尿激酶原突變體的製作方法
2023-05-12 01:54:06
專利名稱：尿激酶原突變體的製作方法
技術領域：
本發明涉及在血栓溶解治療中使用的新型尿激酶原，特別是具血栓溶解活性的尿激酶原突變體。
尿激酶原是一種單鏈絲氨酸蛋白酶原，經纖維蛋白溶解酶(Plasmin)的激活而形成雙鏈尿激酶(UK)。尿激酶原和尿激酶均能使纖維蛋白溶解酶原(Plasminogen)激活為纖維蛋白溶解酶，纖維蛋白溶解酶則可將血栓中的纖維蛋白及其它血漿蛋白降解，因此尿激酶原和尿激酶可用於血栓栓塞的治療。
與其它絲氨酸蛋白酶原相比，尿激酶原的一個顯著特點是其具有很高的內在活性(Intrinsic Activity)，表現為對小分子底物的水解能力以及對纖維蛋白溶解酶原的激活作用。儘管上述活性較尿激酶低250倍左右，但其內在活性仍比其它絲氨酸蛋白酶原(如胰蛋白酶原或糜蛋白酶原)高104.0～4.3倍。尿激酶原對纖維蛋白溶解酶原的激活作用存在較長的延遲，當反應系統中存在纖維蛋白降解的E片段時，則可使上述激活作用顯著增強，纖維蛋白及其降解片段D對上述反應沒有顯著影響。
尿激酶原相對較高的內在活性，使其在臨床使用時會產生一些不良的副作用。和尿激酶一樣，尿激酶原也能引起非特異性的纖維蛋白溶解酶原活化，從而導致纖維蛋白原的降解以及血小板和血管壁的部分溶解，產生系統性的纖溶狀態，引發出血或中風等併發症。在低劑量使用時，尿激酶原比尿激酶更具有選擇性，這是因為尿激酶對游離的或與纖維蛋白結合的纖維蛋白溶解酶原的激活作用均很強。而尿激酶原的內在活性僅為尿激酶的0.2％～0.5％，在低濃度時它對結合了纖維蛋白的纖維蛋白溶解酶原優先激活而對游離的纖維蛋白溶解酶原的激活作用則很弱。但是，為了確保血栓溶解的療效而使用高劑量時，尿激酶原就喪失了其低劑量時的特異性。
本發明的目的就是為了解決上述問題，提出一種具有優良血栓溶解作用的尿激酶原突變體。
我們對尿激酶原溶解血栓的作用機理研究結果表明，尿激酶原或尿激酶對血栓表面的纖維蛋白溶解酶原的活化以及纖維蛋白溶解酶對血栓附近尿激酶原的激活，是血栓溶解過程的兩個關鍵步驟。因此，與野生型尿激酶原相比，一個具有良好療效的尿激酶原變體應具備①較低的內在活性，以保證臨床使用的安全性；②對與血栓結合的纖維蛋白溶解酶原具有較高的激活作用，而對游離的纖維蛋白溶解酶原的活化能力很弱，這可通過改變尿激酶原的底物專一性而實現；③該變體被纖維蛋白溶解酶激活的速度應與野生型尿激酶原相當，且其對應的雙鏈尿激酶激活纖維蛋白溶解酶原的能力應與野生型尿激酶相似本發明是基於下列發現天然尿激酶原分子中Lys300與Asp355之間的靜電相互作用(鹽鍵)是維持其高內在活性的必要條件，因此，任何削弱上述靜電相互作用的胺基酸突變均可能使尿激酶原變體的內在活性下降。當Pro309被突變為其它胺基酸後，可以改變Lys300的空間位置，從而影響Lys300和Asp355之間的靜電作用，並使突變體的內在活性降低。此外，該位點的突變不僅可以影響突變體雙鏈尿激酶的活性，而且可以改變(單鏈)突變體的底物專一性，使其對游離纖維蛋白溶解酶原的激活作用下降，而對與纖維蛋白或其降解片段結合的纖維蛋白溶解酶原的激活能力上升。
與天然尿激酶原相比，該位點的一些尿激酶原突變體是優良的血栓溶解藥劑，因為它們對纖維蛋白溶解酶原的激活作用受纖維蛋白促進的程度超過天然尿激酶原，因而，這些尿激酶原突變體對與纖維蛋白結合的纖維蛋白溶解酶原的激活作用表現出比天然尿激酶原更強的特異性，此外由於其低內在活性，因此在給患者施用這些尿激酶原變體時，可比天然尿激酶原使用更高、更有效驗的劑量。
因此本發明的特徵在於一種有溶解血栓活性的尿激酶原突變體，它具有天然尿激酶原的胺基酸序列，但對其第309位的脯氨酸進行突變，該突變可使其內在活性比天然尿激酶原低2.5倍以上，並使其對纖維蛋白溶解酶原的激活作用可被纖維蛋白及其降解片段所促進。
當給患者施用時，該突變使其可以誘導出比天然尿激酶原更低的纖維蛋白原溶解作用和非特異性纖維蛋白溶解酶原激活作用，並使其表現出較高的纖維蛋白特異性。
本文中使用的術語「天然」是指一種天然存在或野生型形式的蛋白質，或者指天然存在的蛋白質中的一種天然存在或野生型形式的胺基酸。一種「新」胺基酸是指天然蛋白質內通常不定位於給定位點上的胺基酸，具體地說，在尿激酶原第309位除脯氨酸之外的其它胺基酸。
本發明的特徵還在於一種DNA分子，例如，一種重組DNA分子，該分子編碼本文中描述的任何突變型尿激酶原。本發明還包括一種用上述的DNA分子轉化的細胞，例如一種哺乳動物、細菌或酵母細胞。本發明的特徵還在於一種製備本文中描述的突變型尿激酶原的方法，該方法包括用編碼一種突變型尿激酶原的DNA分子轉化一種細胞，培養該細胞，以及表達該突變體，並分離該突變體(蛋白)。
實施例尿激酶原突變體的製備適用於製備本文中描述的尿激酶原突變體的一種方法是寡聚核苷酸定點突變，這種方法可使天然尿激酶原的核苷酸序列在特定位點發生改變，並可導致其編碼的胺基酸序列在相應位點改變為其它胺基酸。編碼天然尿激酶原的基因序列已被完全鑑定，並可從例如Dr.David Dichek(NIH)和Dr.Paolo Sarmientos(Primm，Milano，Italy)處得到。在ATCC的保藏號為DNA 57329或細菌/噬菌體57328。用UKHU名稱可在NIH計算機資料庫Protein Identity Resource中檢索其核酸和胺基酸序列。天然尿激酶原的胺基酸序列見
圖1。
目前用於進行核苷酸定點突變的技術已非常成熟，本文以Stratagene的突變試劑盒(試劑目錄號#200518)為例，說明尿激酶原基因在對應於Pro309密碼子處的定點突變，見圖2。
用包含尿激酶原(cDNA)基因並具有甲基化修飾的質粒為模板，以含有突變序列的寡核苷酸為引物，在經變性和退火處理後，使寡核苷酸引物與質粒模板配對，並以具有高複製保真度的pfu DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸以合成含有尿激酶原突變基因並與質粒模板互補配對的DNA。該反應可在PCR儀器上完成，在經過大約15次左右的變性—退火—延伸反應後，所得產物已足夠用於轉導感受態細菌。
取上述合成產物2μl，加入DpnI酶，該酶可以選擇性地降解含甲基化的DNA鏈，而使用作模板的含野生型尿激酶原基因的質粒DNA被降解，並失去轉導感受態細菌的能力，而用Pfu DNA聚合酶在體外合成的含有尿激酶原定點突變的DNA則因不存在甲基化而不能被降解，並可互補配對為含有缺口(nick)的雙鏈DNA。該雙鏈DNA可有效地轉導至大腸桿菌感受態細胞中。挑選陽性克隆並對其質粒DNA中的尿激酶原基因序列進行鑑定，從而獲得含有定點突變的尿激酶原基因。
我們將Pro309隨機突變為其它19種胺基酸，以比較各突變體的內在活性及其對纖維蛋白溶解酶原激活的特導性。我們設計以下寡核苷酸引物用於尿激酶原Pro309密碼子的隨機突變引物1.ACAG TCA TTT TCA GCT GCT CNN NAT AGA GAT AGTCGG TAG AAT TC引物2.GAA TTC TAC CGA CTA TCT CTA TNN NGA GCA GCTGAA AAT GAC TGT其中N代表A，T，C，G尿激酶原突變體DNA的表達根據用於蛋白表達的宿主細胞類型，將含有突變的尿激酶原基因克隆到合適的表達載體中，然後將含有尿激酶原基因的表達載體轉導(例如化學轉導或電穿孔轉導等)至宿主細胞(例如細菌、酵母或哺乳動物細胞)中，以便表達尿激酶原突變體。若採用分泌型表達載體，尿激酶原突變體蛋白可以從培養基中回收，若不採用分泌型表達載體，尿激酶原蛋白則可從宿主細胞中回收。如果宿主細胞為真核細胞，則可直接對其進行分離純化。如果宿主細胞為原核細胞，則必須先對其表達產物(以包涵體形式存在)進行活化處理。尿激酶原突變體蛋白在經分離純化後(純化方法包括離子交換、親和層析及凝膠過濾等)可對其生化特性進行鑑定。
尿激酶原的突變分析以大腸桿菌生產的重組尿激酶原為參照，研究比較尿激酶原突變體的生化性質。檢測指標主要包括尿激酶原突變體的內在活性、天然尿激酶或突變體尿激酶對(Glu-型)血纖維蛋白溶解酶原的激活作用，纖維蛋白溶解酶對尿激酶原突變體的激活作用，纖維蛋白及其降解產物E片段和D片段對尿激酶原或其突變體激活(Glu-型)纖維蛋白溶解酶原的促進作用，以及在血漿環境中對血纖維蛋白凝塊的溶解速度和血漿中纖維蛋白原的殘留量。
內在活性檢測根據突變體尿激酶原及其(對應的)尿激酶對化學合成的生色底物S2444的水解作用，來比較各尿激酶原突變體的內在活性。在25℃以及活性測定緩衝液(0.05 M Tris-HCl，0.1 M NaCl，0.1％BSA及0.01％吐溫80，pH7.4)中，將2.5μM的尿激酶原或尿激酶原突變體與一定濃度範圍(0.03，0.06，0.12，0.18，0.24，0.3，0.6，1.2，1.8和2.4mM)的S2444加入一個微量滴定板(96孔板)中，在酶標測定儀上以490nm作參照波長，根據測出的在410nm(410/490nm)波長處光密度(ΔOD)值隨時間(t)的增加(ΔOD/t)而計算出反應動力學常數。結果表明，尿激酶原突變體Pro309→Ala，Pro309→Gly，Pro309→Leu，Pro309→Ser，Pro309→Thr，Pro309→Val的內在活性(對S2444)分別為重組尿激酶原的10.5±2.0％，10.8±2.4％，8.5±1.8％，9.6±2.2％，11.2±2.5％，18.4±3.6％。
尿激酶及尿激酶突變體對S2444的活性檢測在活性測定緩衝液中，將1μM的尿激酶原或尿激酶原突變體與20nM的纖維蛋白溶解酶混合置37℃反應1小時，並根據還原型SDS-凝膠電泳證實尿激酶原或尿激酶原突變體完全轉化為對應的尿激酶，取10nM的尿激酶或突變體尿激酶按上述方法測定其對S2444的活性，結果表明尿激酶突變體，Pro309→Ala，Pro309→Gly，Pro309→Leu，Pro309→Ser，Pro309→Thr，Pro309→Val對S2444的活性分別為重組尿激酶的75±2.8％，38±2.4％，24±1.5％，89±3.6％，92±4.8％，68±2.7％。
尿激酶突變體對Glu-型血纖維蛋白溶解酶原的激活作用在25℃以及活性測定緩衝液中，將0.2nM的尿激酶或尿激酶突變體與一定濃度範圍(1.0，1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，7.5和10μM)的Glu-型纖維蛋白溶解酶原及1.5mM的S2251加入一個微量滴定板中，用酶標測定儀以490nm作參照波長，根據測出的在410nm(410/490nm)波長處光密度(ΔOD)值隨時間平方(t2)的增加(ΔOD/t2)而計算出反應動力學常數。結果表明，尿激酶突變體Pro309→Ala，Pro309→Gly，Pro309→Leu，Pro309→Ser，Pro309→Thr，Pro309→Val對纖維蛋白溶解酶原的活性為重組尿激酶的72±4.2％，36±2.5％，18±1.5％，96±6.8％，75±5.4％，23±1.6％。
纖維蛋白溶解酶(Plasmin)對尿激酶原突變體的激活作用在25℃以及活性測定緩衝液中，將0.1nM的纖維蛋白溶解酶與一定濃度範圍(0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，2.5，3.5和5.0μM)的尿激酶原或尿激酶原突變體及1.2mM的S2444加入一個微量滴定板中，用酶標測定儀以490nm作參照波長，根據測出的410nm波長處光密度(ΔOD)值隨時間平方(t2)的增加(ΔOD/t2)而計算出反應動力學常數，結果表明纖維蛋白溶解酶對野生型尿激酶原和尿激酶原突變體的激活能力相近，纖維蛋白溶解酶激活尿激酶原突變體Pro309→Ala，Pro309→Gly，Pro309→Leu，Pro309→Ser，Pro309→Thr，Pro309→Val的速度分別是其激活重組尿激酶原速度的106±5％，87±6％，84±8％，104±3％，109±8％，85±7％。
纖維蛋白及其降解產物E片段和D片段對尿激酶原突變體激活纖維蛋白溶解酶原的促進作用在25℃以及活性測定緩衝液中，將0.5nM的尿激酶原或尿激酶原突變體與2.0μM的Glu-型纖維蛋白溶解酶原及1.5nM的S2251混合置於微量滴定板中，用酶標測定儀測定不加入或加入可溶性纖維蛋白(0.2μM)、纖維蛋白降解D片段(0.4μM)及纖維蛋白降解E片段(5μM)時，反應混合物在410nm波長處光密度(ΔOD)隨時間(t)的變化值(ΔOD/t)，並以此值(ΔOD/t)評估尿激酶原突變體對纖維蛋白溶解酶原激活作用受纖維蛋白及其降解片段的影響。結果表明纖維蛋白降解產物E片段對重組尿激酶原及尿激酶原突變體激活纖維蛋白溶解酶原具有相似的促進作用。纖維蛋白及其降解產物D片段對重組尿激酶原激活纖維蛋白溶解酶原沒有影響，纖維蛋白(0.2μM)對尿激酶原突變體Pro309→Ala，Pro309→Gly，Pro309→Leu，Pro309→Ser，Pro309→Thr，Pro309→Val激活纖維蛋白溶解酶原的促進作用分別為3.8倍，8.4倍，9.2倍，4.4倍，4.7倍，5.4倍。纖維蛋白降解產物D片段(0.4μM)的促進作用分別為5.4倍，10.6倍，12.4倍，5.9倍，6.5倍，6.8倍。
血漿纖維蛋白原溶解活性檢測將尿激酶原(0～10μg/ml)或尿激酶原突變體(0～100μg/ml)與1ml血漿混和並置37℃保溫6、16或24小時後，加入0.2ml的抑肽酶(aprotinin，10,000 KIU/ml)，採用凝血酶—凝塊方法測出在給定時間之後留下的血漿纖維蛋白。其中重組尿激酶原在6小時內使9μM的纖維蛋白原降解50％所需的用量為1.0μg/ml，而導致同樣程度的纖維蛋白原降解時，尿激酶原突變體Pro309→Ala，Pro309→Gly，Pro309→Leu，Pro309→Ser，Pro309→Thr，Pro309→Val的用量分別為6μg/ml，9.8μg/ml，12μg/ml，8.4μg/ml，6.9μg/ml，15.5μg/ml。
血纖維蛋白凝塊溶解分析按照Gurewich等人J.Clin Invest；731731(1980)的描述，從0.3ml血漿中製備125I標記的凝塊。在3ml血漿中加入一定濃度的重組尿激酶原或尿激酶原突變體(1、1.25、1.5、2.0、3.0、5.0、7.5、10.0、20.0μg/ml)進行纖維蛋白凝塊溶解試驗。根據特定時間釋放出的放射性活性對纖維蛋白溶解反應進行定量(以特定時間內已釋放出的放射性活性佔纖維凝塊溶解前125I的總放射性活性的百分數表示)。當血漿中的纖維蛋白凝塊消失後，立即取出0.5ml血漿加入0.1ml 10,000 KIU/ml的抑肽酶以及5IU/ml的凝血酶以測定血漿中殘留的纖維蛋白原百分含量(以未加尿激酶原的血漿為對照，設定其纖維蛋白原百分含量為100％)，結果表明在4小時內使血漿凝塊完全溶解所需的重組尿激酶原或突變體尿激酶原的用量分別為2μg/ml，其血漿中纖維蛋白原的殘留量為72％。Pro309→Ala尿激酶原突變體1.5μg/ml，其血漿中纖維蛋白原的殘留量為80％；Pro309→Gly突變體10μg/ml，其血漿中纖維蛋白原的殘留量為89％；Pro309→Leu突變體20μg/ml，其血漿中纖維蛋白原殘留量為95％；Pro309→Ser突變體1.25μg/ml，其血漿中的纖維蛋白原殘留量為76％；Pro309→Thr突變體1.5μg/ml，其血漿中纖維蛋白原殘留量為78％；Pro309→Val突變體7.5μg/ml，其血漿中纖維蛋白原的殘留量為92％。
權利要求
1.一種具有血栓溶解活性的尿激酶原(pro-UK)突變體，它基本上是由天然尿激酶原的胺基酸序列組成，其中所述序列含有突變。該突變使尿激酶原變體的內在活性(即單鏈活性)比天然尿激酶原低2.5～20倍。當給患者使用時，該變體可產生比天然尿激酶原更低的血纖維蛋白原溶解活性以及非特異性血纖維蛋白溶解酶原激活作用。
2.根據權利要求1所述的尿激酶原突變體，其特徵在於對纖維蛋白溶解酶原的激活作用不僅可被纖維蛋白降解的E片段，而且可被纖維蛋白及其降解的D片段所促進。當給患者使用時，該突變體可以比天然尿激酶原更快地激活纖維蛋白溶解酶原，從而加快血栓的溶解作用。
3.根據權利要求書2所述的尿激酶原突變體，其中天然尿激酶原的胺基酸序列中第309位的脯氨酸(Pro309)，被其他胺基酸所代替。
4.根據權利要求書3所述的尿激酶原突變體，其特徵在於第309位的脯氨酸，或者是用絲氨酸代替，或者是用蘇氨酸代替，或者是用丙氨酸代替，或者是用纈氨酸代替，或者是用甘氨酸代替。
5.一種編碼權利要求書2所述的尿激酶原突變體的DNA分子。
6.用權利要求書5所述的重組DNA分子轉化的細胞。
全文摘要
本發明涉及具血栓溶解活性的尿激酶原突變體,它由天然尿激酶原的胺基酸序列組成,但對其309位的脯氨酸進行定點突變,該突變使尿激酶原變體的內在活性(即單鏈活性)比天然尿激酶原低2.5～20倍,表現為血纖維蛋白原溶解活性以及非特異性血纖維蛋白溶解酶原激活作用的下降。與天然尿激酶原相比,該突變體對纖維蛋白溶解酶原的激活作用不僅可被纖維蛋白降解的E片段,而且可被纖維蛋白降解的D片段所促進。
文檔編號A61K38/43GK1277262SQ00109829
公開日2000年12月20日 申請日期2000年7月10日 優先權日2000年7月10日
發明者孫自勇, 劉建寧 申請人:劉建寧