具優良基因組合的高效Bt15A3菌株、分離及應用的製作方法

2023-05-12 09:27:11 2

專利名稱：具優良基因組合的高效Bt15A3菌株、分離及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及對鱗翅目重大害蟲甜菜夜蛾及棉鈴蟲等均具高毒力的蘇雲金芽孢桿菌(Bt)科默爾亞種15A3菌株，由這一菌株攜帶的編碼殺蟲晶體蛋白(ICP)的基因及其優良組合，以及由此菌株所開發的高效細菌殺蟲劑。
Bt製劑是世界範圍內廣泛使用的細菌殺蟲劑，佔全部生物殺蟲劑產量的95％，在微生物防治害蟲的實踐中具有十分重要的地位(喻子牛等蘇雲金芽孢桿菌北京科學出版社1990)。Bt的殺蟲活性來源於其自身攜帶的cry基因編碼的ICP，每種ICP都有特定的殺蟲譜，ICP基因中cry1Aa,cry1Ab,cry1Ac是殺蟲毒力最高，且目前市場銷售的Bt製劑生產菌主要攜帶的基因種類，其中cry1Ac是被認為對棉鈴蟲毒力最高的基因，對棉鈴蟲有特異性高毒力的YBT-1520菌株(孫明等CN1055310C)和Bt.ken-Ag菌株(劉春勇等，南開大學學報200032(3):163-168)均含有上述cry1Ac類基因，但上述三種基因產物對甜菜夜蛾、海灰翅夜蛾等幾種害蟲無毒或低毒，而Cry1C,Cry1D蛋白對這類害蟲具高毒力(Frankenhuyzen K.V.The challenge ofBacillus thuringiensis.In: Entwistle P.F.et al.ed.Bacillus tburingiensis,an environmental biopesticide:theory and practice.Chichester:John willey sons Ltd. 1993.p9-l0)。由含有cry1C基因菌株，如B.t.subs.aziwai生產的殺蟲劑多用於這類害蟲的防治。含有cryⅠC和cryⅠA的Bt菌，其殺蟲活性比不含cryIC的HD-1菌株，對spodoptera fruqiperda的活性高三倍，對小菜蛾的活性高兩到數倍(CN 1240002A)，由此認為具有對棉鈴蟲類和甜菜夜蛾類害蟲廣譜殺蟲活性的Bt菌株應在其細胞內帶有上述cryⅠAc和cryⅠC兩類基因的組合。
為了使Bt菌株具有所期望的基因組合，從而達到廣譜殺蟲活性，近年來研究人員投入大量的人力財力對現有的Bt菌株進行遺傳改良，利用誘變、基因重組、接合轉移等手段試圖構建同時含有cry1A類和cry1C重要基因組合的Bt工程菌株。美國的Sandoz公司1994年發明了一種用於Bt之間帶有cry基因的質粒能有效接合轉移的方法(Eur.pat.0582541Az)，首次將Bt entomocidus 6.1菌株帶有cry1C基因的質粒通過接合轉移方法導入只含有cry1A類的Bt kurstaki HD562菌株，獲得工程菌cg92004.24，這一菌株同時含有cry1Aa,cry1Ab,cry1Ac,cry1C和cryⅡA。經生物活性檢測，對甜菜夜蛾的毒力比原親本菌株擴大了1.7倍。由於所期望的供體及所要求的質粒不能有效的接合轉移，轉移進受體的新質粒與原有質粒的不親合性，以及篩選重組接合子的選擇標記等客觀因素的存在，使獲得工程菌必需經5次以上的接合雜交及多次電穿孔轉化和大量的篩選等複雜的過程，最終獲得的目的工程菌株還帶有紅黴素及四環素的抗性標記，而且除cry1C基因外，cry1Ac基因也來自其它菌株，即兩個高效基因均不是Bt kurstaki菌株原有基因，外源質粒的穩定性及選擇壓力等因素會使生產工藝複雜化。此外，凡是利用基因工程菌生產的製劑，在環境釋放之前必須通過國家農業部有關農業生物基因工程安全評價的審批，方可進行田間試驗。
正是由於工程菌用於生產的不便，人們一直沒有放棄篩選具有新的cry基因、或者具有期望的優良基因組合的Bt菌株。尾山和彥等人(CN 1240002A)分離到一株Bt新菌株，屬血清型H7，其攜帶的編碼ICP基因與cry9Ca1比較接近，其胺基酸序列有71％的同源性，證明此菌株攜帶有新的ICP基因，表現出廣譜的殺蟲活性，不但對某些鱗翅目害蟲如斜紋夜蛾有高的殺蟲活性，同時對三種鞘翅目及兩種雙翅目昆蟲均有活性。
研究表明由多種cry蛋白構成的晶體往往比單一蛋白構成的晶體有更高的殺蟲毒力(Lee M.il et.al.,App.Environ.Microbio.1996.62:583-585),而且CryV的作用有助於延緩抑制昆蟲產生抗性(Poncet S.et.al.,J.Invertebt.Pathol.1995,66:131-135)。多年用於防治小菜蛾的Bt kurstaki HD-1(簡稱HD-1)製劑,在防治對化學農藥產生抗性的小菜蛾方面貢獻突出，然而近幾年來已發現小菜蛾對HD-1產生了明顯的抗性。因此篩選比HD-1菌株的基因具有更加優勢組合的Bt生產菌株，不僅可以擴大殺蟲譜，而且可有效的扼制並延緩昆蟲對Bt的抗性。
本發明目的是提供具優良基因組合的高效蘇雲金芽孢桿菌科默爾亞種15A3菌株和它的分離方法及其應用。本發明是從我國豐富的Bt資源中篩選同時具有對棉鈴蟲高效的cry1Ac基因及對甜菜夜蛾高效的cry1C基因，還含有cryⅡ及cryV延緩抗性基因等優勢基因組合的菌株，不僅擴大了殺蟲譜延緩抗性，而且可以節省人工構建工程菌的巨額耗資，還可以克服利用工程菌生產的種種不足。
本發明是經過土壤分離、形態觀察、PCR基因檢測及生物活性實驗，篩選到本發明的菌株，編號為15A3。菌種保藏號CGMCC NO.0528。它不僅含有我們所期望的基因cry1Ac，cry1C和cryV，還含有cry1Aa，cry1D和cryⅡ六種ICP基因。其中cry1Aa的限制性片斷長度多態性分析(RFLP)與標準的cry1Aa不同，多出一個pstⅠ切點。經鑑定此菌株屬蘇雲金芽孢桿菌血清型為H21的科默爾亞種。室內活性測定發現15A3菌株對棉鈴蟲的毒力與本組「八五」期間開發的棉鈴蟲高效菌株Bt ken-Ag相當，而後者對甜菜夜蛾幾乎無毒力。經搖瓶發酵及6立開自控罐的小試後，發現15A3菌株具優良的生產性能，隨即進行中試生產試驗，獲得廣譜殺蟲劑產品-NK Bt-Ⅱ，此產品分別在河北省、天津市等地做了小區藥效試驗，在對供試蟲種的廣譜性方面明顯優於國內同類產品。
本發明突出的實質性特點和顯著進步可以從下述實施例中得以體現。但它們不會對本發明作任何限制。


圖1是15A3菌株及H21標準株cry基因PCR結果。
如圖所示，泳道1是分子量指示物(λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ)，泳道2、4、6、8是15A3菌株cryⅠAc,Ⅰc,Ⅱ,V基因，泳道3、5、7、9是H21標準株cryⅠAc,Ⅰc,Ⅱ,V基因。
實施例1 Bt15A3菌株的分離篩選(1)稱取約1克土壤樣品至10ml無菌水中，充分混勻後取1ml至混有多粘菌素及青黴素的NB培養基中，30℃培養72小時。挑選類似蘇雲金芽孢桿菌的菌落，塗片染色後鏡檢，將芽孢晶體形成同步率高並同時含有菱形、方形等多型晶體的菌落進一步純化。
(2)依據各類cry基因的保守區設計特異引物，對純化好的Bt菌株進行各類cry基因的檢測，將具有期望的基因組合的菌株選出。
(3)將所篩選到的菌株及參比菌株分別接種M1發酵培養基，其配方為魚粉3.0-3.5％，玉米澱粉1.2-1.5％，牛肉膏0.2-0.5％，無機鹽0.1-0.2％,pH7.5-8.0。30℃，180-220rpm/分培養26-30小時。
(4)將培養液進行500、1000倍稀釋，混入人工飼料，飼餵初孵棉鈴蟲及甜菜夜蛾，篩選出對兩種試蟲毒力均高的菌株。
(5)用冷凍乾燥法製備所篩選菌株及參比菌株的芽孢晶體複合物凍乾粉，用一定濃度的凍乾粉製備人工飼料，飼餵初孵棉鈴蟲及甜菜夜蛾，參比菌株有兩個一是主要含有cry1Ac基因，對棉鈴蟲特異高效菌株Bt ken-Ag；另一個是主要含有crv1C基因，對甜菜夜蛾高效菌株9510，結果見表1。
表1 15A3株對棉鈴蟲和甜菜夜蛾的LC50(ppm)
表1的實驗結果說明15A3株對棉鈴蟲及甜菜夜蛾均有較高的活性。對棉鈴蟲的毒力與Bt ken-Ag相當，而後者對甜菜夜蛾幾乎沒有毒力，15A3株與9510株相比，對棉鈴蟲的毒力高2.1倍，對甜菜夜蛾的毒力高1.7倍。
最終篩選到本發明的菌株Bt15A3。
實施例2．Bt15A3株的生物學特性及cry基因的檢測用普通NB斜面培養48小時，95％以上的細胞形成芽孢晶體，晶體形態及大小多種多樣，有大小菱形、方形、卵園形及鑲嵌形，較大形的晶體大於芽孢。用經典的血清學實驗方法，測定15A3株的鞭毛抗原屬H21型，是蘇雲金芽孢桿菌科默爾亞種(Bacillus thuringiensis subsp.colmeri)。抗生素譜測定結果ampr、polymyr、strs、erys、rets、chls。
用特異性引物的PCR方法分別檢測15A3株及H21標準菌株的cry基因證明，15A3株含有cry1Ac,cry1C,cryⅡ和cryVgane，特異性產物擴增片斷的大小依次為1.84kb,288bp,600bp和700bp，而H21標準菌株不含cry1Ac的1.84kb的特異性擴增產物，其它基因均相同(見
圖1)，經檢測15A3株不含cry1E,cryⅢ.cry1V和cyt基因。
用kuo W.S.等人的限制性片斷長度多態性(RFLP)方法(Appl.andEnviro.Microbi.1996 62(4):1369-1377)對cry1類基因分類檢測發現，15A3菌株含有4個cry1類基因除PCR已檢測的cry1Ac和cry1C外，還會有cry1Aa,cry1D兩個基因，其中cry1Aa基因的PFLP結果證明，與已發現的cry1Aa基因序列不同，僅含有726bp和237bp兩個酶切片斷而缺少496bp的片斷，在這段序列中多出一個pstⅠ切點，有可能是一個新的cry1Aa基因序列，而其它三個cry1類基因均符合標準的確切圖譜。
實施例3．15A3株的液體發酵及產品(1)斜面菌種NB培養基斜面牛肉膏0.5％，蛋白腖1.0％，NaCl 0.5％，瓊脂粉1.8％，pH7.2-7.4。培養基製備好後分裝試管或克氏瓶，121℃高壓蒸氣滅菌30分鐘，取出後擺成斜面，置30℃溫箱培養24-48小時，無雜菌生長便可以接種取保藏菌種一環接種新鮮斜面，30℃培養10-12小時，塗片染色後顯微鏡觀察，菌體為粗杆狀，兩端鈍圓，原生質均勻無雜菌。
(2)克氏瓶擴大培養將上述活化的菌種取一環接入液體NB培養基中，30℃ 180rpm/min振蕩培養5-6小時，取2ml至克氏瓶內，使其均勻分布於培養基表面，置30℃培養72小時，檢查菌苔厚而豐滿，菌落表面灰白色無光澤無雜菌，鏡檢芽孢晶本形成率為98％以上。
(3)發酵罐種子液製備將100ml無菌水倒入克氏瓶洗下菌苔，移入裝有少量玻璃珠的無菌燒瓶內，充分振蕩將菌苔打散，移入專用接種瓶，置75℃水浴20分鐘。
(4)發酵罐培養發酵培養基配方豆並粉4.0％，玉米澱粉1.5％，棉籽粉1.5％，酵母粉1.0％，無機鹽類0.5％，泡敵0.03-0.05％，全部原料需達到180μm篩的細度，pH8.5-9.0。按發酵容積的60-75％投料，滅菌後冷卻至40℃左右，按投料體積的0.02％接入種子液，攪伴轉數為250轉，溫度30℃±1℃，罐壓0.5kg，通氣量1∶1.0-1∶1.3，發酵周期35-45小時，視30％左右的孢晶游離，發酵液pH達8.0以上終止發酵。液劑及高含量粉劑產品後加工按Bt ken-Ag中試方法進行(梁風來等南開大學學報1998 31(2):28-32)。產品質量檢測按中華人民共和國農業行業標準蘇雲金芽孢桿菌製劑(1995.10.1.實施)。
實施例4由本發明菌株15A3生產的殺蟲劑NK Bt-Ⅱ(其液劑及高含量粉劑產品是按Btken-Ag中試方法進行得到的，梁風來等南開大學學報1998 31(2):28-32)，經河北省農林科學學院和天津市農科院對棉鈴蟲，甜菜夜蛾和小菜蛾的田間藥效試驗證明，對三種試蟲都可達到很好的防治效果，廣譜性方面明顯優於國內同類產品。
(1)粉劑500倍稀釋，對1-2齡甜菜蛾的防效達82％，是對照組(湖北農科院Bt中心生產的16,000IU/mg可溼性粉劑)同樣稀釋倍數的1.78-2倍。見表2表2 NK Bt-Ⅱ粉劑防治1-2齡甜菜夜蛾田間藥效實驗結果
(2)粉劑500倍釋釋，防治三代棉鈴蟲效果達90％以上，與對照組(樣品同表2)相當，見表3表3 NKBt-Ⅱ防治三代棉鈴蟲田間藥效實驗結果
(3)粉劑500倍稀釋，防治2齡甘藍小菜蛾平均效果達82％，與對照組BtA粉劑(福建綠十字生物工程聯合發展中心生產，添加有阿維菌素的Bt新產品)防效相當，見表4表4NK Bt-Ⅱ防治2齡甘藍小菜蛾田間藥效實驗結果
(4)液劑100倍稀釋，對田間破網後4-5齡美國白蛾防治效果達95％以上。
權利要求
1．一種生產細菌殺蟲劑的高效廣譜菌株，其特徵在於所述的菌株是蘇雲金芽孢桿菌(Bt)科默爾亞種15A3菌株，保藏號為CGMCC NO.0528，包括A．該菌株鞭毛抗原屬H21型，為蘇雲金芽孢桿菌科默爾亞種(Bacillusthuringiensis subsp.colmer)，具有菱、方、鑲嵌、不規則多型晶體及正常的芽孢形態，但與標準的colmer亞種的基因組成有差異；B．該菌株編碼殺蟲晶體蛋白(ICP)的基因有cryⅠAa,cryⅠAc,cryⅠC,cryⅠD,cryⅡ和cryV.；C．該菌株cryⅠAa基因與已發現的cryⅠAa基因的序列不同，僅含有726bp和237bp的酶切片斷而缺少496bp的片斷，在N-末端1.5kb內多出一個pstⅠ切點；D．該菌株含有兩種分子量的ICPs，一種為130KD，另一種為65KD。
2．權利要求1所述的Bt科默爾亞種15A3菌株的分離篩選方法，其特徵在於它包括下述步驟A．稱取1克土壤樣品置於10ml無菌水中，充分混勻後取1ml加入混有多粘菌素及青黴素的NB培養基中，30℃培養72小時，挑選類似蘇雲金芽孢桿菌的菌落，塗片染色後鏡檢，將芽孢晶體形成同步率高並同時含有菱形、方形、多型晶體的菌落進一步純化；B．依據各類cry基因的保守區設計特異引物，對純化好的Bt菌株進行各類cry基因的檢測，將具有期望的基因組合的菌株選出；C．將所篩選到的菌株及參比菌株分別接種No.1發酵培養基，其配方為魚粉3.0-3.5％，玉米澱粉1.2-1.5％，牛肉膏0.2-0.5％，無機鹽0.1-0.2％，pH7.5-8.0，30℃，180-220rpm/分培養26-30小時；D．將培養液稀釋至500、1000倍，混入人工飼料，飼餵初孵棉鈴蟲及甜菜夜蛾，篩選出對兩種試蟲毒力均高的菌株。
3．權利要求1所述的Bt科默爾亞種15A3菌株所產生的ICP及其芽孢。
4．權利要求3所述的具殺蟲活性的ICP及其芽孢的生產方法，其特徵在於它包括下述步驟A．生產用菌種用NB培養基斜面，其配方為牛肉膏0.5％，蛋白腖1.0％，NaCl 0.5％，瓊脂粉1.8％，pH 7.2-7.4，培養基製備好後分裝試管或克氏瓶，121℃C高壓蒸氣滅菌30分鐘，取出後擺成斜面，置於30℃溫箱中培養24-48小時；無雜菌生長便可以接種取保藏菌種一環接種新鮮斜面，30℃培養10-12小時，塗片染色後顯微鏡觀察，菌體為粗杆狀，兩端鈍圓，原生質均勻無雜菌B．克氏瓶擴大培養，將上述活化的菌種取一環接入液體NB培養基中，30℃180rpm/min振蕩培養5-6小時，取2ml至克氏瓶內，使其均勻分布於培養基表面，置30℃培養72小時，檢查菌苔厚而豐滿，菌落表面灰白色、無光澤、無雜菌，鏡檢芽孢晶體形成率為98％以上；C．發酵罐種子液製備，將100ml無菌水倒入克氏瓶洗下菌苔，移入裝有少量玻璃珠的無菌燒瓶內，充分振蕩將菌苔打散，移入專用接種瓶，置75℃水浴20分鐘；D．發酵罐培養發酵培養基配方豆餅粉4.0％，玉米澱粉1.5％，棉籽粉1.5％，酵母粉1.0％，無機鹽類0.5％，泡敵0.03-0.05％，全部原料需達到180μm篩的細度，pH8.5-9.0。按發酵容積的70-75％投料，滅菌後冷卻至40℃左右，按投料體積的0.02％接入種子液，攪伴轉數為250轉，溫度30℃±1℃，罐壓0.5kg，通氣量1∶1.0-1∶1.3，發酵周期35-48小時，視30％左右的孢晶游離，發酵液pH達8.0以上終止發酵。
5．權利要求3所述的ICP及其芽孢用作防治鱗翅目夜蛾科害蟲的細菌殺蟲劑主成分。
6．權利要求5所述的害蟲包括甜菜夜蛾、棉鈴蟲、小菜蛾及美國白蛾。
全文摘要
本發明是具有優良基因組合的蘇雲金芽孢桿菌科默爾亞種15A3株及分離篩選方法;其獨特的cry基因的組合,這些基因分別是:cry1Aa,cry1Ac,cry1C,cry1D,cryII和cryV,利用多種cry基因特異引物的PCR方法及生物活性測定方法篩選到的Bt15A3菌株;可溼性粉劑和液劑對重大害蟲甜菜夜蛾、棉鈴蟲、小菜蛾和美國白蛾均收到很好的田間防治效果。
文檔編號A01N63/00GK1302866SQ0110442
公開日2001年7月11日 申請日期2001年2月26日 優先權日2001年2月26日
發明者陳月華, 任改新, 王津紅, 劉春勇, 馮書亮, 吳衛輝, 王飛, 李紅秀 申請人:南開大學