團。因此,可通過親核和/或親電反應實現分析物衍生化的任何現有或新產生的試劑均在本發明方法、混合物、試劑盒和/或組合物實施方案的範圍之內。當標記試劑的反應基團包含親電體時,它可與分析物中合適的親核基團反應。當標記試劑的反應基團包含親核體時,它可以與分析物中合適的親電基團反應。大量合適的親核基團與親電基團對是已知的,並常在化學及生物化學領域中使用。包含可與分析物(例如蛋白質、肽、核酸、碳水化合物、脂質、類固醇、維生素、前列腺素或質量小於1500道爾頓的其它小分子)偶聯以實現其衍生化的適當親核基團或親電基團的試劑的非限制性實例描述於PierceLifeScience&AnalyticalResearchProductsCatalog&Handbook(aPerstorpBiotecCompany),Rockford,IL61105,USA。其它合適的試劑為本領域所熟知,並以商品形式由其它供應商(例如Sigma-Aldrich)提供。標記試劑的反應基團可包含胺反應基團。例如,所述胺反應基團可以是活性酯。活性酯在肽合成中是熟知的,指在肽合成中常用條件下易於與胺基酸的N-a-氨基反應的某些酯(參閱LeoAPaquette,£>io;c/o/;//及eflge她>6^""/ci5jy"幼e喊,2巻JohnWileyandSons,NewYork,1995)。所述胺反應活性酯基團可以是N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS)、N-羥M代琥珀醯亞胺酯(NHSS)、五氟苯基酯(Pfp)、2-硝基苯基酯(2-NP)、3-硝基苯基酯(3-NP)、4-硝基苯基酯(4-NP)、2,4-二硝基苯基酯(2,4-NP)、五氟苯基酯(Pfp)、五氯苯基酯(Pcp)、3-羥基-l,2,3-苯並三唑-4(3H)—酯(Dhbt)、羥基吡咯烷酮(NHP)、2,4-二卣苯基酯、2,2,2-三氟乙烷基酯(2,2,2-trifluoroethanylester)或1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙基酯。例如,活性酯(本文的一些實施方案中""^1稱為Z,,使得可變的RG僅與M基團的離去基團部分同義)可由下式表示formulaseeoriginaldocumentpage35其中X,是-O-或-S-,各個X"彼此獨立地是-F、-Cl、-Br-或-I(N-甲基哌喚化合物活性酯的合成參閱美國已公開專利申請No.US2005-0148771Al,所述活性酯的多種合成途徑參閱圖7)。前述均為活性酯的醇或硫醇離去基團,其中所述醇或硫醇基團可通過胺基酸N-a-氨基與該活性酯基團羰基碳的反應進行置換。因此,對本領域普通技術人員而言顯而易見的是,本文所述任何合適的標記/標籤試劑的活性酯(例如N-羥基琥珀醯亞胺酯)均可使用熟知的方法與本文公開內容結合來製備(還可參閱如GregT.Hermanson(1996).'TAeC7^附/^o;/及efl",'ve(7nm/s"/""5iVco/iyiig她recAw/《nW,第2章,137-165頁,AcademicPress,(NewYork);還參閱"/"Aiov她Vw屍ers/;e"/ves/"5WiV/i^"m^^aiAmis'',RogerEpton編輯,SPCC(UK)Ltd,Birmingham,1990)。在一些實施方案中,標記試劑的反應基團可包含混合酸酐,因為已知混合酸酐與氨基高效反應,從而產生醯胺鍵。混合酸酐是熟知的,並可使用有機化學和/或肽化學領域經常應用的熟知方法來製備。在一些實施方案中,標記試劑的反應基團可以是羧醯卣化物基團,例如醜氟基團(參閱Carpino等,/爿柳.C7^附.Soc,112:9651(1990))或醯氯基團。酸fi化物基團與分析物中胺的反應會形成醯胺。酸卣化物基團與分析物中羥基或硫醇基(thiolgroup)的反應會分別產生酯或硫酯。在一些實施方案中,反應基團可以是磺醯卣或磺酸基。如果是磺酸,則可被活化而與分析物反應。如果是磺醯卣,則可直接與分析物反應,因為這就是活化形式。在一些實施方案中,反應基團可以是異氰酸鹽/酯(isocyanate)或異硫氰酸鹽/酯(isothiocyanate)基團。在一些實施方案中,標記試劑的反應基團可包含硫醇反應基團。例如,所述硫醇反應基團可以是馬來醯亞胺(malemide)基、烷基卣化物基、a-卣代-醯基、a-卣代國硫酮基(a國halothionegroup)或a曙卣代亞胺基。我們用"卣化物基團"或"卣代"或"卣素基團"來表示氟、氯、溴或碘。所述硫醇反應基團是熟知的,並可使用肽化學領域常用的方法來製備。在一些實施方案中,標記試劑的反應基團可包含羥基反應基團。例如,所述羥基反應基團可以是三苯曱基卣化物或甲矽烷基卣化物反應基團。三苯甲基卣化物反應部分可以被取代(例如X",-甲氧基三苯甲基、X,,,-二甲氧基三苯甲基、X,,,-三甲氧基三苯曱基等),或者是未取代的,其中X",是將反應基團與連接物(即平衡物)連接的鍵。所述甲矽烷基反應部分可以是烷基取代的甲矽烷基卣化物,例如X",-二甲基甲矽烷基、X",-二三乙基甲矽烷基、X,"-二丙基甲矽烷基、X,"-二異丙基甲矽烷基等),其中X",是將該反應基團與連接物(即平衡物)連接的鍵。所述反應基團是熟知的,並可使用核酸化學領域常用的方法來製備。36在一些實施方案中,標記試劑的反應基團可包含親核體,例如氨基、羥基、硫醇基或醯肼基。在一些實施方案中,所述親核反應基團可以是氨基烷基、羥基烷基或硫代烷基。所述反應基團是熟知的,並可使用有機化學領域經常應用的方法來製備。報告物部分本發明實施方案中所用標記試劑的報告物部分(有時以縮寫"RP"代表)是具有可測量的獨特質量(或者質鐠儀中的質荷比)的基團。因此,在一些實施方案中,一組同分異構和/或同量異位標記試劑中的每種報告物部分及其相應的特徵離子均具有獨特的粗略質量,並且對組中每種標記試劑而言彼此不同。不同的報告物部分可包含一個或多個重原子同位素,以實現其獨特的粗略質量。例如,碳(12C、13C和"C)、氮("N和15N)、氧(160和180)、硫(32S和34S)和/或氫(氫、氘和氚)的現有重原子同位素可用於製備報告物部分的不同基團。它們不是限制性的,因為在報告物部分中還可使用其它輕原子和重原子。包含輕原子和重原子同位素的適於製備報告物部分的基本起始材料可得自多個商業來源,例如CambridgeIsotopeLaboratories,Andover,MA(參閱www.isotope.com的"基本起始材料"列表)和Isotec(Sigma-Aldrich的分支機構)。CambridgeIsotopeLaboratories和Isotec還根據定製合成協議製備需要的化合物。報告物部分可以包含固定的電荷,或者可以在分析過程中離子化。由於報告物部分可以包含固定電荷或者可被離子化,因此所述標記試劑可以鹽(或鹽的混合物)或兩性離子的形式分離或用於標記反應性分析物。報告物部分(或報告物離子)的離子化有助於在質譜儀中對其進行測定。因此,被標記分析物中報告物部分的存在狀況可作為片段離子(有時稱為特徵離子(或報告物離子))而被測定。N-甲基哌喚報告物部分的多種報告物離子示於圖5。所述離子的分子式為13CCsH13N2+、13CC5H1315NN+、13C2C4H1315NN+和13C3C3H1315NN+。離子化後,特徵離子(即報告物離子)可包含一個或多個正或負的淨電荷。因此,報告物離子可包含一個或多個酸性基團和/或鹼性基團,因為這些基團易於在質i普儀中離子化。例如,報告物部分可包含一個或多個鹼性氮原子(帶正電)和/或一個或多個離子化的酸性基團,例如羧酸基、磺酸基或磷酸基(帶負電),條件是在平衡時酸性基團或鹼性基團之一較多以使該報告物部分產生包含正或負的淨電荷的報告物離子。包含至少一個鹼性氮的報告物部分的非限制性實例包括含有取代或未取代的嗎啉、哌啶或哌溱的化合物。獨特的報告物部分可以與目的樣品相關聯,從而用所述獨特的報告物部分標記該樣品中的一種或多種分析物。這樣,可將關於獨特才艮告物部分的信息(一般在質鐠儀中通過特徵離子(即報告物離子)來檢測)與關於所述樣品中一種或全部分析物的信息相關聯。然而,在測定特徵離子時,獨特的報告物部分不需要與分析物物理連接。相反,可在斷裂被標記分析物以產生子片段離子和特徵離子之後在串聯分析儀中的第二質量分析中測定特徵離子的獨特粗略質量。測定的特徵離子可用於鑑定所測定分析物所來源的樣品。此外,獨特特徵離子相對於其它特徵離子或相對於校正標準品(例如預期存在於所述樣品中且用特異性報告物部分標記的分析物)的該特徵離子的量(經常表達為濃度和/或量)可用於測定樣品(例如用於形成樣品混合物的樣品)中分析物的相對量和/或絕對量(經常表達為濃度和/或量)。在一些實施方案中,不使用內校正標準品,而是可基於將多種特徵離子的峰強度與校正曲線進行比較而進行絕對定量。因此,可將信息(例如特定樣品中一種或多種分析物的量)與用於標記每種特定樣品的報告物部分相關聯。當也確定分析物的身份時,該信息可與關於不同特徵離子的信息相關聯,從而輔助確定一種或多種樣品中每種被標記分析物的身份和量。在一些實施方案中,報告物部分可包含與取代或未取代的N-烷基化乙酸部分中亞甲基碳共價連接的氮原子,其中所述取代或未取代的亞曱基碳(而不是該乙酸部分中羧酸(或硫代羧酸)基團的羰基)是該報告物的一部分。因此,在一些實施方案中,羧酸(或硫代羧酸)基可用於連接報告物與連接物,但不認為是報告物的一部分。所述氮原子可以被一、二或三個基團烷基化。例如,包含氮原子的部分可以是取代的伯胺,例如甲基、乙基或丙基基團,或者是取代的仲胺,例如二甲基胺、二乙基胺、二正丙基胺或二異丙基胺。因此,例如,報告物部分"RP"可由以下的式X1、X2、X3、X4、Xs、X6、X7、X8或X9來表示,其中"RP"以括號為界formulaseeoriginaldocumentpage39報告物部分可以是5元、6元或7元雜環,其包含與取代或未取代的N-烷基化乙酸部分的亞曱基碳共價連接的環氮原子,所述取代或未取代的N-烷基化乙酸部分通過其羰基碳與分析物(直接或間接)相連,其中所述取代或未取代的亞甲基碳(而不是羧酸基的羰基碳)是該報告物的一部分。所述雜環可以是芳香的或非芳香的。因此,所述報告物部分可由式Y-J表示,其中Y基團可代表5元、6元或7元雜環,J基團可代表所述取代或未取代的乙酸部分中取代或未取代的亞曱基。所述雜環可以是取代或未取代的。例如,該雜環部分的取代基可包括烷基、烷氧基和/或芳基。取代基可包含適於將分析物與支持物連接的保護或未保護的基團,例如氨基、羥基或硫醇基(見圖6)。所述雜環可包含額外的雜原子,例如一個或多個矽、氮、氧和/或硫原子。因此,例如,報告物部分"RP,,可以以下式X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25或X"來代表,其中報告物部分"RP"以括號為界可對報告物部分進行選擇,以使其在對分析物進行分析的典型條件下不發生亞斷裂(sub-fragment)。為了消除任何疑義,這是任選(而非必需)的特徵。例如,可對報告物進行選擇,以使其在質鐠儀中使被標記分析物斷裂的解離能條件下不發生顯著的亞斷裂。我們用"不發生顯著的亞斷裂,,來表示在成功測定被標記分析物時,難於或不可能檢測到高於背景噪聲的報告物片段。物離子的粗略質量選擇成與不同於意圖測定的分析物或該分析物的任何預計片段的質量(即"靜區(quietzone)")。例如,當分析物為蛋白質或肽時,報告物離子的粗略質量可選擇成不同於與任何天然存在的胺基酸或肽或其預計斷裂離子。這可有助於分析物測定,因為取決於分析物,不存在任何樣品中具有相同質量的組分可提高任何分析結果的置信度。對於肽而言可預計背景極低的質量範圍實例可見於表l。表l:選擇與肽分析相關的標記片段離子m/z的可能的"靜區"tableseeoriginaldocumentpage41156-156160-174177-182184-184188-189191-191202-20721.0-210216-222224-226所述報告物部分可以是非聚合的。可將報告物部分選擇成產生具有表明其質量小於250原子質量單位(amu)的m/z的報告物部分。可將報告物部分選擇成產生m/z小於200原子質量單位(amu)的報告物部分。可將報告物部分選擇成產生m/z小於150原子質量單位(amu)的報告物部分。這些小分子可輕易地在第二質量分析中測定,所述第二質量分析中不含樣品中與第一質量mass)的其它組分。在這種情況下,可以對第一質量分析中測定的選定離子進行第二質量分析,一般在串聯質鐠儀中(或者,例如在單階段儀器中通過源後衰變)來進行。由於可以從第一質量分析中具體選出具有特定質荷比的離子用於可能的斷裂和進一步質量分析,因此第一質量分析中未選擇的離子不進行第二質量分析,從而不汙染第二質量分析的鐠。而且,質鐠儀的靈敏度和檢測器(用於定量)的線性程度在這一低質量範圍內可以相當高。此外,質鐠儀技術的當前水平可允許在這一質量範圍內獲得小於l道爾頓的極限質量解析度。由於以上的所有原因,使用本文所述方法,具有上述特徵的報告物可為複雜混合物中所測定的分析物提供相當準確的定量。連接物(或平衡物)部分標記試劑的連接物(或平衡物)部分(有時用縮寫"LK,,表示)可用於本發明的實施方案,以將報告物部分(RP)和非編碼可檢測標記(DL)與分析物或反應基團連接,這取決於是否與分析物發生反應。連接物部分可以是分支的或者是無分支的。例如,如果報告物和非編碼可檢測標記各自獨立地與該連接物連接,連接物可以是分支的;但如果非編碼可檢測標記和報告物部分依次與該連接物部分連接,則連接物也可以是線性的(參見圖la和lb)。所述非編碼可檢測標記可與連接物直接或間接連接。可將連接物選擇成產生中性物質(即在質鐠儀中發生中性丟失),其中連接連接物與報告物部分的鍵(即鍵X)以及連接連接物與分析物的鍵(在一些實施方案中為Y)在質鐠儀中都斷裂。在一些實施方案中,連接物部分可設計成在經受解離能時亞斷裂,包括僅產生連接物的中性片段的亞斷裂。在一些實施方案中,可將連接物設計成產生一種或多種可檢測片段。在包含一組同分異構和/或同量異位標記試劑的組和/或試劑盒中使用時,所述連接物部分可包含一種或多種重原子同位素,使得該組中每種不同試劑的連接物部分的質量補償針對該組中不同標記試劑在報告物部分之間的粗略質量差異,使得報告物部分與連接物部分的組合的合計粗略質量對於該組的每種標記試劑均相同。因此,報告物/連接物組合(即報告物/連接物部分)的合計粗略質量(即作為整體的粗略質量)對於混合物中每種被標記分析物都是相同的(大致相同),或者對於組和/或試劑盒中的標記試劑是相同的。更具體地,所述連接物部分可補償來自不同樣品的被標記分析物的報告物部分之間的粗略質量差異,其中報告物部分的獨特粗略質量與被標記分析物所來源的樣品相關,報告物/連接物組合的合計粗略質量對於樣品混合物中的每種被標記分析物都是相同的,無論樣品的來源如何。這樣,兩種或更多種不同樣品中相同分析物在標記及隨之混合之後可具有相同的粗略質量,以產生樣品混合物。例如,被標記分析物或者用於標記該分析物的組和/或試劑盒中的標記試劑可以是同分異構體和/或同量異位物。因此,如果在質鐠儀中從樣品混合物的第一質量分析中選擇具有特定質荷比(取自樣品混合物)的離子(即選定的離子),來自組成樣品混合物的不同樣品中的相同分析物可由所述選定離子來按比例地代表其在樣品混合物中的相應濃度和/或量,因為無論與分析物連接的標記為何,它們都具有相同的粗略質量。因此,連接物不僅將報告物與非編碼可檢測標記和分析物連接,它還用於補償獨特報告物部分的質量差異,從而使多種樣品中被標記分析物的報告物/連接物部分的粗略質量一致。由於連接物可作為標記試劑中報告物部分的質量平衡物,因此連接物中的原子數越多,組和/或試劑盒中不同同分異構/同量異位標記試劑的可能數目就越多。換言之,連接物所包含的原子數越多,一般來說可能的報告物/連接物組合的數目就越多,因為同位素最多可在連接物中的任何位置被替換而產生同分異構體和/或同量異位物,其中連接物部分用於補償報告物部分的質量差異,從而產生一組獨特的同分異構和/或同量異位標記試劑。這些不同組的標記試劑特別適用於相同和/或不同樣品中分析物的多重分析。組和/或試劑盒中標記試劑的總數可以為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多。基於質量平衡的考慮,組或試劑盒中標記試劑的多樣性僅受限於報告物和連接物部分中的原子數、可用於取代輕同位素的重原子同位素以及可以合成方式安置同位素的多種合成設置。然而,如上文所指出,多種同位素富集的基本起始材料可便利地從製造商獲得,例如CambridgeIsotopeLaboratories和Isotec。普通技術人員可將這些同位素富集的基本起始材料用於生產同量異位和/或同分異構標記試劑組的方法中,或者用於生產同位素富集的起始材料(即以合成方式富集的化合物)的方法中,所述同位素富集的起始材料可用於生產同量異位和/或同分異構標記試劑組的合成方法中。報告物/連接物的組合(即報告物/連接物部分)標記試劑可包含報告物部分和連接物部分,它們通過鍵x彼此直接連接。如上文所述,報告物/連接物部分對於標記試劑組和/或試劑盒中的每個成員而言可以是相同的,或者對於被標記分析物的化合物中每種被標記分析物而言都是相同的。而且,(直接或間接地)連接報告物部分與連接物部分的鍵(即鍵X)可設計成在經受解離能時至少在一部分選定的離子中斷裂,從而從連接物部分、連接物/分析物和/或連接物/分析物/非編碼可檢測標記部分中釋放特徵離子(即報告物離子)。因此,可以在MS/MS分析中直接觀察該特徵離子(通過質鐠儀中的質荷比(m/z)來觀察)及其強度(即其峰強度)。報告物/連接物部分可包含一組或試劑盒中的多種標記試劑中相同或不同的重原子同位素的多種組合。在科技文獻中,這有時稱為"編碼"、"同位素編碼"或"代碼"。例如Abersold等公開了同位素編碼的親和標籤(ICAT;參閱WO00/11208)。在一個方面中,Abersold等的試劑與本文所述標記試劑不同,Abersold未教導兩種或更多種相同質量的標記試劑,例如同分異構和/或同量異位標記試劑。相反,Abersold等教導了其標記試劑的"輕"形式和"重"形式。包含非編碼可檢測標記的ICAT試劑形式(有時稱為VICAT)描述於WO2004/01卯00;Lu等,爿w"/.C7^附.,76:4104-4111(2004)以及Bottari等,5,V"w/"gflteC7^附/對o;,15(2):380-388(2004)。在一些實施方案中,報告物和/或連接物部分可包含可用於將標記試劑或被標記分析物固定在支持物上的原子或基團。固定可以是直接的或間接的。例如,如果與報告物相關聯的原子或基團(例如報告物的烷基氨基取代基)與支持物的反應基團(例如可切割連接物的反應基團)直接相互作用以實現固定,則可發生直接固定。相比之下,間接固定在以下情況下發生,例如報告物的取代基(例如報告物和/或連接物的烷基氨基取代基)被修飾(例如生物素化),且該修飾基團與支持物的反應基團(例如親和素或鏈黴親和素)相互作用以實現固定。因此,本發明涵蓋這樣的實施方案分析物能與結合在支持物上的標記試劑反應,其中每種支持物包含獨特的標記試劑,從而不同的樣品與不同的支持物反應;還涵蓋這樣的實施方案每種不同樣品與不同的標記試劑反應,反應產物其後固定在相同或不同的支持物上。在任何一種情況下,一般地通過從支持物上切下被標記分析物來獲得用於質i普分析的樣品混合物(參見圖6)。所釋放的每種樣品的被標記分析物可任選地分開收集,或者可以在切割過程中混合以形成樣品混合物。如果進行收集,則所釋放的被標記分析物可在其後混合以形成樣品混合物。非編碼可檢測標記本文所述標記試劑包含非編碼的可檢測標記(有時使用縮寫"DL"來表示)。可與本文所述標記試劑一起使用的非編碼可檢測標記(部分)的非限制性實例包括但不僅限於生色團、螢光團、自旋標記、酶或化學發光化合物。我們使用"非編碼"來表示該可檢測標記沒有以合成方式富集一種或多種重原子同位素。因此,所述非編碼可檢測標記不產生報告物離子(特徵離子),並且不代表連接物(平衡物)部分的一部分。螢光團的非限制性實例包括5(6)-羧基螢光素(Flu)、6-((7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙醯基)氨基)己酸(Cou)、5(和6)-羧基-X-羅丹明(Rox)、花青2(Cyanine2,Cy2)染料、花青3(Cy3)染料、花青3.5(Cy3.5)染料、花青5(Cy5)染料、花青5.5(Cy5.5)染料、花青7(Cy7)染料、花青9(Cy9)染料、(花青染料2、3、3.5、5和5.5作為NHS酯可得自Amersham,ArlingtonHeights,IL)或者Alexa染料系歹'J(MolecularProbes,Eugene,OR)。酶的非限制性實例包括聚合酶(例如Taq聚合酶、KlenowDNA聚合酶、T7DNA聚合酶、測序酶、DNA聚合酶1和d>29聚合酶)、鹼性磷酸酶(AP)、辣#>過氧化物酶(HRP)、大豆過氧化物酶(SBP)、對於成組的同分異構和/或同量異位標記試劑而言,每種非編碼可檢測標記在相似條件下均與該標記試劑組中的其它非編碼可檢測標記具有相同的粗略質量和相同的淨電荷。每種不同的非編碼可檢測標記均可獨立於該組中其它標記而進行檢測。例如,相信圖8a和8b所述標記試劑的螢光團(即非編碼可檢測標記)具有可區分的螢光鐠、在生理pH下具有相同的淨電荷並具有相同的名義粗略質量。由於每種非編碼可檢測標記均可在組中獨立檢測,因此在一些實施方案中,所述非編碼可檢測標記可用於在下文所述的電泳分離中在特定的被標記分析物顯出相對濃度差異時(或其它目的條件)進行測定。因此,在一些實施方案中,可以基於MS分析及定量之前的(電泳分離和)分析來審慎地選擇用於MS分析(以及在一定程度上進行定量)的目的分析物。這樣,可以跳過相對於預期量來說好像沒有量改變或者好像沒有相對定量差異的分析物進行的MSn分析,從而可以更有效地利用時間和資源。鍵XX是報告物原子與連接物部分或非編碼可檢測標記的原子之間的鍵。本文所述多種標記試劑的鍵X在經受解離能時可在至少一部分選定的離子中斷裂。因此,可在質鐠儀中調整解離能的水平,以4吏鍵x可在被標記分析物的至少一部分選定離子中斷裂。鍵x的斷裂從分析物中釋放報告物,使得報告物(即特徵離子)可獨立於分析物離子而進行測定。鍵或連接基團YY是連接所述連接物部分("LK")與反應基團("RG")的鍵或連接基團。無論是鍵還是連接基團,Y均任選地是可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂的。如果Y是連接基團,則它可以是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或芳基亞烷基。如果Y是連接基團,它可任選地包含一個或多個重原子同位素。如果Y是連接基團,並且在同分異構和/或同量異位標記試劑組中使用該標記試劑,則其粗略質量對於該組中每種標記試劑而言都相同。如果Y可斷裂,則Y的斷裂從分析物或其片段中釋放報告物/連接物/非編碼可檢測標記部分,這取決於鍵X是否已斷裂。如果是鍵,則鍵Y可能比鍵X更不穩定。鍵X可以比鍵Y更不穩定。鍵X和Y可具有相同的相對不穩定性。如果目的分析物是蛋白質或肽,則可根據醯胺(肽)鍵來調整鍵X和Y的相對不穩定性。鍵X、鍵Y或其二者可以比典型醯胺(肽)鍵的不穩定性更高、相同或更低。例如,在解離能條件下,鍵X和/或鍵Y與Z,,,-pro二聚體或者Z,"-asp二聚體中的肽鍵相比可以更不易於斷裂,其中Z",是任何天然胺基酸,pro是脯氨酸,asp是天冬氨酸。在一些實施方案中,鍵X和Y將與典型醯胺鍵在大致相同的解離能水平下斷裂。在一些實施方案中,鍵X和Y將在比典型醯胺鍵更高的解離46能水平下斷裂。還可存在這樣的鍵X和Y,使得鍵Y的斷裂引起鍵X的斷裂,反之亦然。這樣,鍵X和Y可基本同時斷裂,使得沒有顯著量的分析物(或其子片段)在第二質量分析中具有部分標記。我們用"顯著量的分析物"來表示在MS/MS諉中可檢測到小於25%、優選小於10o/n的部分標記分析物。由於在一些實施方案中分析物的標記片段與未標記片段在第二質量分析(MS/MS)中存在明確的界限,因此這一特徵可使從子片段離子譜的計算機輔助分析中鑑定分析物得以簡化。而且,由於在一些實施方案中分析物的片段離子可以用報告物/連接物/可檢測部分完全標記或者不標記(但不是部分標記),因此在子片段離子的質量中可能不存在或幾乎不存在由於斷裂鍵之間的同位素分布所導致的離散,例如第二質量分析中常規測定的部分標記分析物中單個不穩定鍵的每一側都存在同位素的情況。鍵或連接基團W:W是連接所述連接物部分("LK")與非編碼可檢測標記("DL")的鍵或連接基團。W任選地可通過施加光、熱或化學試劑而切割和/或可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂(即可切割)。如果W是連接基團,則它可以是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或芳基亞烷基。如果W是連接基團,它可任選地包含一個或多個重原子同位素。如果W是連接基團,並且在同分異構和/或同量異位標記試劑組中使用該標記試劑,則其粗略質量對於該組中每種標記試劑而言都相同。在W是連接基團的一些實施方案中,W可包括例如可切割部分,如XAL、PAL或HMPB,更詳細地描述於Kates等,5W/rfi^flse5^"幼esisv爿戶m"/cfl/GwiV/e,MarcelDekker,Inc.,NewYork,2000。與支持物結合的包含可切割連接物的標記試劑根據一些實施方案,來自樣品的分析物可與包含標記試劑的固相支持物反應(每種樣品與不同的固相支持物反應,以使每種樣品的每種被標記分析物包含不同的報告物部分),並可任選地洗去樣品中不與該反應基團反應的組分。接著可以通過在切割可切割連接物並由此從支持物上釋放報告物-連接物-非編碼可檢測標記/分析物複合體的條件下處理支持物,以從每個固相支持物上除去被標記分析物。每個支持物均可在切割可切割連接物的條件下相似地進行處理由此獲得兩種或更多種不同樣品,每種樣品包含一種或多種被標記分析物,其中與特定樣品相關的被標記分析物可通過與其連接的獨特報告物部分來鑑定和/或定量。接著可混合所收集的樣品以形成樣品混合物,如下文所述。有多種市售的支持物可用於通過可切割連接物將標記試劑連接到支持物上。在一些實施方案中,標記試劑可通過報告物部分連接到支持物上。一般而言,標記試劑會包含親核或親電基團,它們能與可切割連接物的官能團反應,從而將所述標記試劑與所述支持物可切割地連接在一起。在一些實施方案中,標記試劑可在帶有所述可切割連接物的支持物上合成。在另一些實施方案中,所述標記試劑包含可切割連接物,所述可切割連接物可與支持物反應,並由此形成包含該可切割連接物的與支持物結合的標記試劑。例如,標記試劑的報告物部分中的氨基、幾基或硫醇基可與適當支持物的可切割連接物反應。所述可切割連接物可以是"空間受阻的(stericallyhindered)可切割連接物"。切割所述可切割連接物會從支持物上釋放標記或被標記分析物。空間受阻的固相支持物的非限制性實例包括三苯甲基氯樹脂(trityl-Cl,Novabiochem,P/N01-64-0074)、2-氯三苯曱基氯樹脂(Novabiochem,P/N01-64-0021)、DHPP(Bachem,P/NQ國1755)、MBHA(AppliedBiosystemsP/N400377)、4-甲基三苯甲基氯樹脂(Novabiochem,P/N01-64-0075)、4-甲氧基三苯甲基氯樹脂(Novabiochem,P/N01-64-0076)、羥基誦(2-氯苯基)曱基畫PS(Novabiochem,P/N01-64-0345)、Rink酸樹脂(NovabiochemP/N01-64-0380,01-64-0202)、NovaSynTGT醇樹月旨(Novabiochem,P/N01-64-0074)。多種其它可切割連接物為本領域已知的,並可用於僅使用市售材料、常規實驗和本文的教導來製備合適的支持物。例如,所述報告物部分可以是5元、6元或7元雜環,其包含有助於將其與適當支持物可切割連接的原子或基團。例如,所述基團可以是包含氨基、羥基或硫醇基的亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基或烷基亞芳基,在一些實施方案中,所述雜環不需要其它的官能團。例如,與該可切割連接物結合的原子可以是哌嚷環的仲氮。關於示例性哌嚷化合物及其製備方法的討論可見於已公開的美國專利申請US2004-0219685Al。報告物部分中氨基、羥基或硫醇基與包含該連接物部分的支持物之間的反應可形成包含該標記試劑的支持物。支持物與支持物上所結合的標記試劑的反應可產生與支持物結合的被標記分析物。由於所述可切割連接物可選擇成通過光、熱或化學試劑進行切割,因此適當的處理會釋放可用於產生下文所述樣品混合物的被標記分析物。參考圖6,展示了與支持物可切割地連接的示例性標記試劑。如圖所示,與珠狀支持物連接的三苯甲基是可切割連接物(例如三苯甲基氯樹脂(trityl-Cl,Novabiochem,P/N01-64-0074)。如圖所示,標記試劑中烷基化哌溱報告物部分的相連官能團Q與支持物上結合的三苯曱基可切割地連接,反應基團的離去基團Z,可被分析物的官能團置換,從而形成與支持物結合的被標記分析物。例如,標記試劑的反應基團可以是羧酸,它可原位活化以與分析物(例如肽)的氨基官能團反應,從而形成與支持物結合的被標記分析物。如圖所示,用酸處理該支持物通過再生標記試劑報告物部分的官能團Q,而從支持物上釋放被標記分析物。質諉儀/質譜法(MS):可使用能選擇和斷裂分子離子的串聯質語儀和其它質i普儀實施本發明的方法。串聯質譜儀能根據其質荷比(m/z)來選擇和斷裂分子離子(單級質譜儀也有此能力,但程度較低),其後記錄所得到的片段(子片段)離子鐠。更特別地,可通過對選定的離子施加解離能(例如碰撞誘導解離,CID))產生子片段離子譜。例如,可以在第一質量分析中選擇對應於具有特定m/z比的被標記肽的離子,使其斷裂並在第二質量分析中進行再分析。可進行這樣的串聯質量分析的代表性儀器包括但不僅限於磁性四扇區(magneticfour-sector)、串聯飛行時間、三重四極杆、離子阱和串聯四極杆飛行時間(Q-TOF)質鐠儀。這些類型的質鐠儀可以與多種離子源聯用,所述離子源包括但不僅限於電噴霧電離(ESI)和基質輔助雷射解吸電離(MALDI)。離子源可用於產生離子化物質,其用於在分析物還不具有固定電荷時進行第一質量分析。其它質譜儀器和斷裂方法包括MALDI-MS儀器中的源後衰變和4吏用MALDI-TOF(飛行時間)-TOFMS進行的高能CID。關於串聯質鐠最近的綜述可參閱R.Aebersold和D.Goodlett,Af"^5^ec^Y附e^j/"iVo&0附/cs.C^e/if.及ev.101:269-295(2001)。通過解離能進行斷裂:公認的是,鍵可因質鐠儀中發生的過程而發生斷裂。此外,可以在質譜儀中通過對離子施加解離能來誘發斷裂。例如,可以通過碰撞誘導解離(CID)在質譜儀中產生解離能。可用於在質鐠儀中斷裂離子的解離能的其它非限制性實例包括碰撞激活解離(CAD)、光誘導解離(PID)、表面誘導解離(SID)、電子誘導解離(EID)、電子俘獲解離(ECD)、熱/黑體紅外輻射解離(BIRD)、源後衰變或其組合。質譜領域的技術人員會理解,施加引起斷裂的解離能的其它示例性技術包括但不僅限於光解離、電子俘獲和表面誘導解離。通過碰撞誘導解離斷裂鍵的方法包括通過與惰性氣體碰撞而將選定離子的動能狀態提高到發生鍵斷裂的點。例如,可以通過在碰撞室中與惰性氣體(例如氮、氦或氬)碰撞來傳遞動能。可以傳遞至該離子的動能的量與允許進入碰撞室的氣體分子數成比例。當存在較多的氣體分子時,可以對選定的離子傳遞較大量的動能,當存在的氣體分子較少時,可以傳遞較少的動能。因此,很明顯,可以控制質鐠儀中所施加的解離能。還公認的是,某些鍵比其它鍵更不穩定。分析物或報告物/連接物/非編碼可檢測標記物部分中鍵的不穩定性取決於該分析物的性質和該報告物/連接物/非編碼可檢測標記物部分的性質。因此,可以調節解離能,從而以可測定的方式使分析物和/或標記試劑(例如報告物/連接物的組合)斷裂。本領得適當的解離能水平,從而使被標記分析物的至少一部分離子斷裂成特徵離子(即報告物離子)和子片段離子。例如,可以對在第一質量分析中選擇/分離的離子施加解離能。在串聯質鐠儀中,可使提取的離子經受解離能,從而導致斷裂,接著轉移至第二質量分析器中。所選定的離子可具有選定的質荷比。所述質荷比可以在一定的質荷比範圍內,這取決於質鐠儀的特性。當使用碰撞誘導解離時,可通過使離子穿過碰撞室而將其從第一質量分析器轉移至第二質量分析器,在所述碰撞室中可以施加解離能以產生片段離子。例如,送至第二質量分析器進行分析的離子可包括一些或一部分殘留的(未斷裂的)選定離子(如果有的話)以及被標記分析物的才艮告物離子(特徵離子)和子片段離子。通過計算機輔助資料庫分析來確定分析物在一些實施方案中,可以基於子離子斷裂模式來確定分析物,所述模式通過與已知或"理論"分析物的譜圖進行計算機輔助的比較來分析。例如,在低能CID條件下斷裂的肽離子的子片段離子鐠可以認為是許多離散斷裂事件的總和。常用的命名原則根據所斷裂的醯胺鍵和鍵斷裂後保持帶電的肽片段來區分子片段離子(Reopstorff等,5"挑W.Mfl^5^"n附.,11:601(1988))。電荷保留在斷裂醯胺鍵的N端側導致形成b-型離子。如果電荷保留在斷裂醯胺鍵的C端側,則片段離子稱為y-型離子。除了b-和y-型離子以外,CID質鐠還可含有其它診斷性片段離子(它們包括由於穀氨醯胺、賴氨酸和精氨酸發生氨中性丟失(-17amu)或者含有羥基的胺基酸(如絲氨酸和蘇氨酸)發生水丟失(-18amu)而產生的離子);所述診斷性片段離子以及b-和y-型離子都是子片段離子。已經觀察到某些胺基酸在低能CID條件下比其它胺基酸更易於斷裂。這對於含有脯氨酸或天冬氨酸殘基的肽而言特別明顯,在天冬氨醯-脯氨酸鍵處更為明顯(Mak,M.等,及"/;!V/O附www.Mass5^"/w"12:837-842(1998))。因此,Z,,,-pro二聚體或Z,,,畫asp二聚體(其中Z",是任何天然胺基酸,pro是脯氨酸,asp是天冬氨酸)的肽鍵與其它胺基酸二聚體組合中的肽鍵相比通常更不穩定。因此,就肽和蛋白質樣品而言,低能CID鐠含有冗餘的b-和y-系列離子、來自同一肽的內部片段離子以及銨和其它中性丟失離子方面的冗餘的序列特異性信息。解釋這些CID鐠來從頭組裝親本肽胺基酸序列是很艱巨且費時的,但仍可行。用於測序的計算機輔助的從頭方法的最新^H描述於Huang,Y.,Ross,P,Smirnov,I,Martin,S.和Pappin,D.2003,Proceedingsof6thInternationalSymposiumonMSinHealthandLifeSciences,2003年8月24日-28日,SanFranciscoCA。肽序列鑑定中最重要的進步是開發了將肽CID鐠與現存於蛋白質和DNA序列資料庫中的肽序列相關聯的計算機算法。這樣的方法例如以下程序SEQUEST(Eng,J.等/J附.Soc.Mam5^"n附.,5:976-989(1994))和MASCOT(Perkins,D.等五/e"n^Ao"s/s,20:3551-3567(1999))。簡言之,將實驗性肽CID鐠(MS/MS譜)與從得自蛋白質或基因組序列資料庫的肽序列中通過計算機產生的"理論"子片段離子譜進行匹配或關聯。這種匹配或關聯是基於預計質量與MS/MS模式中子片段離子的觀測質量之間的相似性。根據實驗與"理論"片段鐠之間的一致程度來對可能的匹配或關聯評分。對給定肽胺基酸序列進行檢索的參數非常具有區分力,以至於單個肽CID譜就足以鑑定全基因組或表達序列標籤(EST)資料庫中的任何給定蛋白質。其它綜述可參閱Yates,J.R.Trends,Gew"/cs,J6:5-8(2000)和Yates,J.R.,五/e"n/;/^/^^sJ9:893-卯0(1998)。因此,MS/MS鐠的子片段離子分析不僅可用於確定被標記分析物的分析物,它還可用於確定作為所測定分析物之來源的分析物。例如,在MS/MS分析中鑑定肽可用於確定該肽從哪種蛋白質中由於蛋白質的酶消化而切下。我們認為這樣的分析可應用於其它分析物,例如核酸、脂質、類固醇和/或前列腺素。X鍵和Y鍵報告物部分的原子與連接物部分的原子之間的鍵是X鍵。如果是被標記分析物中的鍵,則連接物部分的原子與該分析物的原子之間的鍵是Y鍵。在一些實施方案中,至少在一部分選定離子中的X鍵和Y鍵在經受解離能時可斷裂。因此,在一些實施方案中,可以調整質鐠儀中的解離能,以使被標記分析物的至少一部分選定離子中的X鍵和Y鍵都斷裂。X鍵的斷裂從分析物中釋放報告物部分,使得報告物離子可以獨立於分析物而進行測定。Y鍵的斷裂從分析物中釋放報告物/連接物/非編碼可檢測標記,或者從分析物中釋放連接物,這取決於Y鍵是否已經斷裂。在一些實施方案中,X鍵可比Y鍵更不穩定。在一些實施方案中,Y鍵可比X鍵更不穩定。在一些實施方案中,X鍵和Y鍵具有相同的相對不穩定性。簡言之,在本發明的多個實施方案中,將X鍵設計成斷裂以釋放報告物離子,而Y鍵可以斷裂或不斷裂。如果標記試劑不包含可斷裂的Y鍵,則可調整子離子分析,使得標記試劑對分析物的任何修飾的質量可以在相關分析中得到補償。在一些實施方案中,當目的分析物是蛋白質或肽時,可以相對於醯胺(肽)鍵來調整X鍵和Y鍵的相對不穩定性。鍵X、鍵Y或其二者可以比典型醯胺(肽)鍵的不穩定性更高、相同或更低。例如,在解離能條件下,與Z",-pro二聚體或Z",-asp二聚體中的肽鍵相比鍵X和/或鍵Y可以更不易於斷裂,其中Z,"是任何天然胺基酸,pro是脯氨酸,asp是天冬氨酸。在一些實施方案中,鍵X和Y將在與典型醯胺鍵大致相同的解離能水平下斷裂。在一些實施方案中,鍵X和Y將在比典型醯胺鍵更高的解離能水平下斷裂。在一些實施方案中,還可存在這樣的鍵X和Y,使得鍵X的斷裂引起鍵Y的斷裂,反之亦然。這樣,鍵X和Y可基本同時斷裂,使得沒有顯著量的分析物(或其子片段)包含部分標記。我們用"顯著量的分析物"來表示在質鐠儀(例如MS/MS或MSn'分析,其中n,是大於1的整數)可檢測到小於25%、優選小於10%的部分標記分析物。由於在一些實施方案中分析物的標記片段與未標記片段在質鐠(例如MS/MS分析)中存在明確的界限,因此這一特徵可使通過計算機輔助分析從子片段離子鐠中鑑定分析物得以筒化,因為在用於對分析物子片段離子進行分析的質量計算中不需要對殘留的標記進行補償。而且,由於在一些實施方案中分析物的片段離子可以用報告物/連接物/可檢測部分完全標記或者不標記(並且不是部分標記),因此可以很少有或者沒有由於跨過斷裂鍵之間的同位素分布所導致的子片段離子在質量上的散布,就像由施加解離能水平所引起的被標記分析物的斷裂所導致的部分標記分析物中單個不穩定鍵的每一側都存在同位素的情況那樣。對分析物進行標記如上文所述,可通過使分析物的官能團與標記試劑的反應基團進行反應來標記分析物。分析物上的官能團可以是親電基團或親核基團之一,而標記試劑的官能團可以是親電基團或親核基團中的另一種。親電體與親核體可發生反應,以在分析物與標記試劑之間形成共價連接。標記反應可在溶液中發生。在一些實施方案中,分析物或標記試劑之一可與支持物結合。有時標記反應可在水性條件下進行。對於生物分子例如蛋白質、肽和/或核酸的標記可以選擇水性條件。有時標記反應可在有機溶劑或有機溶劑的混合物中進行。對於小分子分析物可以選擇有機溶劑。水與有機溶劑的混合物可廣泛使用。例如,可以製備水與約5%至約95%有機溶劑(體積/體積)的溶液,並用於標記分析物。在一些實施方案中,可以製備水與約50%至約95%有機溶劑(體積/體積),並用於標記分析物。在一些實施方案中,可以製備水與約65%至約80%有機溶劑(體積/體積),並用於標記分析物。有機溶劑的非限制性實例包括N,N'-二甲基曱醯胺(DMF)、乙腈(ACN)、N-甲基吡咯烷(NMP)和醇類,例如甲醇、乙醇、丙醇和/或丁醇。本領域技術人員能夠利用本領域的知識和本文的公開內容並結合常規實驗,根據標記試劑的性質和分析物的性質來確定合適的溶劑條件,以便於對分析物進行標記。進行標記反應時,可調節pH。pH可以為4-10。pH也可在此範圍之外。通常,可以通過加入非親核有機鹼來調節非水反應的鹼度。合適的鹼的非限制性實例包括N-甲基嗎啉、三乙胺和N,N-二異丙基乙胺。或者,可以使用生物緩衝劑(例如N-[2-羥乙基哌溱-N'-[2-乙磺酸)(HEPES)或4-嗎啉乙磺酸(MES))或無機緩衝劑(例如碳酸鈉和/或碳酸氫鈉)來調節含水溶劑的pH。因為反應基團至少之一可以是親電的,所以需要選擇不含有任何親核基團的緩衝劑。本領域技術人員通過應用常規實驗能夠確定可用於調節標記反應pH的其它緩衝劑,以有助於用標記試劑對分析物進行標記。因此,本領域技術人員能夠根據標記試劑的性質和分析物的性質,使用本文的公開內容結合常規實驗來確定有助於分析物標記的合適的溶劑條件和pH。樣品處理:在本發明的一些實施方案中,可以在標記分析物之前和之後處理樣品。處理可有助於分析物的標記。處理可有助於分析樣品組分。處理可簡化對樣品的操作。處理可有助於上述的兩項或更多。例如,可以用酶或化學品處理樣品。所述酶可以是蛋白酶(以降解蛋白質和肽)、核酸酶(以降解核酸)或其它一些酶。可以選擇具有高度可預測的降解模式的酶。還可以將兩種或更多種蛋白酶和/或兩種或更多種核酸酶一起使用或與其它酶一起使用,以降解樣品組分。例如,蛋白水解酶胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶,其切割賴氨酸或精氨酸與非特定胺基酸之間的肽鍵,從而產生包含氨基端(N端)以產生的肽是可以預測的,其在胰蛋白酶消化產物樣品中的存在情況和/或量可指示其來源蛋白的存在情況和/或量。此外,肽的游離胺末端可以是有助於其標記的優良親核體。其它示例性蛋白水解酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、鏈黴蛋白酶、糜蛋例如,理論上講蛋白G在用諸如胰蛋白酶的蛋白酶進行消化時可產生三種肽(例如肽B、C和D)。因此,用蛋白水解酶(如胰蛋白酶)消化過並在分析中證實含有肽B、C和D的樣品可以說最初包含蛋白G。(C端)的肽。這樣,蛋白質切割所肽B、C和D的量也會與所消化樣品中蛋白G的量相關。這樣,對鑑定和/或定量樣品(或其片段)中肽B、C和D中一種或多種的任何測定均可用於對原始樣品(或其級分)中蛋白G進行鑑定和/或定量。由於酶的活性是可預測的,因此從序列已知的蛋白質的降解中產生的肽序列是可以預測的(參閱上文在"通過計算機輔助資料庫分析來確定分析物"標題下的討論)。使用這一信息可以產生"理論"肽信息。因此,在對實際樣品質鐠分析的子片段離子進行的計算機輔助分析(如上所述)中確定"理論,,肽片段可用於確定一種或多種未知樣品中的一種或多種肽或蛋白質(同上)。在一些實施方案中,樣品處理可包括處理待標記分析物的前體。例如,如果待標記分析物是來自經消化蛋白質的肽,且標記試劑(在這個例子中)選擇成與該肽或肽分析物的氨基(如賴氨酸的N-a-氨基和N-s-氨基)反應,則可以以有助於標記反應的方式加工樣品中的蛋白質(分析物前體分子)。在這個例子中,可以用還原劑(例如三[2-羧乙基磷(TCEP))還原蛋白質,接著通過與封閉試劑(例如甲基硫代磺酸甲酯(methylmethanethiosulfonate,MMTS))反應以封閉硫醇基團。這樣,蛋白質的硫醇基被封閉,從而不幹擾分析物的氨基與標記試劑之間的標記反應。本領域技術人員會理解,對某些其它前體分子的處理可使用易於獲得的試劑和可藉助常規實驗進行修改的方案來進行。試劑和條件的確切選擇可根據待標記的分析物和標記試劑的性質來選擇。在一些實施方案中,樣品加工可包括將分析物或分析物前體固定到固相支持物上,該固相支持物用或未用標記試劑進行了標記。固定可包括共價固定以及吸附和其它非共價固定手段(例如靜電固定)。在一些實施方案中,固定可促進降低樣品複雜度。在一些實施方案中,固定可有助於分析物的標記。在一些實施方案中,固定可有助於分析物前體的標記。在一些實施方案中,固定可有助於對樣品組分中包含某些特性(例如包含或缺少半胱氨酸部分)的級分進行選擇性標記。在一些實施方案中,固定可有助於純化。固定可有助於以上兩項或更多。分離,包括分離樣品混合物在一些實施方案中,對被標記分析物的樣品或樣品混合物的加工可包括分離。可對標記和/或未標記的分析物、標記和/或未標記的分析物前體或者其級分進行一次或多次分離。可對得自固相俘獲的一種或多種級分和/或分離過程的其它產物進行一次或多次分離。可以對兩種或更多種前述樣品類型進行分離,並可在質量分析之前進行不同類型的分離。例如,可以製備包含來自不同樣品的差異性標記分析物的樣品混合物。我們用"差異性標記"來表示每種標記包含可鑑定的獨特特性。本文所述標記可包含兩種獨立的可檢測特性。特別地,它們可包含非編碼可檢測標記以及在MS/MS(或MSn'分析)中產生獨特"特徵離子"的獨特報告物部分。例如,為了分析樣品混合物,可以分離該樣品混合物的組分,並僅對該樣品混合物的一種級分進行質量分析。這樣,可以顯著降低分析的複雜度,因為可以分別分析分離的分析物的質量,從而提高了分析方法的靈敏度。當然,可以對樣品混合物的一種或多種其它級分重複進行一次或多次分析,從而允許對樣品混合物的所有級分進行分析,因此允許對樣品混合物的組分進行更完整的分析。如果加入樣品混合物中每種樣品的量已知,則可以使用一定的分離條件來測定樣品混合物所包含每種樣品中的每種被標記分析物的量,其中在所述條件下經差異性標記的相同分析物以與其在樣品混合物中的豐度成比例的濃度或量共洗脫。因此,在一些實施方案中,對樣品混合物的分離可簡化分析,同時仍保持質量分析(如MS/MS分析)中所測定信號與樣品混合物中差異性標記分析物之間的相關性。在一些實施方案中,分離可通過色鐠進行。例如,可使用液相色鐠/質鐠法(LC/MS)來實現樣品分離和質量分析。此外,任何適於分離目的分析物的色鐠分離方法均可使用。例如,所述色鐠分離可以是正相色鐠、反相色鐠、離子交換色鐠(即陰離子交換色語或陽離子交換色鐠)、體積排阻色鐠或親和色鐠。在分析包含用本文所述同分異構和/或同量異位標記試劑標記的分析物的樣品混合物時,電泳分離可能特別有用。可以使用的電泳分離技術的非限制性實例包括但不僅限於1D電泳分離、2D電泳分離和/或毛細管電泳分離(參閱Westermeier,R"五/e"n^/^res/s/"iVfl"/ce;爿Wiley-VCHVerlanGmbH,Weinheim,Germany,2005以及M.Khaledi,JohnWileyandSons,Inc.NewYork,1998)。在分離時或分離後,可以使用非編碼可檢測標記來定位共洗脫的被標記分析物混合物,其中該混合物可包含用不同的同分異構和/或同量異位標記進行標記的目的分析物,其中每種不同的標記表示該分析物來自哪種樣品。此外,由於可獨立進行檢測非編碼可檢測標記,因此在一些實施方案中,可以測定被標記分析物的相對量,並將此信息用於慎重選擇某些共遷移的被標記分析物(基於某些標準)用於進一步的質鐠分析,從而不需要分析電泳分離中所存在的所有可能的被標記分析物。例如,就某些分析物而言,電泳過程可產生包含一定量的各種同量異位標記分析物的混合物,其中所述同量異位標記的分析物與該被標記分析物在樣品混合物中的量成比例。此外,從對該樣品混合物如何製備的了解(樣品的部分與其它任選組分(例如加入樣品混合物中的校正標準品))中有可能反過來將樣品混合物中被標記分析物的量與該被標記分析物在其來源樣品中的量相關聯。基於觀察到的相對量,有可能僅選擇符合某些所關註標準(例如相對強度的差異大於10o/。)的被標記分析物用於進一步分析。例如,還可在質鐠儀中對某些分離的共遷移分析物進行分析,包括提供定量信息的分析。分析物的相對和絕對定量:在一些實施方案中,有可能對樣品混合物中被差異性標記的相同分析物進行相對定量。例如,有可能通過比較質量分析(例如對第一質量分析中觀察到的選定被標記分析物進行的第二質量分析)中測定的報告物離子(即特徵離子)的相對量(例如所報告的峰面積和/或高度)來對被差異性標記的相同分析物進行相對定量。換言之,當每種報告物離子能與用於產生樣品混合物的每種特定樣品的信息相關聯時,則該報告物離子相對於質量分析中所觀察到的其它報告物離子的相對量就是該分析物在樣品混合物中的相對量。當組成樣品混合物的組分已知(例如組成樣品混合物的每種樣品的量已知)時,則可以基於對具有選定質荷比的被標記分析物觀察到的報告物離子的相對量反過來計算該分析物在用於製備該樣品混合物的每種樣品中的相對量。可以對第一質量分析中觀察到的所有不同的被標記分析物重複這一過程。這樣,可以測定用於產生樣品混合物的每種不同樣品中每種反應性分析物的相對量(常以濃度和/或量表示)。在另一些實施方案中,可以確定分析物的絕對量。就這些實施方案而言,可以向樣品混合物中加入已知量的一種或多種差異性標記分析物(校正標準品),或者可將才艮告物離子的強度與標準曲線相關聯。校正標準品可以是由用於標記樣品混合物中分析物的所述標記組中的同分異構和/或同量異位標記進行了標記的預期分析物,M是該校正標準品的報告物部分與形成該樣品混合物任何樣品相比都是獨特的。一旦確定了校正標準品的報告物離子相對於樣品混合物中差異性標記分析物的報告物離子的相對量,就有可能參考加入該樣品混合物中的校正標準品的量來計算該樣品混合物中所有差異性標記分析物的絕對量(常以濃度和/或量表示)。這樣,還可以基於對該樣品混合物如何製得的了解來確定每種差異性標記分析物(在該分析物來源的樣品中存在校正標準品)的絕對量。或者,可以通過分析被標記分析物的代表性樣品來產生標準曲線,其中每種樣品包含不同已知量的所述被標記分析物。可以將所分析被標記分析物的報告物離子的峰強度對已知量的每種被標記分析物作圖,從而產生標準曲線。產生標準曲線以後,就可以將未知樣品中報告物離子的強度與標準曲線進行比較,從而確定測試樣品中該分析物的量。除上述以外,適當時可以就報告物部分中任何天然存在或人工產生的同位素豐度對報告物離子(特徵離子)的強度進行校正。有多種方式來校正報告物部分的特徵離子中雜質的同位素豐度。這種校正的一個實例可見於已公開的共同未決共有美國臨時專利申請No.US2005誦0114042A1,其名稱為"MethodandApparatusForDe國ConvolutingAConvolutedSpectrum",2004年8月12日提交。基本說來,可以使用數學公式和計算,通過對標記試劑的重疊同位素簇之巻積鐠進行去巻積來測定與單個標記試劑中同位素簇相關的上P艮質量(upmass)和下限質量(downmass)峰的強度。無論值是如何測得的,越準確地定量每種報告物離子(即特徵離子)的強度,原始樣品中分析物的相對和絕對定量就會越準確。蛋白質組分析本發明的實施方案可用於複雜分析,因為可以使用質量分析技術以快速和重複的方式將樣品複合、分析和再分析。例如,可以分析一種或多種樣品中一種或多種分析物的量。可以分析組成樣品混合物的樣品和質量分析可以快速進行,因此這些方法可以重複多次,使得樣品混合物中許多差異性標記分析物的量都可以就其在該分析物的來源樣品中的相對和/或絕對量進行測定。可以使用這種快速多重分析的一項應用是蛋白質組分析領域。蛋白質組學可以看成是在結構、功能和生物過程調節方面描述基因組序列所編碼信息的實驗性方法。這可通過對細胞或組織所表達的全部蛋白質組分進行系統性分析來實現。與本發明的方法、混合物、試劑盒和/或組合物實施方案聯用的質鐠法是這種全局蛋白質分析的一種可能的工具。因此,可以使用這些標記試劑的實驗性分析包括但不僅限於時程實驗、生物標記分析、多重蛋白質組分析、多維蛋白質鑑定技術實驗(mudpitexperiment)、親和捕獲測定、翻譯後修飾(PTM)和多重對照實驗。//.逸合#在一些實施方案中,本發明涉及由式I表示的化合物,包括其鹽形式和/或水合物形式其中m和n各為0或1,條件是111+11=1,其中該化合物可在報告物部分和/或連接物部分中用一種或多種重原子同位素進行同位素編碼。如上文的詳細描述,反應基團"RG"可包含親核體或親電體,其中所述反應基團能與樣品中一種或多種反應性分析物反應,從而形成一種或多種被標記分析物。如上文的詳細描述,報告物部分"RP"可包含固定電荷或者可在質譜儀中離子化,其中所述報告物部分能在鍵X斷裂後在質鐠儀中產生特徵離子。如上文的詳細描述,"DL"可以是非編碼可檢測標記。如上文的詳細描述,連接物部分"LK"可以是線性或分支的,其中LK將所述反應基團與所述報告物部分及所述非編碼可檢測標記連接在一起。如上文的詳細描述,共價鍵x將報告物部分與連接物部分或非編碼可檢測標記連接在一起,其中鍵X可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂。如上文的詳細描述,Y可以是連接所述反應基團與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中Y任選地可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂。如上文的詳細描述,W可以是連接所述非編碼可檢測標記與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中W任選地可通過施加光、熱和/或化學試劑而切割和/或可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂。在一些實施方案中,該化合物任選地通過可切割連接物與固相支持物連接。在一些實施方案中,該化合物通過報告物部分與固相支持物連接。式I的標記試劑的某些斷裂特性示於圖2a。例如,該組合物可以是式II或III所表示的化合物formulaseeoriginaldocumentpage60其中RG是反應基團,其中該化合物可經同位素編碼(參見圖8a)。式I、II或III的組成物可用於標記分析物,以在本文詳細討論的利用電泳分離技術與質鐠法(如串聯質鐠法)聯用的方法中對其進行分析。式II和III的標記試劑的要素和某些斷裂特性示於圖2b。該組合物可包含同位素富集(即編碼)的報告物部分和/或同位素富集的連接物部分。例如,報告物部分和/或連接物部分可以各自經過同位素富集以包含一種或多種重原子同位素。在一些實施方案中,報告物部分和/或連接物部分可以各自經過同位素富集以包含兩種或更多種重原子同位素。在一些實施方案中,報告物部分和/或連接物部分可以各自經過同位素富集以包含三種或更多種重原子同位素。在一些實施方案中,報告物部分和/或連接物部分可以各自經過同位素富集以包含四種或更多種重原子同位素。在一些實施方案中,報告物部分可以與支持物可切割連接。我們用"可切割連接"來表示可以基於所選擇可切割連接物的性質,通過用適當的因素(例如光、熱和/或化學試劑)進行處理來從支持物上釋放該報告物部分以及與其共價連接的任何部分。多種包含可切割連接物的支持物為本領域所熟知。例如,包含三苯曱基部分的多種支持物是市售的,或者也可以製得(例如三苯甲基氯支持物(Trityl-Cl)或2-氯三苯曱基氯支持物)。參考圖6,展示了與支持物結合的標記試劑的實施方案,其中該標記試劑的報告物部分包含雙-N-烷基化哌溱環,其中該N-烷基化膝漆環的取代基之一是以官能團Q結尾的烷基,其中Q是可以在用酸處理該支持物後釋放以產生被標記分析物的官能團。因此,在一些實施方案中,本發明涉及包含由式r表示的標記試劑組合物,包括其鹽形式和/或水合物形式其中m和n各為0或1,條件是111+11=1,其中該化合物可在報告物部分和/或連接物部分中用一種或多種重原子同位素進行同位素編碼。如上文的詳細描述,反應基團"RG"可包含親核體或親電體,其中所述反應基團能與樣品中一種或多種反應性分析物反應,從而形成一種或多種formulaseeoriginaldocumentpage62被標記分析物。如上文的詳細描述,報告物部分"RP"可包含固定電荷或者可在質鐠儀中離子化,其中所述報告物部分能在鍵X斷裂後在質鐠儀中產生特徵離子。如上文的詳細描述,"DL"可以是非編碼可檢測標記。如上文的詳細描述,連接物部分"LK"可以是線性或分支的,其中LK將所述反應基團與所述報告物部分及所述非編碼可檢測標記連接在一起(參見圖la和lb)。如上文的詳細描述,共價鍵X將報告物部分與連接物部分或與非編碼可檢測標記連接在一起,其中鍵X可通過在質譜儀中施加解離能而斷裂。如上文的詳細描述,Y可以是連接所述反應基團與連接物部分的共價鍵或連接基團,其中Y任選地可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂。如上文的詳細描述,W可以是連接所述非編碼可檢測標記與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中W任選地可通過施加光、熱和/或化學試劑而切割和/或可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂。如上文的詳細描述,SS是通過可切割連接物與該組合物的報告物部分共價連接的固相支持物。式r的標記試劑的某些斷裂特'性示於圖2a。例如,該組合物可以是由式ir或nr表示的化合物,formulaseeoriginaldocumentpage63其中RG是反應基團,SS是固相支持物,CL是可切割連接物,其中該化合物可在報告物部分和/或連接物部分中用一種或多種重原子同位素進行同位素編碼。式ir和nrs的標記試劑的要素和某些斷裂特性示於圖2c。在一些實施方案中,上述式i、n、in、r、ir或nrs的化合物的基團RG可以是羧酸、磺酸、羧醯卣化物、磺醯卣化物、活性酯、混合酸酐、異氰酸鹽/酯或異硫氰酸鹽/酯基團。在一些實施方案中,基團RG可以是馬來醯亞胺基、烷基卣化物基團、a-卣代醯基、a-卣代硫酮基或a-卣代亞胺基。在一些實施方案中,基團RG可以是三苯曱基卣化物或甲矽烷基卣化物。在一些實施方案中,基團RG可以是氨基、羥基或硫醇基。如上述,上文所述組合物可以鹽形式和/或水合物形式存在。該組合物是否以鹽形式存在通常取決於取代基的性質和數目以及其存在和/或進行分離的條件。人們熟知,可以通過用酸處理使鹼性基團(如胺)質子化,從而形成該胺的鹽。例如,含有標記試劑的哌溱可作為單TFA鹽、單HC1鹽、二TFA鹽或二HC1鹽得到(參閱如美國專利公布號US2005-0148771Al)。本領域普通技術人員十分了解如何使用常規實驗和本文的公開內容對本文所述組合物鹽形式的任何平衡離子的電荷態和性質進行操作。組合物是否以水合物形式存在還將取決於其存在或進行分離的條件。水合物只是包含一個或多個絡合的水分子。本發明涵蓋任何可能的水合物形式。在一些實施方案中,本發明還涉及用本文公開的標記試劑組合物進行標記的分析物。因此,在一些實施方案中,本發明涉及由式lA表示的被標記分析物組合物,包括其鹽形式和/或水合物形式其中m和n各為O或l,^ff是m+n-l,其中RP、X、W和DL如上文式I的組合物所述,其中該化合物可在報告物部分和/或連接物部分中用一種或多種重原子同位素進行同位素編碼。如上文的詳細描述,連接物部分"LK"可以是線性或分支的,其中LK將所述分析物與所述報告物部分和所述非編碼可檢測標記兩者(直接或間接)連接在一起。如上文的詳細描述,Y可以是連接所述分析物與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中Y任選地可在質鐠儀中通過施加解離能而斷裂。在一些實施方案中,本發明還涉及由式rA表示的與支持物結合的被標記分析物組合物,包括其鹽形式和/或水合物形式其中m和n各為0或l,^ff是m+n-l,其中SS、RP、X、W和DL如上文式r的組合物所述,其中該化合物可在報告物部分和/或連接物部分中用一種或多種重原子同位素進行同位素編碼。如上文的詳細描述,連接物部分"LK"可以是線性或分支的,其中LK將所述分析物與所述報告物部分和所述非編碼可檢測標記兩者(直接或間接)連接在分析物一起。如上文的詳細描述,Y可以是連接所述分析物與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中Y任選地可在質語儀中通過施加解離能而斷裂。與支持物結合的分析物rA的某些斷裂特性示於圖3a。例如,與支持物結合的被標記分析物可由式ir"或nrA表示,formulaseeoriginaldocumentpage65其中ss是固相支持物,cl是可切割連接物。被標記分析物irA和nrA的要素和某些斷裂特性示於圖3c。分析物已在本文中有所描述。在一些實施方案中,被標記分析物可以是經標記的校正標準品。如本文所述,可以以已知量向混合物中加入校正標準品,有助於對目的分析物進行絕對定量分析。因此,在一些實施方案中,本發明涉及為作為校正標準品而用上述標記試劑組合物進行了標記的目的分析物,例如肽、蛋白質、核酸、碳水化合物、類固醇、脂質、胺基酸、維生素或前列腺素。因此,所述經標記的校正標準品可以是用本文所述標記試劑標記的任何分析物。通常,標記試劑選自一組同分異構和/或同量異位標記試劑,使其與用於標記一種或多種目的測試樣品的標記試劑相比包含獨特的報告物部分,其中以對所述測試樣品中所述分析物的定量為目的。///.標記々為、浙辨才法根據本發明的一些實施方案,可以用上文所述標記試劑來標記分析物,隨後進行測定。可以通過質量分析測定被標記分析物、分析物本身、分析物的一個或多個片段和/或標記的片段。在一些實施方案中,本發明的方法可用於分析同一樣品中的不同分析物,以及用於對兩種或更多種不同樣品中相同和/或不同的分析物進行多重分析。可以混合兩種或更多種不同樣品以形成樣品混合物。在多重分析中,可以使用標記試劑來確定分析物來源於樣品混合物中的哪種樣品。可以測定該分析物在合併形成樣品混合物的所述兩種或更多種樣品的每種中的絕對和/或相對(相對於不同樣品中的同一分析物)量(常以濃度或量表示)。此外,可以使用分析物片段(例如子片段離子)的質量分析來鑑定該分析物和/或該分析物的前體,例如在該分析物由前體分子降解而成的情況下。該分析中使用的樣品可以是包含可用標記試劑的多種同位素編碼形式進行標記的分析物的任何樣品。例如,樣品可以是粗製或經處理的細胞裂解物、體液、組織提取物或細胞提取物。在一些實施方案中,可以在標記之前處理樣品,以製備用於標記反應的分析物或其它樣品組分。樣品可以是分離過程的一個級分。樣品中的分析物可以是可用標記試劑進行標記的任何分析物。例如,分析物可以是肽、蛋白質、核酸、碳水化合物、脂質、類固醇、胺基酸、維生素、前列腺素或分子量小於1500道爾頓(Da)的其它小分子。其它可能的分析物類型已在本文中公開。因此,在一些實施方案中,本發明還涉及包括以下步驟的方法使兩種或更多種樣品(每種樣品包含一種或更多種反應性分析物)與標記試劑組中的不同標記試劑反應,從而產生兩種或更多種差異性標記樣品,所述樣品每個包含一種或多種被標記分析物。所述標記試劑可選自一組同位素編碼的同分異構和/或同量異位標記試劑,其中不同的標記試劑各包含具有獨特質量的報告物部分。所述報告物部分可以是具有本文所述特性的任何報告物部分。例如,所述報告物部分可包含取代或未取代的哌啶、哌溱或嗎啉基團。其它報告物部分的實例也已在上文描述。在一些實施方案中,本發明涉及使兩種或更多種樣品(每種樣品包含一種或多種反應性分析物)與一組同位素富集的同分異構和/或同量異位標記試劑的不同標記試劑反應,從而形成兩種或更多種差異性標記樣品,所述樣品各包含一種或多種被標記分析物,其中該組中的不同標記試劑由式I表示,包括其鹽形式和/或水合物形式其中m和n各為0或l,^ff是m+n-l。才艮據該方法,RG(如上文的詳細描述)是包含親核體或親電體的反應基團,所述反應基團能與樣品中一種或多種反應性分析物反應,從而形成一種或多種被標記分析物。報告物部分RP(如上文的詳細描述)包含固定電荷或者可在質鐠儀中離子化,其中所述報告物部分能在鍵X斷裂後在質鐠儀中產生特徵離子,並且其中每種報告物部分及其相應特徵離子的粗略質量對於該組中的每種標記試劑而言是不同的。對於該組中的每種試劑而言,非編碼可檢測標記"DL"(如上文的詳細描述)是不同的可獨立檢測的非編碼可檢測標記,其中每種非編碼可檢測標記與該組中其它標記試劑的非編碼可檢測標記具有相同的粗略質量和淨電荷。連接物部分"LK,,(如上文的詳細描述)可以是線性或分支的,其中LK將所述反應基團與所述報告物部分和所述非編碼可檢測標記都(直接或間接)連接在一起,其中該組中每種不同試劑的連接物部分的質量補償針對該組中不同標記試劑在報告物部分之間的粗略質量差異,從而對於該組中的每種標記試劑而言,所述報告物部分與所述連接物部分的合計粗略質量都是相同的。所述非編碼可檢測標記連接在一起,其中鍵X可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂。Y(如上文的詳細描述)是連接所述反應基團與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中Y任選地可通過在質譜儀中施加解離能而斷裂,M是如果Y是連接基團則其粗略質量對於該組中的每種標記試劑而言都相同。W(如上文的詳細描述)是連接所述非編碼可檢測標記與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中w任選地可通過施加光、熱和/或化學試劑而切割和/或可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂,a是如果w是連接基團則其粗略質量對於該組中的每種標記試劑而言都相同。在一些實施方案中,用式II或III的標記試劑標記每種差異性標記樣品,formulaseeoriginaldocumentpage68其中RG是反應基團。在一些實施方案中,化合物II和III可以如圖8a所示進行同位素編碼。所述標記方法可產生兩種或更多種差異性標記樣品,每種樣品包含一種或多種被標記分析物。一旦利用對於該樣品而言獨特的標記試劑將每種樣品中的分析物進行標記,則可將兩種或更多種差異性標記樣品或其部分混合而形成樣品混合物。所述樣品混合物可任選地包含一種或多種上述的校正標準品。可記錄組合以形成樣品混合物的被標記分析物的每種樣品的體積和/或量。相對於樣品混合物的總樣品體積和/或量而言,每種樣品的體積和/或量可用來測定來自樣品混合物分析的每種樣品中所鑑定分析物的量(常以濃度和/或量來表示)。因此,樣品混合物可包含複雜的混合物,其中通過對兩種或更多種樣品中的每種中的分析物的量進行相對定量,或者通過絕對定量(其中還將校正標準品加入樣品混合物中)或在可獲得特徵離子的校正曲線的情況下的絕對定量,可將相同和/或不同分析物的相對量進行鑑定和/或定量。在一些實施方案中,該方法還可包括通過電泳分離所述樣品混合物或其部分。例如,所述電泳分離可以是1D電泳分離、2D電泳分離和/或毛細管電泳分離。所述兩種或更多種可檢測標記可以是可獨立檢測的。由於標記可獨立檢測,因此有可能在電泳分離中定位、檢測和/或定量被標記分析物。例如,所述可獨立檢測的非編碼可檢測標記可用於在分離中和/或分離後定位1D或2D凝膠中的被標記分析物。在一些實施方案中,所述標記可用於在分離後定位凝膠中的被標記分析物,從而可將其從凝膠上切下並進一步分析,例如通過下文所述的質鐠法進行分析。例如,所述方法還可包括從電泳分離中收集共遷移的差異性標記分析物的一種或多種子樣品,並在m為0,n為l,W是可通過施加光、熱或化學試劑而切割的共價鍵或連接基團時,任選地在適當條件下處理所述一種或多種子樣品,以從所述子樣品的差異性標記分析物上切下非編碼的可檢測標記。一旦從分析物上切下了非編碼的可檢測標記,就可對其進行進一步分析,例如通過質鐠法進行分析,其中如下文所述可以使用報告物部分的分析來測定和/或確認與用於形成該樣品混合物的每種樣品相關的分析物的相對和/或絕對量。在一些實施方案中,可在毛細管電泳中使用所述非編碼的可檢測標記來檢測和/或定量被標記分析物,因為它們存在於毛細管中。可以基於分析適當的檢測器中由該非編碼可檢測標記產生的信號強度來進行定量。優選地(但不必須),將組中的非編碼可檢測標記選擇成在電泳分離中具有相似的遷移特性(即,它們共遷移)。在一些實施方案中,可以基於非編碼可檢測標記的可獨立檢測的特性,任選地根據目的條件來分析共遷移的差異性標記分析物,並慎重地選擇滿足條件的用於進一步分析,不滿足條件的則棄去。例如,如果共遷移的差異性標記分析物滿足目的條件(例如兩種可獨立檢測的標記的相對量差異不超過10%),則所述共遷移的差異性標記分析物可通過質鐠法進行後續的分析和定量,如果不滿足,則將其棄去。這樣,有可能實現更高效和經濟地使用質鐠設備。在一些實施方案中,所述方法還可包括使用第一質量分析儀對子樣品之一或其級分進行第一質鐠分析。接著可以選擇在第一質量分析中具有特定質荷比的離子。可對選定的離子施加一定水平的解離能(例如碰撞誘發解離(CID)),以誘發斷裂。例如,鍵X的斷裂可從被標記分析物上釋放離子化的報告物部分(即報告物離子或特徵離子)。通過解離能斷裂選定的離子還可產生該分析物的子片段離子,接著可以分析所述子片段離子,以測定該分析物和/或該分析物的一種或多種前體。因此,可在第二質量分析器中對所述離子(剩餘的選定離子、子片段離子和離子化的報告物部分(即特徵離子))或其級分進行分析。在第二質量分析中,可對選定的離子、特徵離子以及子片段離子或其級分進行第二質量分析。所述第二質量分析可測定以選定的質荷比存在的每種獨特報告物離子的粗略質量(或m/z)和相對量,以及該樣品混合物中至少一種被標記分析物的子片段離子中一些或全部的質量(粗略質量和/或絕對質量)。就每種以選定的質荷比存在的分析物而言,可以使用子片段離子來鑑定以選定的質荷比存在的分析物。例如,這種分析可以如上文標題為"通過計算機輔助的資料庫分析來確定分析物,,的章節中所述進行。因此,在一些實施方案中,該方法還包括在第二質量分析中測定每種特徵離子的粗略質量和相對量,以及在第二質量分析中測定一些或全部子片段離子的粗略質量和/或絕對質量。在一些實施方案中,該方法還包括通過對子片段離子的分析來測定與選定的質荷比相關的被標記分析物(和/或其前體)。在一些實施方案中,該方法的一個或多個步驟可以重複一次或多次。例如,在一些實施方案中,可以如前述對在第一質鐠分析中具有選定質荷比的離子(不同於任何之前選定的質荷比)進行解離能處理,從而形成離子化的報告物部分(即特徵離子)和選定離子中至少一些的子片段離子。可以對選定的離子、報告物離子和/或子片段離子或其級分進行第二質量分析。還可以測定第二質量分析中每種獨特的特徵離子的粗略質量和相對量以及子片段離子的質量(粗略質量或絕對質量)。任選地,可以通過對子片段離子的分析來確定與選定的質荷比相關的被標記分析物(或前體分子)。這樣,所述信息可用於鑑定和/或定量來自第一質量分析的一種或多種其它分析物。在一些實施方案中,在樣品混合物已分級(例如通過電泳分離)時,對不同的所收集子樣品重複該方法(或該方法的某些步驟)一次或多次可能是有用的。通過對該樣品的一種或多種其它級分重複該方法,有可能更完整地分析該樣品混合物。因此,該方法可包括選擇不同的子樣品並對該子樣品進行第一質量分析,接著重複一次或多次前述的後續步驟。在一些實施方案中,在樣品混合物已分級時,通過收集來自電泳分離的共遷移差異性標記分析物的一種或多種不同子樣品將該方法重複一次或多次可能是有用的。通過重複該方法以收集一種或多種其它子樣品,有可能更完整地分析該樣品混合物。因此,該方法可包括從電泳分離中收集共遷移的差異性標記分析物的一種或多種不同的子樣品,接著將前述後續步驟重複一次或多次還考慮到在一些實施方案中,將整個方法重複一次或多次,在每次重複時,某些步驟也可以如上述重複一次或多次。這樣,可以在可能的最大程度上分析和確定樣品混合物的內容。在一些實施方案中,還可以對一組新的兩種或更多種樣品重複整個方法。如前述,在一些實施方案中,同分異構和/或同量異位物標記試劑組中的標記試劑可與支持物結合。因此,除了從支持物上重俘獲被標記分析物以外,上述方法還可以使用與支持物結合的試劑來進行。因此,在一些實施方案中,本發明涉及實施任何上述方法,其中該組中每種不同的標記試劑都是與支持物結合的,並通過可切割連接物與支持物連接,使得每種不同樣品與帶有該組中不同標記試劑的支持物反應,並且其中該方法在進行樣品標記的步驟之後和進行混合經標記樣品以製備樣品混合物之前還包括i)任選地清洗每種支持物,以除去每種樣品中不與支持物上所結合標記試劑的反應基團反應的組分;ii)切割所述可切割連接物,以從每種支持物上釋放被標記分析物,每種不同標記的樣品包含一種或多種被標記分析物,其中與特定樣品相關的被標記分析物可通過與其相連的獨特質量的報告物部分來鑑定和/或定量;和m)任選地收集每種樣品的被標記分析物,之後根據步驟(b)將其混合。例如,可以4吏用一組同位素標記試劑來實施該方法,其中該組中每種不同的標記試劑以式r表示,包括其鹽形式和/或水合物形式:formulaseeoriginaldocumentpage72其中m和n各為O或l,^ff是m+i^1。根據該方法RG(如上文的詳細描述)為包含親核體或親電體的反應基團,其中所述反應基團能與樣品中一種或多種反應性分析物反應,從而形成一種或多種被標記分析物。報告物部分"RP"(如上文的詳細描述)包含固定電荷或者可在質i普儀中離子化,其中所述報告物部分在質脊R中能在鍵X斷裂後產生特徵離子,並且其中每種報告物部分及其相應特徵離子的粗略質量對於該組中的每種標記試劑而言是不同的。非編碼的可檢測標記"DL"(如上文的詳細描述)是對該組中的每種標記試劑而言不同的可獨立檢測的非編碼可檢測標記,其中每種非編碼可檢測標記與該組中其它標記試劑的非編碼可檢測標記具有相同的粗略質量和相同的淨電荷。連接物部分"LK"(如上文的詳細描述)可以是線性或分支的,其中LK將所述反應基團與所述報告物部分和所述非編碼可檢測標記二者(直接或間接地)連接在一起,其中該組中每種不同試劑的連接物部分的質量補償針對該組中所述不同標記試劑在報告物部分之間的粗略質量差異,使得報告物部分與連接物部分的合計粗略質量對於該組中的每種標記試劑而言都是相同的。共價鍵X(如上標記連接在一起,其中鍵X可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂。Y(如基團,其中Y任選地可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂,M是如果Y是連接基團則其粗略質量對於該組中每種標記試劑而言都是相同的。W(如鍵或連接基團,其中W任選地可通過施加光、熱和/或化學試劑而切割和/或可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂;M是如果W是連接基團則其粗略質量對於該組中每種標記試劑而言都是相同的。SS(如上文的詳細描述)是通過可切割連接物與標記試劑的報告物部分共價連接的固相支持物,在一些實施方案中,標記試劑之一可由式ir或nr表示,formulaseeoriginaldocumentpage73其中RGM應基團,SS是固相支持物,CL是可切割連接物。在一些實施方案中,化合物ir或nr可以如圖8b所示進行同位素編碼。質鐠領域的普通技術人員會理解,上述方法中的第一和第二質量分析可在串聯質語儀中進行。適於進行串聯質量分析的儀器已在上文描述。儘管串聯質鐠儀是優選的,但單級質譜儀也可以使用。例如,可以通過錐電壓斷裂來誘發分析物斷裂,接著使用單級四極杆或飛行時間質鐠儀對得到的片段進行質量分析。在另一個例子中,可以使用雷射源對分析物施加解離能,接著使用飛行時間的源後衰變或串聯飛行時間(TOF-TOF)質譜儀來記錄得到的片段。在一些實施方案中,本發明的方法還可包括在對樣品中的分析物進行標記之前用至少一種酶消化每種樣品和/或樣品混合物,以部分或全部降解該樣品和/或樣品混合物的組分(還可參見上文標題為"樣品處理"的章節)。例如,所述酶可以是蛋白酶(以降解蛋白質和/或肽)或核酸酶(以降解核酸)。還可以一起使用兩種或更多種酶,以進一步降解樣品組分。例如,所述酶可以是蛋白水解酶例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、鏈黴蛋白酶、糜蛋白酶或羧肽酶(例如A、B、C等)。在一些實施方案中,該方法還可包括在進行第一質量分析之前通過應用除電泳以外的其它分離方法來分離樣品混合物(還可參閱上文標題為"分離,包括分離樣品混合物,,的章節)。例如,可以使用液相色鐠/質鐠(LC/MS)在質量分析之前實現這樣的樣品分離。在一些實施方案中,所述方法可以與消化和額外的分離步驟一起實施。雖然這些步驟是任選的,但可將它們一起實施,例如,當進行蛋白質組分析從而測定細胞中蛋白質的上調和下調時。在一些實施方案中,可將方法的各步驟(無論有或沒有消化和/或額外的分離步驟)重複一次或多次,從而鑑定和/或定量樣品中的一種或多種其它的分析物或者兩種或更多種樣品(包括利用與支持物結合的標記試劑標記的樣品)中的每種樣品中的一種或多種分析物。根據樣品混合物中是否存在校正標準品或者是否可獲得特徵離子的校正曲線,特定分析物的定量可以相對於其它的被標記分析物,或者特定分析物的定量可以是絕對的。如前所述,可通it^"子片段離子的質量(粗略質量或絕對質量)的分析而測定與所選離子相關的分析物。一種這樣的方法描述於標題為"通過計算機輔助資料庫分析進行的分析物測定,,的部分中。一旦已對分析物進行了測定,則關於第二質量分析中每種獨特報告物離子的粗略質量和相對量的信息以及子片段離子質量的信息可為確定有關樣品混合物的其它信息提供^。特徵離子(報告物離子)的相對量可通過質鐠中的峰強度來測定。在一些實施方案中,可以通過分析使用質鐠儀得到的報告物離子(特徵離子)峰高或峰寬(或峰面積)來測定每種獨特特徵離子的量。由於每種樣品可以使用不同的標記試劑來標記,並且每種標記試劑可包含產生獨特的特徵離子的獨特的報告物部分,所述獨特的特徵離子可與用於製備該樣品混合物的特定的差異性標記樣品相關聯,因此在第二質量分析中對不同報告物離子的測定可用於鑑定所選分析物的特徵離子所來源的差異性標記樣品。當發現多種特徵離子時(例如根據本發明的多重方法),可以相對於其它特徵離子來測定每種獨特特徵離子的相對量。由於第二質量分析中測定的每種獨特特徵離子的相對量可與樣品混合物中分析物的相對量相關,因此可以測定合併成該樣品混合物的每種差異性標記樣品中分析物的相對量(常以濃度和/或量表示)。此外,當所測定的分析物是來自另一種目的化合物的副產物時(例如,分析物是降解反應的副產物,例如分析物是蛋白質消化產生的肽),有可能將分析物的定量信息與原始的差異性標記樣品相關聯。如上所述,可針對具有不同質荷比的所選離子重複該分析一次或多次,從而獲得組合而形成樣品混合物的每種樣品中的一種或多種其它被測分析物的相對量。此外,根據需要,可對與每種獨特特徵離子相關的峰強度進行天然或人工產生的同位素豐度的校正,如前面在標題為"分析物的相對和絕對定量"的部分中所述的。例如,分析物可以是樣品或樣品混合物中的肽。對樣品或樣品混合物中肽的分析可用來測定樣品或樣品混合物中可鑑定蛋白質的量(常表示為濃度和/或量),其中一種或多種樣品中的蛋白質可在第一質量分析之前被降解,並且其中樣品中蛋白質的量是基於兩種或更多種差異性標記樣品(其混合而形成所述樣品混合物)之每種中的一種或多種肽的身份和相對量而測定的。此夕卜,可為了測定的目的而將來自不同樣品的信息進行比較,比如為比較與不同濃度的基質(其可影響細胞生長、發育、分化和/或死亡)一起孵育對細胞中蛋白質的量的作用。其它非限定性的實例可包括對患病或健康組織或細胞培養物中所表達的蛋白質成分的比較。這可涵蓋在傳染性物質(比如細菌或病毒或其它疾病狀態比如癌症)感染後對細胞、組織或生物流體中所表達的蛋白質水平的比較。在另一些實例中,可進行蛋白質濃度隨時間變化(時間-過程)的研究以檢驗藥物治療對細胞或組織中所表達蛋白質成分的作用。在另一些實例中,來自隨時間不同所取的不同樣品的信息可用於檢查或監測作為疾病(例如癌症)或感染之結果的特定蛋白質在組織、器官或生物流體中的濃度。這些實驗可包括一個或多個對照樣品。在一些實施方案中,所述實驗可用於測定兩個或更多個上述所關注的性質。在已向樣品混合物中加入已知量(常表示為濃度和/或量)的校正標準品(包含與具有所選質荷比的分析物相連的獨特報告物部分)用於所測分析物的情況下,可利用所述與校正標準品相關的獨特特徵離子的量來測定每種樣品(其組合而形成樣品混合物)中分析物的絕對量(常表示為濃度和/或量)。這是可能的,因為與樣品混合物中校正標準品的獨特特徵離子相關的分析物的量是已知的,並且對於與所選離子相關的被標記分析物而言,相對於所述校正標準品的特徵離子的強度,可以測定所有獨特特徵離子的相對量。因為對於每種獨特的才艮告物部分(包括所述校正標準品的報告物部分)而言,所測的每種獨特特徵離子的相對量與和每種差異性標記樣品(其組合而形成樣品混合物)相關的分析物的量成比例,參考基於一定比例(參考用於製備產品混合物的配方而計算的)的獨特質量的每種不同的特徵離子的量,可確定每種樣品中分析物的絕對量(常表示為濃度和/或量)。根據需要,可對與每種獨特的特徵離子相關的峰強度針對天然或人工產生的同位素豐度進行校正。這樣的分析方法尤其可用於具有複雜性質的多重樣品的蛋白質組分析,特別是在第一質量分析之前進M標記分析物預分離(例如液相色鐠分離或電泳分離)的情況下。例如,如果樣品混合物包含100fmol/mL的校正標準品,並且與所述校正標準品相關的獨特的特徵離子的相對強度是1,而與第一樣品相關的第一其它獨特特徵離子的相對強度是二分之一併且與第二樣品相關的第二其它獨特特徵離子的相對強JLA2,則所述第一差異性標記樣品(其混合而形成樣品混合物)中分析物的量(假定等量的樣品1和樣品2混合而形成所述樣品混合物)是50fmol/mL(0.5x100fmol/mL),所述第二差異性標記樣品(其混合而形成樣品混合物)中分析物的量是200fmol/mL(2x100fmol/mL)。另夕卜,如果例如所述分析物是與特定蛋白質相關的肽,那麼可推出樣品l中蛋白質的量是50fmol/ml,樣品2中蛋白質的量是200fmol/ml。因此,校正標準品的存在使得可進行每種差異性標記樣品(其混合而形成樣品混合物)中被標記分析物(以及在某些情況下其前體)的絕對定量。由於所述分析物可以是前體分子,因此在一些實施方案中,所述分析物可以是肽,可以基於混合形成該樣品混合物的兩種或更多種差異性標記樣品之每種中一種或多種肽的身份和絕對量來測定混合形成該樣品混合物的兩種或更多種差異性標記樣品之每種中一種或多種蛋白質的身份和絕對量。如前所述,可針對具有不同質荷比的所選離子重複該分析一次或多次,從而獲得每種樣品(其組合而形成樣品混合物)中一種或多種其它被測分析物的絕對量。此外,需要時,可如前述對與每種獨特報告物離子相關的峰強度針對天然或人工產生的同位素豐度進行校正。在一些實施方案中,可以使用與支持物結合的標記試劑來實施本文所述的方法,其中該組中每種不同的標記試劑都是與支持物結合的,並通過可切割連接物與支持物連接,使得每種不同樣品與帶有該組中不同標記試劑的支持物反應。示例性支持物已在上文標題為"組合物"的章節中討論(還可參見圖6)。根據該方法,可以任選地在使分析物與支持物上結合的標記試劑反應之後而在混合樣品之前清洗所述支持物,以除去不與經標記試劑的反應基團反應的組分。一旦使分析物與標記試劑反應以形成被標記分析物並任選地進行了清洗步驟之後,可以通過在切割可切割連接物的條件下處理支持物i(U^支持物上釋放被標記分析物。切割後,可以任選地收集兩種或更多種差異性標記樣品,每種樣品包含一種或多種被標記分析物,其中與特定樣品相關的被標記分析物可通過與其相連的獨特報告物部分來鑑定和/或定量。無論是否單獨收集,都可以混合切割產物以形成樣品混合物。IV.混合物在一些實施方案中,本發明涉及混合物(即樣品混合物)。例如,所述混合物可包含含有同位素編碼的同分異構和/或同量異位標記物的被標記分析物。被標記分析物的示例性混合物及其製備方法和/或分析方法已經在上述標題為"用於標記和分析的方法"的部分中進行了描述。可通過將兩種或更多種標記反應產物的全部或部分混合而形成混合物,其中利用標記試劑組中的不同標記試劑#^種樣品進行標記,其中每種標記試劑包含具有獨特(大致)質量的l艮告物部分以及非編碼的可檢測標記物。可以由兩種或更多種被標記分析物中的每種所得自(即來源)的標記Jl應鑑定所述每種不同標記試劑的獨特的報告物部分。非編碼的可檢測標記物可用來在電泳分離期間定位被標記分析物。與這些方法相關的標記試劑和被標記分析物的性質已在前面論述過。混合物的一種或多種分析物可以是肽。混合物的一種或多種分析物可以是蛋白質。混合物的一種或多種分析物可以是肽和蛋白質。混合物的一種或多種分析物可以;l核酸分子。混合物的一種或多種分析物可以;l碳水化合物。混合物的一種或多種分析物可以AJI旨質。混合物的一種或多種分析物可以^ja固醇。混合物的一種或多種分析物可以是維生素。混合物的一種或多種分析物可以是前列腺素。混合物的一種或多種分析物可以是胺基酸。混合物的一種或多種分析物可以是質量小於1500道爾頓的小分子。在一些情況下,分析物可以是多種分析物類型的混合物。例如,混合物中的分析物包括脂質和膽固醇;或者2)蛋白質、肽、胺基酸、脂質、膽固醇和碳7JC化合物。混合物可包含利用本文中所公開的新型標記試劑標記的任何類型的差異性標記分析物,包括含有兩種或更多種不同分析物類型的混合物。例如,所述混合物可包含至少兩種差異性標記分析物,其中所述混合物通過將至少兩種不同樣品的標記反應產物混合在一起而形成,每種樣品使用來自一組同位素編碼的同分異構和/或同量異位標記試劑的不同標記試劑進行標記,其中該混合物中每種差異性標記分析物由式iA表示,包括其鹽形式和/或水合物形式其中m和n各為0或l,條件是111+11=1。報告物部分"RP"(如上文的詳細描述)包含固定電荷或者可在質鐠儀中離子化,其中所述淨艮告物部分能在質鐠儀中在鍵X斷裂後產生特徵離子,並且其中每種報告物部分及其相應特徵離子的粗略質量對於每種不同樣品而言是不同的,這取決於使用該組中哪種標記試劑來標記^f羊品。非編碼的可檢測標記"DL"(如上文的詳細描述)對該組中的每種不同標記試劑而言是不同的,其中每種不同非編碼可檢測標記與該組中其它標記試劑的其它非編碼可檢測標記具有相同的粗略質量和相同的淨電荷。連接物部分"LK"(如上文的詳細描述)可以是線性或分支的,其中LK將所述分析物與所述才艮告物部分和所述非編碼可檢測標記二者(直接或間接地)連接在一起,其中該組中每種不同標記試劑的連接物部分的質量補償針對該組中所述不同標記試劑在報告物部分之間的粗略質量差異,4吏得才艮告物部分與連接物部分的合計粗略質量對於該組中的每種標記試劑而言都是相同的。X(如上文的詳細描述)一起的共價鍵,其中鍵X可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂。Y(如上文的詳細描述)是連接所述分析物與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中Y任選地可通過在質譜儀中施加解離能而斷裂,條件是如果Y是分析物連接基團則其粗略質量對於該組中每種標記試劑而言都是相同的。w(如鍵或連接基團,其中w任選地可通過施加光、熱和/或化學試劑而切割和/或可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂;4Hf是如果W是連接基團則其粗略質量對於該組中每種標記試劑而言都是相同的。被標記分析物lA的某些斷裂特徵示於圖3a。例如,該混合物可包含至少一種由式IlA或IIlA表示的被標記分析物,formulaseeoriginaldocumentpage79分析物I卩和IIlA的要素和某些斷裂特徵示於圖3b。在一些實施方案中,所述混合物通過使用與支持物結合的標記試劑來製備,並從支持物上切下被標記分析物以形成混合物。因此,在某些實施方案中,本發明涉及含有至少兩種差異性標記分析物的混合物,其中通過混合至少兩種不同樣品的標記反應產物形成所述混合物,每種樣品使用選自一組同位素編碼的同分異構和/或同量異位標記試劑的不同標記試劑進行標記,其中該混合物中每種差異性標記分析物由式rAx表示,包括其鹽形式和/或水合物形式其中m和n各為0或l,條件是m+i^1。報告物部分"RP"(如上文的詳細描述)包含固定電荷或者可在質鐠儀中離子化,其中所述報告物部分能在質譜儀中在鍵X斷裂後產生特徵離子,並且其中每種報告物部分及其相應特徵離子的粗略質量對於每種不同樣品而言是不同的,這取決於使用該組中哪種標記試劑來標記樣品。非編碼的可檢測標記"DL"(如上文的詳細描述)對該組中的每種不同標記試劑而言是不同的,其中每種不同的非編碼可檢測標記與該組中其它標記試劑的其它非編碼可檢測標記具有相同的粗略質量和相同的淨電荷。連接物部分"LK"(如上文的詳細描述)可以是線性或分支的,其中LK將所述分析物與所述報告物部分和所述非編碼可檢測標記二者(直接或間接地)連接在一起,其中該組中每種不同試劑的連接物部分的質量補償針對該組中所述不同標記試劑在報告物部分之間的質量差異,使得所述報告物部分與所述連接物部分的合計粗略質量對於該組中的每種標記試劑而言是相同的。X(如上文的詳細描述)是將所述報告物部分與所述連接物部分或所述非編碼可檢測標記連接在一起的共價鍵,其中鍵X可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂。Y(如上文的詳細描述)是連接所述分析物與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中Y任選地可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂,M是如果Y是連接基團則其粗略質量對於該組中每種標記試劑而言都是相同的。W(如上文的詳細描述)是連接所述非編碼可檢測標記與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中W任選地可通過施加光、熱、化學試劑而切割和/或可通過在質i普儀中施加解離能而斷裂,M是如果W是連接基團則其粗略質量對於該組中每種標記試劑而言都是相同的。Q,是同從固相支持物上切割所述差異性標記分析物而形成的官能團。例如,Q,可以是烷基氨基、烷基羥基或烷基硫醇基。例如,所述混合物可包含至少一種由式ir^或nrsAx表示的被標記分析物,formulaseeoriginaldocumentpage81其中Q,是通過從固相支持物上切割所述差異性標記分析物而形成的官能團。被標記分析物irsAx和nrAx的要素和某些斷裂特徵示於圖3d。k試浙盒在一些實施方案中,本發明涉及試劑盒。所述試劑盒可包含一種或多種如上所述的標記試劑以及一種或多種其它試劑、容器、酶、緩衝液和/或說明書。例如,該試劑盒的試劑可選擇成用於測定或定量兩種或更多種樣品中的一種或多種分析物。該試劑盒可包含一組兩種或更多種標記試劑以及一種或多種其它試劑、容器、酶、緩衝液和/或說明書。試劑盒中標記試劑的兩種或更多種可以是同分異構和/或同量異位的。所述標記試劑可以是經同位素編碼的。該試劑盒的標記試劑可以是本文所述的任何標記試劑。例如,該試劑盒的一種或多種標記試劑可以是上文所述式i、ii、iii、r、ir和/或nr的化合物(包括化合物組),包括其同位素編碼的形式。在一些實施方案中,該試劑盒可包含前述式iA、nA、niA、rAx、irAx和/或nrsAx的被標記分析物,包括其同位素編碼的形式。該試劑盒中標記試劑的其它特性已經公開。在一些實施方案中,該試劑盒中的至少一種其它試劑是包含報告物部分的經標記校正標準品。在一些實施方案中,所述報告物可與該試劑盒中任何化合物(即標記試劑)相比具有獨特的質量。例如,該試劑盒可用於對同一樣品或者兩種或更多種不同樣品中的一種或多種分析物進行多重分析。實施例甲"參孝以7",滋辨迷一步理庠本|銀我,^才面,摩迷豸滋辨不^理岸力"任命才式'艱斧/本發銀教爭^態渾。實施例l:標記試劑的建議合成途徑參考圖9a和9b,展示了示例性標記試劑III的建議合成途徑。應該理解,可以通過簡單替換適當的螢光染料而使用相同的方法來製備示例性標記試劑II。還應該理解,可以用適當編碼的起始材料製備具有同位素富集位點的組合物。參考圖9a,在氫化鈉(NaH)存在下使化合物10與化合物11反應,以生成產物化合物12。用乙酸酐(Ac20)處理化合物12,形成化合物13。用化合物14(包括其同位素編碼的形式,例如參見下文實施例2)處理化合物13,生成化合物15。參考圖9b,接著用甲醇(MeOH)和二環己基碳二亞胺(DCC)處理化合物15,生成化合物16。接著在二嚅烷中用鹽酸(HC1)處理化合物16,生成化合物17。接著在鹼性條件下用非親核鹼(例如三乙胺(Et3N)和活化(例如作為N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS酯)活化)的非編碼可檢測標記(例如化合物18)處理化合物17,生成化合物19。化合物18是一種可能的非編碼可檢測標記,該標記由本文所述式III表示。還可以使用非編碼可檢測標記的活化形式(例如由式II化合物表示的形式)來形成同分異構和/或同量異位標記試劑組的伴侶標記。接著用強鹼(例如氫氧化鈉(NaOH))處理化合物19,以使該甲基酯皂化,並通過用N-羥基琥珀醯亞胺-三氟乙酸(NHS-TFA)處理轉化成N-羥基琥珀醜亞胺酯,生成標記試劑20,NHS-TFA是公知適於將羧酸基轉化成N-琥珀醯亞胺酯的試劑(見圖7)。實施例2:編碼的報告物分子的建議合成路線(i)合成BocNH13CH213CH2OH(31)參考圖10a,將BocNH13CH213COOH(30,P/N:Aldrich604992;10g,56.44mmol)轉移至裝有隔板、磁力攪拌棒和氬氣輸入線的500mL雙頸圓底瓶中。用氬氣衝洗該系統後,使用壓力差通過插管轉移乾燥的四氫呋喃(THF,P/N:Aldrich,186562;100mL),並在室溫下攪拌直至獲得澄清溶液。接著將反應混合物冷卻至ot:,經歷io分鐘通過插管將曱硼烷畫THF複合物(BH3THF,P/N:Aldrich176192,1M,197mL)溶液加入到反應混合物中。接著在0x:下使反應繼續進行90分鐘。用曱醇(MeOH)猝滅反應混合物的小等分試樣,並通過薄層色鐠(TLC)進行分析,該分析顯示完全消耗了起始材料30並形成了產物31(&30=0.00,Rf31=0.20;1:1己烷畫乙酸乙酯(EtOAc);通過用乙醇(EtOH)中3%(重量/體積)的水合茚三酮溶液加熱來使TLC顯色)。通過緩慢加入甲醇(100mL,經歷20分鐘)來猝滅(在0X:下)反應。減壓除去揮發物。將這樣獲得的油從額外的甲醇(50mL)中共蒸發,並通過柱色譜純化(進行兩次,120gSiO2柱Isco.;85mL/分鐘,0-10分鐘己烷中的40%EtOAc,10-25分鐘己烷中的卯%EtOAc。收集18mL級分,39-55級分含有純產物),得到BocNH13CH213CH2OH(31)的無色油(7.40g,81。/。)。(ii)合成BocNHCH2CH2OMs(32)參考圖10b,歷經1分鐘一邊攪拌一邊向31(1.15g,7.13mmol)、Et3N(2.5mL,17.82mmol)的二氯曱烷(DCM,100mL)水冷溶液中加入甲磺醯氯(MsCI,P/N:Fluka64260,0.664mL,8.55mmol)。在0X^再經過15分鐘後,通過TLC分析反應混合物,其顯示形成了新產物(Rf31=0.20,Rf32=0.42;1:1己烷畫EtOAc;通過用乙醇(EtOH)中3%(重量/體積)的水合茚三酮溶液加熱來使TLC顯色)。使DCM蒸發,將黃色固體溶於乙醇(300mL)中。用HC1(1M,100mL)洗滌乙醇層,其後用鹽水洗滌(50mLx2),用Na2S(Xi乾燥並濃縮得到黃色油,無需純化即可用於下一步反應。(iii)合成BocNHCH2CH2NHMe(33)參考圖10c,使用最低量的THF將BocNHCH2CH2OMs(32)(1.42g,5.94mmol)轉移至Chem-Glass壓力管,並加入60mL甲胺(MeNH2,P/N:Aldrich395056,THF中2.0M,120mmol)溶液,加蓋並在40畫45t:加熱(同時攪拌)3小時,接著在RT下過夜(使用防護罩)。TLC分析(l:lEtOAc-己烷)顯示,完全消耗了32並形成了新產物(Rf33=0.38;1:1DCM-MeOH+1%(體積/體積)Et3N;TLC板首先加熱5分鐘以除去Et3N,接著通過用EtOH中3%(重量/體積)的水合茚三酮溶液加熱來顯色。接著將反應混合物濃縮成油,並通過柱色譜純化(40gSi2柱Isco.;40mL/分鐘,柱用EtOAc平衡,用1:1的MeOH-DCM+1%Et3N(體積/體積)洗脫。收集18mL級分,級分13-19中含有純產物),得到BocNH13CH213CH2NHMe33的無色油(0.79g,76%)。ES-MS(在MeOH中直接浸出)計算值MH+13C2C6H18N202+H+=177.14,觀察值MH+=177.14。(iv)合成NH2CH2CH2NH(Me)Fmoc(34)參考圖10d,向充分攪拌的BocNH13CH213CH2NHMe(33,1.78g,10.2mmol)的丙酮溶液(125mL)中加入Fmoc-OSu(P/N:AdvanceChemTechRC8015,3.46g,125mL丙酮中10.2mmol)溶液。在室溫下將該混合物攪拌10分鐘。在此時向反應混合物中加入NaHC03(飽和的,25mL)溶液,以將pH調節至8-9,再劇烈攪拌30分鐘(兩相反應)。丙酮蒸發後,使產物在乙醇(500mL)與稀(水)鹽酸(HCI,30mL,1M)+30mL鹽水之間分層。接著用HC1(30mL,1M)+30mL鹽水洗滌乙醇層,其後用NaHC03(10mL)+鹽水(60mL)以及鹽水(50mLx2)洗滌,用Na2S04乾燥並濃縮得到粘稠的無色油。接著將該油溶於DCM(50mL)中,加入HC1的二喵烷溶液(4M,50mL)並在室溫下將反應混合物攪拌30分鐘。減壓除去揮發物,得到白色乾燥固體,用7:3的EtOAc-己烷清洗,得到NH213CH213CH2N(Fmoc)Me34的固體。(v)合成部分編碼的報告物/連接物部分(35)參考圖11,向34(3份)和N,N,-二異丙基乙胺(DIEA,6份)的DCM溶液中加入固體三苯甲基氯樹脂(AdvanceChemTech,P/NSC5028,1份)並混合30分鐘。接著過濾樹脂並用DMF清洗。接著用20。/。哌啶的N,N'-二曱基曱醯胺(DMF)溶液處理該樹脂5分鐘,並用DMF清洗。向N-曱基派漆乙酸(ChessGmbH,P/N2022,3份)和0-(7-偶氮苯並三唑國1誦基)國N,N,N',N,-四甲基脲六氟磷酸酯HATU(3份)的N-甲基國2畫吡咯烷酮(NMP)溶液中加入DIEA(9份)。將其混合l分鐘然後加入到樹脂中。偶聯30分鐘後,用NMP清洗樹脂,其後用乙腈清洗。使用DCM中的15。/。TFA從樹脂上切下產物(35),得到TFA鹽的化合物。應該理解,編碼的N-曱基哌漆乙酸(編碼的N-甲基哌溱乙酸的示例性合成可參閱如美國公開專利申請US2005-0148774Al和US2005-01448773Al)和非編碼的NH2CH2CH2N(Fmoc)Me34,(圖12)可在合成反應中被取代,由此生成相應形式的化合物35(在圖12中標為35,),其中該報告物包含同位素富集的位點(參閱如圖12所示的替代性合成)。通過仔細選擇起始材料,可以使用所示方法製備基本上所有預期的化合物35的編碼形式。在一些實施方案中,所述編碼的N-甲基哌嗪乙酸部分可選自由下式表示的化合物36或37,3637其中*表示用"c替代"c。實施例3:標記試劑的替代性建議合成途徑參考圖13和14,展示了標記試劑的替代性合成途徑,其中將非編碼可檢測標記與標記試劑其餘部分可切割地連接的連接物與上文實施例1的描述相比是倒置的。參考圖13a,將螢光染料40(應該理解,可選擇產生本文所述式II化合物的焚光染料)與化合物41在二環己基碳二亞胺(DCC)存在下反應,生成化合物42。接著通過用三氟乙酸(TFA)處理來除去化合物42中的叔丁基羰基(t-boc或Boc),生成以其TFA鹽形式存在的化合物43。參考圖13a,同圖14中使用的化合物43,一樣,化合物43還以簡略方式顯示。參考圖13b,將化合物44(可根據Fadeev,EvgenyA.;Luo,Minkui;Groves,JohnT.5ywAes/sflwd欲w""ni/wocfe//wg</幼efl附/7/ri》/r,7/c5iV/m//^e由'zo6fl",7i-702Jfl/irffl/ifl/ogs:Bioorganic&MedicinalChemistryLetters(2005),15(16),3771-3774來製備)與化合物35(應該理解,根據所期望的試劑,可以使用化合物35的多種編碼或非編碼的形式)在非親核有機鹼(例如三乙胺(Et3N)或N,N,-二異丙基乙胺(DIEA))存在下反應,生成化合物45。將化合物45與千基溴(BnBr)在無機鹼(碳酸銫(CsC03))存在下反應,形成化合物46。接著通過用TFA處理來除去化合物46的M)oc基團,生成化合物47。接著將化合物47與HATU在非親核有機鹼(例如DIEA)存在下反應,接著與化合物43'反應生成化合物48。接著用氫(112)和鈀(Pd)催化劑處理化合物48,從而將該千基酯轉化成羧酸基,再將所述羧酸基與N-羥基琥珀醯亞胺-三氟乙酸(NHS-TFA,化合物50)反應,形成標記試劑49的NHS酯。實施例4:非編碼可檢測標記的建i義合成途徑作為非編碼可檢測標記的螢光染料可以是可用的染料和/或市售染料的修飾形式。例如,參考圖14,具有通式III的本文所述化合物包含TAMRA部分,其中TAMRA是來自多種來源的市售染料。為了製備包含與TAMRA相同的質量和電荷的螢光染料,圖14也展示了對於通式II的化合物所使用染料的建議合成途徑。該建議合成遵循熟知的合成途徑,其中用酚類化合物的N-甲基衍生物60取代其N-乙基形式,生成以其二TFA鹽形式存在的預期染料65。參考圖14,可通過在高溫下用聚磷酸長時間處理化合物60與化合物61的混合物來製備染料65。螢光染料生產領域的技術人員會了解如何進行這種混合。該反應生成化合物62和63,其中分離化合物63並轉化成鹽形式64。接著可用三氟乙酸/三乙胺處理化合物64,生成雙三氟乙酸酯65。儘管結合多個實施方案描述了本發明,但本發明並不旨在受限於這些實施方案。相反,本領域技術人員會理解,本發明涵蓋多種替代方案、改變和等同方案。權利要求1.由式I表示的化合物,包括其鹽形式和/或水合物形式其中i)RG為包含親核體或親電體的反應基團,其中所述反應基團能與樣品中一種或多種反應性分析物反應,從而形成一種或多種被標記分析物;ii)RP是報告物部分,其包含固定電荷或者可在質譜儀中離子化,其中所述報告物部分能在質譜儀中在鍵X斷裂後產生特徵離子;iii)DL是非編碼的可檢測標記;iv)LK是連接物部分,其可以是線性或分支的,其中LK將所述反應基團與所述報告物部分和所述非編碼可檢測標記二者連接在一起;v)X是將所述報告物部分與所述連接物部分或所述非編碼可檢測標記連接在一起的共價鍵,其中X可通過在質譜儀中施加解離能而斷裂;vi)Y是連接所述反應基團與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中Y任選地可通過在質譜儀中施加解離能而斷裂;vii)W是連接所述非編碼可檢測標記與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中W任選地可通過施加光、熱和/或化學試劑而切割和/或可通過在質譜儀中施加解離能而斷裂;和viii)m和n各為0或1,條件是m+n=1;其中所述化合物任選地通過可切割連接物與固相支持物連接。2.權利要求l的化合物,由式II表示formulaseeoriginaldocumentpage3其中RG是所述反應基團。3.權利要求l的化合物,由式III表示:formulaseeoriginaldocumentpage3其中RG是所述反應基團。4.權利要求i的化合物,由式rs表示,包括其鹽形式和/或水合物形式:formulaseeoriginaldocumentpage3其中:i)RG為包含親核體或親電體的反應基團,其中所述反應基團能與樣品中一種或多種反應性分析物反應,從而形成一種或多種被標記分析物;ii)RP是報告物部分,其包含固定電荷或者可在質譜儀中離子化,其中所述報告物部分能在質讒儀中在鍵X斷裂後產生特徵離子;iii)DL是非編碼的可檢測標記;iv)LK是連接物部分,它可以是線性或分支的,其中LK將所述反應基團與所述報告物部分和所述非編碼可檢測標記二者連接在一起;v)X是將所述報告物部分與所述連接物部分或所述非編碼可檢測標記連接在一起的共價鍵,其中X可通過在質譜儀中施加解離能而斷裂;vi)Y是連接所述反應基團與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中Y任選地可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂;vii)W是連接所述非編碼可檢測標記與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中W任選地可通過施加光、熱和/或化學試劑而切割和/或可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂;viii)m和n各為0或1,條件是m+n=l;和xi)SS是通過可切割連接物與所述標記試劑的所述報告物部分共價連接的固相支持物。5.權利要求4的化合物,由式ir表示formulaseeoriginaldocumentpage4其中RG是所迷反應基團,SS是所述固相支持物,CL是所述可切割連接物。6.權利要求4的化合物,由式Iir表示:formulaseeoriginaldocumentpage5其中RG是所述^^應基團,SS是所述固相支持物,CL是所述可切割連接物。7.權利要求1至6中任一項的化合物,其中RG為羧酸、磺酸、羧跣卣化物、磺醯基卣化物、活性酯、混合酸酐、異氰酸酯或異硫氰酸酯基團。8.權利要求1至6中任一項的化合物,其中RG為馬來醯亞胺基、烷基滷化物基、a-滷代it^、a-卣代硫酮基或a-滷代亞胺基。9.權利要求1至6中任一項的化合物,其中RG為三苯曱基卣化物或曱^基卣化物基團。10.權利要求1至6中任一項的化合物,其中RG為胺基、羥基或硫醇基。11.一種方法,其包括以下步驟a)使各包含一種或多種反應性分析物的兩個或更多個樣品與一組同位素編碼的同分異構和/或同量異位標記試劑中的不同標記試劑反應,從而形成各包含一種或多種被標記分析物的兩個或更多個差異性標記樣品,其中該組中的不同標記試劑由式I表示,包括其鹽形式和/或水合物形式W一LK-其中i)RG為包含親核體或親電體的反應基團,其中所述反應基團能與樣品中所述一種或多種反應性分析物反應,從而在每個樣品中形成所述一種或多種被標記分析物;ii)RP是報告物部分,其包含固定電荷或者可在質i普儀中離子化,其中所述才艮告物部分能在質脊仗中在鍵X斷裂後產生特徵離子,並且其中每種報告物部分及其相應特徵離子的粗略質量對於該組中的每種標記試劑而言是不同的;iii)DL是非編碼的可檢測標記,其中該組中的每種標記試劑包含不同的可獨立檢測的非編碼可檢測標記,其中每種所述非編碼可檢測標記與該組中標記試劑的其它非編碼可檢測標記具有相同的粗略質量和相同的淨電荷;W)LK是連接物部分,它可以是線性或分支的,其中LK將所述反應基團與所述報告物部分和所述非編碼可檢測標記二者連接在一起,其中該組中每種不同試劑的連接物部分的質量補償該組中所述不同標記試劑的淨艮告物部分之間的粗略質量差異,使得所述才艮告物部分與所述連接物部分的合計粗略質量對於該組中的每種標記試劑而言都濕一相同的;v)X是將所述報告物部分與所述連接物部分或所述非編碼可檢測標記連接在一起的共價鍵,其中X可通過在質譜儀中施加解離能而斷裂;vi)Y是連接所述反應基團與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中Y任選地可通過在質語儀中施加解離能而斷裂,^Hf是如果Y是連接基團則其粗略質量對於該組中每種標記試劑而言都是相同的;vii)W是連接所述非編碼可檢測標記與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中W任選地可通過施加光、熱和/或化學試劑而切割和/或可通過在質譜儀中施加解離能而斷裂;M是如果W是連接基團則其粗略質量對於該組中每種標記試劑而言都是相同的;和viii)m和n各為0或1,條件是m+n=l;以及b)將所述兩種或更多種差異性標記樣品或其部分以及任選地一種或多種校正標準品混合在一起,以產生樣品混合物。12.權利要求ll的方法,其還包括c)電泳分離該樣品混合物或其級分。13.權利要求12的方法,其中所述電泳分離是1D電泳分離、2D電泳分離和/或毛細管電泳分離。14.權利要求12的方法,其還包括d)從電泳分離物中收集共遷移的差異性標記分析物的一種或多種子樣品;和e)當m為0、n為1、W是可通過施加光、熱或化學試劑而切割的共價鍵或連接基團時,任選地在適當條件下處理所述一種或多種子樣品,由此從所述一種或多種子樣品的差異性標記分析物中切下所述非編碼可檢測標記。15.權利要求14的方法,其還包括f)對所述子樣品之一或其級分進行第一質鐠分析;g)對從第一質鐠分析得到的具有選定質荷比的差異性標記分析物的離子施加解離能,由此形成至少一些所述選定離子的特徵離子和子片段離子;和h)對所述選定離子、所述特徵離子和/或所述子片段離子或其級分進行第二質量分析。16.權利要求15的方法,其還包括i)測定第二質量分析中每種特徵離子的粗略質量和相對量以及一些或全部所述子片段離子的粗略質量和/或絕對質量。17.權利要求16的方法,其還包括j)通過分析所述子片段離子來確定與所選質荷比相關的被標記分析物。18.權利要求17的方法,其還包括k)在不同的選定質荷比下對所述差異性標記分析物的所選離子重複步驟(g)到(i)或(g)到(j)一次或多次。19.權利要求18的方法,其還包括1)重複步驟(i)到(i)、(f)到G)或(f)到(k)一次或多次,每次4吏用不同的子樣品。20.權利要求17-19中任一項的方法,其還包括重複步驟(d)到(i)一次或多次。21.權利要求11至20中任一項的方法,其中該組中每種不同標記試劑是與支持物結合的,並通過可切割連接物與所述支持物連接,使得每種不同樣品與帶有該組中不同標記試劑的支持物反應,其中該方法還包括,在進行步驟(a)之後和進行步驟(b)之前i)任選地清洗每種支持物,以除去每種樣品中不與支持物上所結合標記試劑的反應基團反應的組分;ii)切割所述可切割連接物,以從每種支持物上釋放被標記分析物,每種差異性標記樣品包含一種或多種被標記分析物,其中與特定樣品相關的被標記分析物可通過與其相連的具有獨特質量的才艮告物部分來鑑定和/或定量;和iii)任選地收集每個樣品的被標記分析物,之後根據步驟(b)將其混合。22.權利要求21的方法,其中該組中每種與支持物結合的不同的同位素編碼標記試劑由式T表示,包括其鹽形式和/或水合物形式DL——W——LK-Y-RG其中i)RG為包含親核體或親電體的反應基團,其中所述M基團能與樣品中所述一種或多種>^應性分析物反應,從而形成所述一種或多種被標記分析物;ii)RP是報告物部分,其包含固定電荷或者可在質譜儀中離子化,其中所述報告物部分能在質譜儀中在鍵X斷裂後產生特徵離子,並且其中每種報告物部分及其相應特徵離子的粗略質量對於該組中的每種標記試劑而言是不同的;iii)DL是非編碼的可檢測標記,其中該組中的每種標記試劑包含不同的可獨立檢測的非編碼可檢測標記,其中每種非編碼可檢測標記與該組中標記試劑的其它非編碼可檢測標記具有相同的粗略質量和相同的淨電荷;iv)LK是連接物部分,它可以是線性或分支的,其中LK將所述反應基團與所述報告物部分和所述非編碼可檢測標記二者連接在一起,其中該組中每種不同試劑的連接物部分的質量補償該組中所述不同標記試劑的報告物部分之間的粗略質量差異,使得所述報告物部分與所述連接物部分的合計粗略質量對於該組中的每種標記試劑而言都是相同的;v)X是將所述報告物部分與所述連接物部分或所述非編碼可檢測標記連接在一起的共價鍵,其中X可通過在質脊K中施加解離能而斷裂;vi)Y是連接所述反應基團與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中Y任選地可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂,^是如果Y是連接基團則其粗略質量對於該組中每種標記試劑而言都是相同的;vii)W是連接非編碼可檢測標記與連接物部分的共價鍵或連接基團,其中W任選地可通過施加光、熱和/或化學試劑而切割和/或可通過在質#^中施加解離能而斷裂;M是如果W是連接基團則其粗略質量對於該組中每種標記試劑而言都是相同的;和viii)m和n各為0或1,#^ff是m+n=l;以及ix)SS是通過可切割連接物與所述標記試劑的所述才艮告物部分共價連接的固相支持物。23.權利要求22的方法,其中所述標記試劑之一由式ir表示formulaseeoriginaldocumentpage10其中RG是所述反應基團,SS是所述固相支持物,CL是所述可切割連接物。24.權利要求22的方法,其中所述標記試劑之一由式Iir表示H3CO其中RG是所述M基團,SS是所述固相支持物,CL是所述可切割連接物。25.權利要求11至24中任一項的方法,其還包括用至少一種酶消化每種樣品和/或樣品混合物,以部分或完全降解該樣品和/或樣品混合物中的組分。26.權利要求17至20中任一項的方法,其中測定第二質量分析中具有獨特質量的每種特徵離子相對於其它特徵離子的相對量。27.權利要求26的方法,其中將與所測定分析物相關的具有獨特質量的每種特徵離子的相對量與混合形成該樣品混合物的每種差異性標記樣品的量相關聯,從而確定所測定分析物在所述兩種或更多種差異性標記樣品每種中的相對量。28.權利要求27的方法,其中i)所述樣品混合物包含已知量的用於所測定分析物的校正標準品,其中所述校正標準品包含用於所測定分析物的具有獨特質量的才艮告物部分,並參考與該校正標準品相關的獨特特徵離子的量來測定與每種獨特報告物部分對應的每種獨特特徵離子的絕對量;ii)參考具有獨特質量的每種不同特徵離子的絕對量來測定所述樣品混合物的每種不同樣品中所測定分析物的絕對量。29.權利要求27的方法,其中i)參考校正曲線來測定與每種獨特報告物部分對應的每種獨特特徵離子的絕對量;ii)參考具有獨特質量的每種不同特徵離子的絕對量來測定所述樣品混合物的每種不同樣品中所測定分析物的絕對量。30.權利要求27的方法,其還包括以不同的選定質荷比對被標記分析物的選定離子重複步驟(g)至(j)一次或多次,從而鑑定和/或測定混合形成所述樣品混合物的所述兩種或更多種差異性標記樣品每種中一種或多種其它所測定分衝斤物的相對量。31.權利要求28或29的方法,其還包括以不同的選定質荷比對被標記分析物的選定離子重複步驟(g)至(j)一次或多次,從而鑑定和/或測定混合形成所述樣品混合物的所述兩種或更多種差異性標記樣品每種中一種或多種其它所測定分析物的絕對量。32.權利要求30的方法,其中所述分析物是肽,並且基於混合形成所述樣品混合物的所述兩種或更多種差異性標記樣品每種中一種或多種肽的身份和相對量來確定混合形成所述樣品混合物的所述兩種或更多種差異性標記樣品每種中一種或多種蛋白質的身份和相對量。33.權利要求31的方法,其中所述分析物是肽,並且基於混合形成所述樣品混合物的所述兩種或更多種差異性標記樣品每種中一種或多種肽的身份和絕對量來確定混合形成所述樣品混合物的所述兩種或更多種差異性標記樣品每種中一種或多種蛋白質的身份和絕對量。34.權利要求11至31中任一項的方法,其中所述分析物是肽、蛋白質、核酸、碳水化合物、脂質、類固醇、維生素、前列腺素或分子量小於1500道爾頓(Da)的其它小分子。35.權利要求11至34中任一項的方法,其中至少一種差異性標記樣品用式II或式III的同位素編碼標記試劑進行標記formulaseeoriginaldocumentpage12其中RG是所述反應基團。36.包含至少兩種差異性標記分析物的混合物,其中所述混合物通過將至少兩種不同樣品的標記反應產物混合在一起而形成,其中每種樣品使用一組同位素編碼的同分異構和/或同量異位標記試劑中的不同標記試劑進行標記,其中該混合物中每種差異性標記分析物由式lA表示,包括其鹽形式和/或7JC合物形式分析物其中i)RP是報告物部分,其包含固定電荷或者可在質鐠儀中離子化,其中所述報告物部分能在質鐠儀中在鍵X斷裂後產生特徵離子,並且其中每種報告物部分及其相應特徵離子的粗略質量對於每種不同樣品而言是不同的,這取決於使用該組中的哪種標記試劑來標記該樣品;ii)DL是非編碼的可檢測標記,其對於該組中的每種不同標記試劑而言是不同的,其中每種不同的非編碼可檢測標記可獨立於該組中其它可檢測標記而進行檢測,並且其中每種不同的非編碼可檢測標記與該組中其它標記試劑的其它非編碼可檢測標記具有相同的粗略質量和相同的淨電荷;iii)LK是連接物部分,它可以是線性或分支的,其中LK將所述分析物與所述報告物部分和所述非編碼可檢測標記二者連接在一起,其中該組中每種不同標記試劑的連接物部分的質量補償該組中所述不同標記試劑的才艮告物部分之間的粗略質量差異,使得所述才艮告物部分與所述連接物部分的合計粗略質量對於該組中的每種標記試劑而言都是相同的;iv)X是將所述^L告物部分與所述連接物部分或所述非編碼可檢測標記連接在一起的共價鍵,其中鍵X可通過在質,中施加解離能而斷裂;v)Y是連接所述分析物與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中Y任選地可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂,^ff是如果Y是連接基團則其粗略質量對於該組中每種標記試劑而言都是相同的;vi)W是連接非編碼可檢測標記與連接物部分的共價鍵或連接基團,其中W任選地可通逸沲加光、熱和/或化學試劑而切割和/或可通過在質#^中施加解離能而斷裂,IHf是如果w是連接基團則其粗略質量對於該組中每種標記試劑而言都是相同的;和vii)m和n各為0或1,條件是m+n=l。37.權利要求36的混合物,其中所述分析物中的一種或多種是肽和/或蛋白質。38.權利要求36的混合物,其中所述分析物中的一種或多種是核酸。39.權利要求36的混合物,其中所述分析物中的一種或多種是碳7jC化合物、胺基酸、脂質、類固醇、維生素和/或前列腺素。40.權利要求36的混合物,其中所述分析物中的一種或多種是質量小於1500道爾頓的小分子。41.權利要求36的混合物,其中所述分析物中的兩種或更多種是不同的分析物類型。42.權利要求36至41中任一項的混合物,其中至少一種被標記分析物由式IlA表示A43.權利要求36至41中任一項的混合物,其中至少一種被標記分析物由式IIlA表示formulaseeoriginaldocumentpage14III44.包含至少兩種差異性標記分析物的混合物,其中所述混合物通過將至少兩種不同樣品的標記反應產物混合在一起而形成,其中每種樣品使用來自一組同位素編碼的同分異構和/或同量異位標記試劑的不同標記試劑進行標記,其中該混合物中每種差異性標記分析物由式r^表示,包括其鹽形式和/或7jc合物形式formulaseeoriginaldocumentpage15分析物其中i)RP是報告物部分,其包含固定電荷或者可在質鐠儀中離子化,其中所述報告物部分能在質鐠儀中在鍵X斷裂後產生特徵離子,並且其中每種報告物部分及其相應特徵離子的粗略質量對於每種不同樣品而言是不同的,這取決於使用該組中的哪種標記試劑來標記該樣品;ii)DL是非編碼的可檢測標記,其對於該組中的每種不同標記試劑而言是不同的,其中每種不同的非編碼可檢測標記可獨立於該組中其它可檢測標記而進行檢測,並且其中每種不同的非編碼可檢測標記與該組中其它標記試劑的其它非編碼可檢測標記具有相同的粗略質量和相同的淨電荷;iii)LK是連接物部分,它可以是線性或分支的,其中LK將所述分析物與所述報告物部分和所述非編碼可檢測標記二者連接在一起,其中該組中每種不同標記試劑的連接物部分的質量補償該組中所述不同標記試劑的寺艮告物部分之間的粗略質量差異,使得所述才艮告物部分與所述連接物部分的合計粗略質量對於該組中的每種標記試劑而言都^!相同的;iv)X是將所述^L告物部分與所述連接物部分或所述非編碼可檢測標記連接在一起的共價鍵,其中鍵X可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂;v)Y是連接所述分析物與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中Y任選地可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂,4Ht是如果Y是連接基團則其粗略質量對於該組中每種標記試劑而言都是相同的;vi)W是連接所述非編碼可檢測標記與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中W任選地可通過施加光、熱和/或化學試劑而切割和/或可通過在質i普儀中施加解離能而斷裂,M是如果W是連接基團則其粗略質量對於該組中每種標記試劑而言都是相同的;vii)m和n各為0或1,條件是m+n=l;和viii)Q,是通it^固相支持物上切割所述差異性標記分析物而形成的官能團。45.權利要求44的混合物,其中至少一種被標記分析物由式ir^表示formulaseeoriginaldocumentpage16其中Q,是通過從固相支持物上切割所述差異性標記分析物而形成的官能團。46.權利要求44的混合物,其中至少一種被標記分析物由式IirAx表示formulaseeoriginaldocumentpage16其中Q,是通過從固相支持物上切割所述差異性標記分析物而形成的官能47.包含至少一種權利要求1至10中任一項所述化合物的試劑盒。48.權利要求47的試劑盒,其還包含至少一種其它試劑,所述其它試劑被選擇用於實施對兩種或更多種不同樣品中的一種或多種分析物的定量測定。49.權利要求48的試劑盒,其中所述至少一種其它試劑是經標記的校正標準品。50.由式IA表示的化合物,包括其鹽形式和/或水合物形式formulaseeoriginaldocumentpage17i)RP是報告物部分,其包含固定電荷或者可在質鐠儀中離子化,其中所述報告物部分能在質譜儀中在鍵X斷裂後產生特徵離子;ii)DL是非編碼的可檢測標記;iii)LK是連接物部分,它可以是線性或分支的,其中LK將所述分析物與所述報告物部分和所述非編碼可檢測標記二者連接在一iv)X是將所述報告物部分與所述連接物部分或所述非編碼可檢測標記連接在一起的共價鍵,其中X可通過在質鐠儀中施加解離能v)Y是連接所述分析物與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中Y任選地可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂;vii)W是連接所述非編碼可檢測標記與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中W任選地可通過施加光、熱和/或化學試劑而切割和/或可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂;和分析物其中:而斷裂;viii)m和n各為0或1,^ff是m+n=l;其中所述化合物任選地與支持物相結合。51.由式rA表示的化合物,包括其鹽形式和/或水合物形式:DL~~W——LK-Y-^析物i)RP是報告物部分,其包含固定電荷或者可在質鐠儀中離子化,其中所述報告物部分能在質鐠儀中在鍵X斷裂後產生特徵離子;ii)DL是非編碼的可檢測標記;iii)LK是連接物部分,它可以是線性或分支的,其中LK將所述分析物與所述報告物部分和所述非編碼可檢測標記二者連接在一iv)X是將所述報告物部分與所述連接物部分或所述非編碼可檢測標記連接在一起的共價鍵,其中X可通過在質鐠儀中施加解離能v)Y是連接所述分析物與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中Y任選地可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂;vii)W是連接所述非編碼可檢測標記與所述連接物部分的共價鍵或連接基團,其中W任選地可通過施加光、熱和/或化學試劑而切割和/或可通過在質鐠儀中施加解離能而斷裂;和viii)m和n各為0或1,條件是m+n=l;ix)SS是通過可切割連接物與所述標記試劑的所述報告物部分共價連接的固相支持物。52.權利要求1至10、50或51中任一項的化合物,其中所述化合其中:而斷裂;物是被同位素編碼的。全文摘要本發明涉及與使用包含報告物部分和非編碼可檢測標記的化合物通過質譜法進行分析物測定和/或定量有關的方法、混合物、試劑盒和組合物。所述化合物可成組用於分析被標記分析物的混合物。文檔編號C07D493/10GK101511844SQ200780032436公開日2009年8月19日申請日期2007年6月29日優先權日2006年6月30日發明者蘇巴卡爾·戴伊,蘇巴西什·普爾卡亞斯塔申請人:阿普裡拉股份有限公司