一種鑑定和篩選高兒茶素指數茶樹的功能標記及其應用的製作方法

2023-05-04 19:19:46

本發明屬於生物
技術領域：
，涉及一種鑑定和篩選高兒茶素指數茶樹的功能標記及其應用、應用方法。
背景技術：
：兒茶素是2-苯基苯並吡喃的衍生物，根據兒茶素b環的羥基數目、c環上2,3位同分異構體、c環上3位是否連接沒食子酸等可以劃分為若干種組分。根據兒茶素b環的羥基數目，兒茶素主要可以分為b環二羥基兒茶素和三羥基兒茶素，其中表沒食子兒茶素(egc)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(egcg)屬於b環三羥基兒茶素，而表兒茶素(ec)和表兒茶素沒食子酸酯(ecg)屬於b環二羥基兒茶素。在紅茶發酵過程中，每個茶黃素分子的形成需要1個二羥基兒茶素和1個三羥基兒茶素，即兒茶素指數ci（即二羥基兒茶素/三羥基兒茶素）值為1的鮮葉原料最有利於茶黃素的形成。國外已有多項研究發現，兒茶素指數ci值與紅茶品質密切相關。但專利申請人研究發現，與肯亞等優質紅茶主產國家相比，我國不乏有高兒茶素資源，但這些資源所含的兒茶素egcg佔比偏大（約60%），ci值多在0.2-0.5（jinetal.,2014）。近期，在貴州的少量茶樹資源中，發現了ci值高達5的茶樹。利用高兒茶素指數的資源與其它高兒茶素總量的資源進行雜交，有望培育出兒茶素總量高、兒茶素組分比例合適的優質紅茶品種，高兒茶素指數茶樹資源對改良我國茶樹品種有較大的潛在應用價值。但迄今為止，國內外茶葉兒茶素含量的鑑定大都採取生化測定方法，該方法受茶樹發育時期和生存環境影響、且需要一定量的茶樹葉片，無法做到對野外資源的準確鑑定和雜交子代個體的早期鑑定。技術實現要素：針對現有技術存在的問題，本發明的目的在於設計提供一種基於茶樹類黃酮3′,5′-羥化酶基因上遊調控區域序列存在的插入缺失（indel）突變開發的分子標記，及其應用在鑑定和篩選高兒茶素指數茶樹中的技術方案。高兒茶素指數茶樹指的是ci值大於2.5的特異茶樹材料。所述的一種茶樹類黃酮3′,5′-羥化酶基因功能標記，其特徵在於該功能標記的上遊引物序列如seqidno.1所示，下遊引物如seqidno.2所示。所述的一種茶樹類黃酮3′,5′-羥化酶基因功能標記在鑑定和篩選具有高兒茶素指數茶樹中的應用，其特徵在於該功能標記的上遊引物序列如seqidno.1所示，下遊引物如seqidno.2所示,所述的高兒茶素指數茶樹指的是ci值大於2.5的特異茶樹材料。所述的一種茶樹類黃酮3′,5′-羥化酶基因功能標記在鑑定和篩選具有高兒茶素指數茶樹中的應用方法，其特徵在於包括以下步驟：利用功能標記對各茶樹材料中的f3′5′h基因起始密碼子atg上遊837bp至上遊686bp的dna片段進行pcr擴增和瓊脂糖凝膠分析，如擴增產物顯示為152bp的片段則該茶樹確定為常規資源，如擴增產物顯示為138bp的片段則該茶樹確定為高兒茶素指數茶樹。所述的應用方法，其特徵在於所述的pcr擴增的體系和反應程序為：pcr反應體系：32µlddh2o，2µldna，5µl10×pcrbuffer，4µl25mmmgcl2，5µl2mmdntp，1µlkod-plus-neo酶，10µm的上、下遊引物各3µl；pcr擴增程序為：94℃2min，然後進行以下循環，94℃15sec，56℃25sec，68℃5sec，共35個循環；最後68℃延伸2min；擴增產物在3%的瓊脂糖膠電泳分離。與現有技術相比，本發明的有益效果在於：將本發明中的功能標記運用於分子標記輔助選擇，能快速準確地鑑定和篩選出具有高兒茶素指數（ci值>2.5）的茶樹資源。利用高兒茶素指數的資源與其它高兒茶素含量的資源進行雜交，可規模化創製兒茶素總量高、兒茶素指數ci值接近於1的茶樹育種材料，從而加快優質紅茶茶樹品種的育成步伐。附圖說明圖1是福鼎大白茶和興義6號單株1類黃酮3′,5′-羥化酶基因f3′5′h上遊調控區域序列的比對譜圖；圖1中：fddb為福鼎大白茶，xy6a為興義6號單株1。圖2是福鼎大白茶和興義6號單株1pcr產物的比對譜圖；圖2中：m為marker；1和2分別為福鼎大白茶和興義6號單株1用引物對1和2擴增的pcr產物的條帶，分別為152bp和138bp。圖3是用功能標記indel-f3′5′h對27份茶樹資源的擴增結果；圖3中：m為marker；1-19依次為福鼎大白茶、龍井43、雲抗10號、鐘山雷電茶、昌寧4號、興義4號、明通群體、鳧早2號、景谷老倉群體、迎霜、萬源4號、河洲茶、賀縣種、城步洞茶、錫茶49、貴州大茶樹、巴東長紋巖群體、藤茶和白石牙茶，pcr產物條帶大小為152bp，為常規資源；20-27依次為興義6號單株1、興義6號單株2、興義6號單株3、納雍古菁茶1號、納雍古菁茶6、納雍古菁茶22號、納雍古菁茶28號和納雍古菁茶48號，pcr產物條帶大小為138bp，為ci值大於2.5的高ci資源。具體實施方式下面結合附圖和具體實施方式對本發明做進一步詳細的說明。下述實施例中所用的試劑，如無特殊說明，可以從常規生化試劑商店購買得到。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。實施例1f3′5′h上遊調控區域特異等位基因差異序列的發現、引物對及功能標記indel-f3′5′h的開發1.供試材料選擇福鼎大白茶和興義6號單株1為研究材料。2.兒茶素含量測定採摘茶樹春季新梢的一芽二葉，採用120℃熱風乾燥5min及時固樣，75℃烘至足幹低溫保存。待測定時用機械磨碎，過40目篩後低溫保存，備用。稱取0.2g樣品（精確到0.0001g），置於10ml離心管中。加入70℃預熱的70%甲醇溶液5ml，混勻後70℃水浴。水浴10min，中間揺勻2-3次。3,500r/min離心10min，轉移上清液。重複加入70℃預熱的70%甲醇溶液5ml、再浸提一次，合併兩次收集的上清液，定容至10ml。移取2ml提取液置於容量瓶中，用穩定液（5%的10mg/mledta溶液、5%的10mg/ml抗壞血酸溶液、10%的乙腈）定容至10ml，混勻後用0.45μm的濾膜過濾。採用高壓液相色譜法（hplc）進行檢測，以外標法對生物鹼和兒茶素進行定性和定量分析。液相色譜測定條件：c12色譜柱4.6mm×250mm(4μm，廣州菲羅門)；流動相a為0.5％甲酸，流動相b為乙腈，流速1ml/min，柱溫30℃，檢測波長280nm，進樣量10μl，梯度洗脫：流動相b在16min內由6.5％線性梯度變化到16％，第16min到20min由16％線性梯度變化到25％，保持5min，回到初始狀態，再平衡5min。測定結果表明，與福鼎大白茶相比，興義6號單株1的三羥基兒茶素含量很低，僅為18.1mg/g（表1）。興義6號單株1的兒茶素指數ci為5.58，遠高於福鼎大白茶。表12份茶樹材料春茶兒茶素性狀的差異（mg/g）材料名稱egcegcgececg三羥基兒茶素（egc+egcg）二羥基兒茶素（ec+ecg）兒茶素指數ci福鼎大白茶19.293.78.831.4112.940.20.38興義6號單株13.115.06.695.518.1102.15.583.基因組dna的提取取1g新鮮嫩梢，加液氮研磨至粉末狀。將0.2g粉末置入1.5ml離心管，加700μlctab提取液，充分混勻後65℃下水浴1h，每20min揺勻一次。加入等體積氯仿/異戊醇（24：1），混勻後靜置2min。室溫下14,000g離心10min，取上清。加入等體積預冷的異丙醇，-20℃靜置1h。14,000g離心10min，棄上清。加入300μl高鹽溶液，65℃溫育30min至沉澱溶解。室溫下10,000g離心10min，取上清。加入1/10體積預冷的naac（ph5.2），2/3體積預冷的異丙醇，充分混合，-20℃放置30min。14,000g離心5min，棄上清。70%乙醇洗滌沉澱1次，無水乙醇洗滌一次。放在超淨工作檯上吹乾30min，溶於200μl滅菌水中，-20℃保存。4.pcr測序及序列分析設計特異引物，擴增各茶樹材料中的f3′5′h起始密碼子atg上遊1417bp至下遊892bp的dna片段，引物由軟體primer5.0設計，序列如下：上遊引物（如seqidno.3所示）：5′－tgaaagcggtttttcgtgtg－3′，下遊引物（如seqidno.4所示）：5′－gtgccttgatgttggtcgtg－3′；pcr反應體系：32µlddh2o，2µldna，5µl10×pcrbuffer，4µl25mmmgcl2，5µl2mmdntp，1µlkod-plus-neo酶，10µm的正、反向引物各3µl。pcr擴增程序為：94℃2min，然後進行以下循環，94℃15sec，5425sec，68℃1min，共35個循環；最後68℃延伸7min。pcr擴增產物在1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳，在紫外燈下觀察並切膠回收，連入載體、轉化，菌液pcr篩選陽性克隆測序。分析發現兩份材料間1417bp的上遊調控區域（trr）中有多個單核苷酸突變（snp）和1個14bp的插入缺失（indel）變異（圖1）。5.功能標記indel-f3′5′h的開發根據兩材料間14bp的插入缺失設計特異引物，擴增各茶樹材料中的f3′5′h基因起始密碼子atg上遊837bp至上遊686bp間的dna片段，引物由軟體primer5.0設計。序列如下：上遊引物（如seqidno.1所示）：5′－accaacacagtccccgttgt－3′，下遊引物（如seqidno.2所示）：5′－gtaattgtggtgacagtga－3′；利用所述的引物序列分別進行pcr擴增和瓊脂糖凝膠分析。pcr反應體系：32µlddh2o，2µldna，5µl10×pcrbuffer，4µl25mmmgcl2，5µl2mmdntp，1µlkod-plus-neo酶，10µm的正、反向引物各3µl。pcr擴增程序為：94℃2min，然後進行以下循環，94℃15sec，56℃25sec，68℃5sec，共35個循環；最後68℃延伸2min。pcr擴增產物在3%的瓊脂糖膠電泳分離。分析發現，福鼎大白茶的電泳條帶大小為152bp，而興義6號單株1電泳條帶大小為138bp，兩個材料的pcr擴增產物可用3%的瓊脂糖膠電泳檢測到明顯的差異（圖2）。利用功能標記indel-f3′5′h可以檢測茶樹資源f3′5′h基因上遊調控區域的序列變異，並可把含高兒茶素指數的茶樹材料篩選出來。實施例2功能標記indel-f3′5′h的應用1.供試材料本實驗所研究的材料列於表2中，包括27份茶樹資源，於8月份採集一芽二葉新梢進行dna提取和兒茶素性狀鑑定。表227份茶樹資源的pcr擴增結果及其兒茶素指數值編號資源名稱兒茶素指數（ci）值pcr擴增產物大小（bp）1福鼎大白茶0.4321522龍井430.4521523雲抗10號0.5421524鐘山雷電茶0.4171525昌寧4號0.9211526興義4號0.3321527明通群體0.2471528鳧早2號0.2491529景谷老倉群體0.66815210迎霜0.19615211萬源4號0.38815212河洲茶0.24815213賀縣種0.31915214城步洞茶0.24115215錫茶490.26915216貴州大茶樹0.28915217巴東長紋巖群體0.30815218藤茶0.28615219白石牙茶0.26715220興義6號單株13.96613821興義6號單株22.79613822興義6號單株33.64713823納雍古菁茶1號3.06913824納雍古菁茶6號6.77113825納雍古菁茶22號6.88013826納雍古菁茶28號5.91613827納雍古菁茶48號3.4071382.功能標記對不同茶樹資源f3′5′h基因的基因型檢測利用功能標記indel-f3′5′h對27份材料的進行基因型檢測。dna提取、pcr擴增體系、程序和瓊脂糖凝膠條件同實施例1。結果如圖3所示，其中在材料1—19的pcr產物大小為152bp，材料20—27的pcr產物大小為138bp。3.27份茶樹材料的兒茶素指數ci值鑑定兒茶素鑑定方法高效液相色譜法同實施例1所述。27份材料中，pcr產物大小為152bp的19份材料兒茶素指數ci值均低於1，平均為0.37±0.18，pcr產物大小為138bp的8份材料兒茶素指數ci值均高於2.5，平均為4.56±1.69，兩類材料間的兒茶素指數ci值具有極顯著差異（p<0.0001），indel-f3′5′h可以作為鑑定和篩選高兒茶素指數茶樹的功能標記。本文中所描述的具體實施例僅是對本發明精神作舉例說明。本發明所屬
技術領域：
的技術人員可以對所描述的具體實施例做各種修改或補充或採用類似的方式替代，但並不會偏離本發明的精神或者超越所附權利要求書所定義的範圍。sequencelisting中國農業科學院茶葉研究所一種鑑定和篩選高兒茶素指數茶樹的功能標記及其應用12patentinversion3.3120dna人工合成1tgaaagcggtttttcgtgtg20219dna人工合成2gtaattgtggtgacagtga19320dna人工合成3tgaaagcggtttttcgtgtg20420dna人工合成4gtgccttgatgttggtcgtg20當前第1頁12