一種新的提取純化羊胎素工藝和檢測其生物活性的方法
2023-05-04 15:15:31 1
專利名稱：一種新的提取純化羊胎素工藝和檢測其生物活性的方法
技術領域：
本發明涉及生物製藥技術，尤其涉及一種新的提取純化羊胎素工藝和檢測其生物活性的方法。
羊胎盤中含有近百種促進機體組織細胞代謝和修復的有效成份，隨著近年來生物製藥技術的進步，獲得較純的羊胎盤內的蛋白和多肽組分已成為可能，然而目前所採用的傳統提取方法為從食品工藝中衍生過來的方法，(如中國專利申請號98101188和98115761所述)，不僅僅過於粗糙，提取的所謂的羊胎素實際上是羊胎盤中所有的結構蛋白質和功能蛋白質及多糖的混合物，具有免疫原性，根本不能藥用，同時由於酶降解、蛋白質變性、溫度變化等因素的影響，所提取的物質生物活性差、專一性弱只用於美容化妝等行業，可以說用現有的方法提取羊胎素，不僅提取不到羊胎素而且浪費了大量的寶貴的羊胎盤資源。
本發明的目的就是為了克服現有羊胎素提取方法的缺陷，而提供的一種具有純度高、勻一性好、生物活性強和得率多、成本低等特點的一種新的提取純化羊胎素工藝和檢測其生物活性的方法。
實現本發明目的的技術方案是一種新的提取純化羊胎素工藝，其特點是，包括抽提和鹽析、超濾和脫鹽、透析和濃縮、以及羧甲基纖維素葡聚糖凝膠陽離子交換層析(以下簡稱CM-SephadexC50柱層析)四個步驟；所述的抽提和鹽析的步驟包括將新鮮或冷凍的羊胎剪除胎膜和大血管，洗淨殘餘的血塊，切碎，再在組織搗碎機中反覆搗碎，製成勻漿；將該勻漿在冰浴中攪拌，棄沉澱，取上清液再攪拌，鹽析沉澱，即得到含有羊胎素的粗提物；所述的超濾和脫鹽的步驟包括先在截留值為30000千道爾頓～4000道爾頓的過濾機中初濾，再在攝氏0-15度的低溫條件下採用截留值為100道爾頓～800道爾頓的過濾機進行分級超濾和脫鹽；所述的透析和濃縮的步驟包括將粗提物用少量冷去離子水溶解後，再徹底透析；收集透析液並濃縮，計算總體積，測定蛋白質濃度；所述的CM-SephadexC50柱層析步驟包括將羊胎素粗提物濃縮液透析，然後上樣於預先用同樣緩衝液平衡過的CM-SephedexC50(2.5×50cm)柱進行洗脫，得到第一個蛋白峰；待該蛋白峰下降至基線位置時，再遞次用上述磷酸鹽緩衝液洗脫，分別可得到第二個蛋白峰和第三個蛋白峰；分別收集上述CMF1、CMF2和CMF3組份，分別命名為羊胎素1，羊胎素2和羊胎素3待測其蛋白質濃度和生物活性。
上述一種新的提取純化羊胎素工藝，其中，所述的將羊胎盤製成勻漿的要求是在1℃～6℃的條件下，每公斤組織塊加入含0.5mmol/L苯甲基璜醯氟(以下簡稱PMSF)的0.15mol/L硫酸銨溶液2L，在組織搗碎機中反覆搗碎3分鐘，製成勻漿。
上述一種新的提取純化羊胎素工藝，其中，所述的透析是將粗提物用少量冷去離子水溶解後，置於截留值＜4000的透析袋內，在1℃-4℃下不斷攪拌，對水徹底透析。
一種檢測羊胎素生物學活性的方法，其特點是，包括分子量測定和胺基酸組成分析兩大步驟；所述的分子量測定是採用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯銨凝膠電泳法，其步驟為將標準蛋白和待測蛋白樣品加入等體積的樣品緩衝液中混勻後，加熱，然後按預定順序電泳；當樣品開始進入上層膠中時，逐漸被濃縮；當染料前沿進入分離膠時，並達到分離膠底部時，剝膠並標記；脫色後測量從分離膠起始處到標記染料區帶及蛋白區帶中心位置的距離；然後以標準蛋白分子量對數為縱坐標，以相對遷移率(Rm)為橫坐標，在半對數坐標紙上作出標準曲線；根據待測蛋白的Rm值在標準曲線上算出其對應的分子量。
所述的胺基酸組成分析方法在基酸自動分析儀上進行。
所述的羊胎素組份生物活性的測定採用氚-胸腺嘧啶核苷(以下簡稱3H-TdR)摻入法進行，其步驟為取成纖維細胞經0.25％胰蛋白酶消化後製成細胞懸液，接種於培養板上，24小時後換培養液，置於37℃，5％CO2飽和溼度條件下繼續培養；次日加入倍比稀釋的羊胎素不同組份，同條件下繼續培養。48小時後結束培養，傾去培養液，加入0.25％胰蛋白酶消化3min，多頭細胞搜集器收集細胞於玻璃纖維濾片上，水洗後固定，再烘乾，置閃爍液中，通過儀器測各樣品管的cpm值；再以含羊胎素組份的蛋白質濃度為橫坐標，以每孔的cpm數為縱坐標，描記3H-TdR摻入曲線，其中一個活性單位(ED50)定義為最大刺激活性一半時所需的羊胎素組份的含量。
上述方法，其中，所述的緩衝液由10％聚乙醯胺12-烷基磺醯鈉(以下簡稱SDS)、1％硫基乙醇、0.01mol/LPH7.8磷酸鈉構成。
上述方法，其中，所述的電泳的電泳體系是濃縮膠濃度為3％，PH6.8，分離膠濃度為15％，PH8.8。
上述方法，其中，所述的濃縮時間約為40分鐘-50分鐘。
上述方法，其中 上述方法，其中，所述的閃爍液為0.3％PPO和0.03％POPOP的甲苯溶液。
由於本發明採用了以上的技術方案，採用現代生物技術提取純化羊胎盤蛋白組分，明顯的優於目前公開材料所報導的方法，用該方法所獲得的羊胎素具有純度高、勻一性好、生物活性強和得率多、成本低等特點，有極大的實用價值。
本發明通過使用現代生物製藥技術，提取純化羊胎盤組分1，組份2和組份3，分別命名為羊胎素1，羊胎素2，羊胎素3。並進一步建立檢測其生物活性的方法。為進一步開發和利用羊胎素提供了一條可行的途徑。
下面結合實施例和附圖進一步說明本發明的特徵和優點。
圖1是本發明羊胎素的分離純化的流程圖。
本發明主要包括使用硫酸胺鹽抽提，鹽析沉澱，低溫離心，低溫超濾，陽離子交換層析等方法進行分離純化羊胎素和建立羊胎素活性檢測方法兩方面的內容。
羊胎素的分離純化的流程見圖1。
羊胎素的分離純化的步驟是(1)抽提和鹽析將新鮮或冷凍的羊胎剪除胎膜和大血管，用生理鹽水洗淨殘餘的血塊，絞碎，稱溼重，在4℃條件下，每kg組織塊加入含0.5mmol/LPMSF的0.15mol/L硫酸銨溶液2L，用DS-l型組織搗碎機反覆搗碎3分鐘，製成勻漿。用6mol/LHCL將勻漿液的PH調至4.5，冰浴中機械攪拌2小時，然後7500rpm/min離心60分鐘，棄沉澱，上清液用lmol/LNaOH調節PH至6.0，該上清液在不斷攪拌下緩慢加入固體(NH4)2SO4粉230g/L，鹽析沉澱。次日7500rpm/min，離心60分鐘，棄沉澱，所得上清液再加入固體硫酸銨粉300g/L，鹽析沉澱，7500rpm/min，離心60分鐘，棄上清液，所得到的沉澱即為含有羊胎素的粗提物。超濾超濾裝置的選擇根據條件可選用淺道系統超濾裝置或封閉系統有攪拌裝置或中空纖維系統超濾裝置，其中以中空纖維超濾裝置效率最佳。為降低投資成本本方法選用了中國科學院上海原子核研究所生產的SINR的板框式超濾設備。
超濾膜的選擇膜的選擇主要包括兩個方面，一方面是膜截留值分子量的選擇，主要根據被處理的物質的分子量大小和要求達到得分離效果來選擇膜，如被分離的物質的分子量為25000KD，要達到90％的分離效果，則可選擇膜截留值為20000KD，如要達到100％的分離效果可選擇截留值為10000KD或更小的膜。另一方面選擇分離效果比較好濾出速度又比較快的膜。本方法選擇了中科院上海原子核所研製的超濾膜，先選用截留值為4000道爾頓，純水流量為30-40升/平方米/小時的SPK高分子合金無菌超濾膜，然後再選用截留值為600道爾頓的SPK高分子合金無菌超濾膜，在0-10度的低溫條件下進行分級超濾和脫鹽，獲得了極佳的分離效果(可用色譜分析法測定分離物的純度)。透析和濃縮將粗提物用少量冷去離子水溶解後，置於截留值＜4000的透析袋內，在4℃下不斷攪拌，對水徹底透析；收集透析液並濃縮，計算總體積，測定蛋白質濃度。CM-SephadexC50柱層析將羊胎素粗提物濃縮液20-40ml，對0.1mol/LPH6.0PBS透析，然後上樣於預先用同樣緩衝液平衡過的CM-SephedexC50(2.5×50cm)柱，在核酸蛋白檢測儀和記錄儀的監測下進行洗脫，流速為50ml/hr，可得到第一個蛋白峰(CMF1)，待蛋白峰下降至基線位置時，再遞次用含0.15mol/LNaCL和0.6mol/LNaCL的上述磷酸鹽緩衝液洗脫，分別可得到第二個蛋白峰(CMF2)和第三個蛋白峰(CMF3)。分別收集上述CMF1、CMF2和CMF3組份，分別命名為羊胎素1，羊胎素2和羊胎素3待測其蛋白質濃度和生物活性。
上述3個組份經生物活性檢測發現對3T3細胞有很強的促細胞分裂活性，其中含0.6mol/1NaCL的緩衝液洗脫物CM3d的生物活性最高。1kg羊胎盤經上述步驟純化後可得到的羊胎素、羊胎素、羊胎素3，產率分別為400～450mg、200～250mg、和40～60mg。
本發明羊胎素生物學檢測的方法包括分子量測定、胺基酸組成分析、羊胎素組份生物活性的測定採用3H-TdR摻入法1.分子量測定採用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯銨凝膠電泳(SodiumDodeySulfate-PolyacrylamideGelElectrophoresis，SDS-PAGE)法測定分子量將標準蛋白和待測蛋白樣品加入等體積的樣品緩衝液中(10％SDS-1％硫基乙醇-0.01mol/LPH7.8磷酸鈉緩衝液)混勻後，在沸水中加熱3分鐘，然後按預定順序加入同一電泳體系(濃縮膠濃度為3％，PH6.8，分離膠濃度為15％，PH8.8)中電泳，上槽正極，下槽負極。電壓調至50V(約8V/CM)，樣品開始進入上層膠中，逐漸被濃縮(約40-50分鐘)。當染料前沿進入分離膠(下層)時，電壓調至120V，繼續電泳，直至溴酚蘭達到分離膠底部，調電壓至零，切斷電源。剝膠並標記。將整塊分離膠浸沒在0.25％考馬斯亮藍R250溶液中染色5小時。取出凝膠，用水漂洗數次後放入脫色液中脫色。脫色後測量從分離膠起始處到染料區帶及蛋白區帶中心位置的距離。然後以標準蛋白分子量對數為縱坐標，以相對遷移率(Rm)為橫坐標，在半對數坐標紙上作出標準曲線。根據待測蛋白的Rm值在標準曲線上算出其對應的分子量。 2.胺基酸組成分析在日立835-50型胺基酸自動分析儀上進行(分析前處理6NHCL，110℃，20小時水解，樣品濃度0.6ml/ml)，由中科院生化所協助完成。
3.羊胎素組份生物活性的測定(3H-TdR摻入法)取3T3成纖維細胞，0.25％胰蛋白酶消化後製成細胞懸液，用含10％小牛血清的培養液按2×104/mm3密度接種於96孔培養板上，24小時後換含0.5％小牛血清的DMEM培養液，置於37℃，5％CO2飽和溼度條件下繼續培養。次日加入倍比稀釋的羊胎素不同組份，同條件下繼續培養。48小時後，每孔加含3H-TdR的DMEM液50μl(1μci)，繼續培養4小時後結束培養，傾去培養液，加入0.25％胰蛋白酶消化3min，多頭細胞搜集器收集細胞於玻璃纖維濾片上，蒸餾水洗6次後，5％三氯醋酸固定，60-80℃烘乾1小時，置閃爍液(0.3％PPO和0.03％POPOP的甲苯溶液)中，自動液閃計數儀測各樣品管的cpm值。以含羊胎素組份的蛋白質濃度為橫坐標，以每孔的cpm數為縱坐標，描記3H-TdR摻入曲線，其中一個活性單位(ED50)定義為最大刺激活性一半時所需的羊胎素組份的含量。
含不同羊胎素的提取物對3T3細胞活性的影響見圖5。
當在無血清的培養液中加入10ng/ml的羊胎素3後(見圖9)，微血管內皮細胞CMEC和動脈血管平滑細胞ASMC的CPM值分別從2459±268.90和1699.4±203.96增加到4807.0±326.72和3260.4±268.67，增加的百分比分別為95.47％和91.90％，差異極顯著(P＜0.01)。
本發明羊胎素含有較多的免疫球蛋白、活性多糖、生長激素、細胞活性因子，是一種具有高度生物活性的促進細胞代謝和防止衰老的生物活性物質。研究證明其對促進表皮細胞增殖、延緩細胞凋亡、增加細胞傳代等生物學特點使其具有極高的潛在應用價值，並能刺激肝細胞再生，具有增強免疫功能、提高機體的抵抗力、以及美容和延緩衰老的作用，目前羊胎素的組合物在香港市場的售價已達500港幣/ml。本發明羊胎素除具有上述作用外，還可能對所有中胚層來源的細胞都具有促增殖和分裂作用，因此，它能對生殖系統、造血系統、心血管系統、神經和內分泌系統產生廣泛的影響，可進一步開發出如增加腦細胞活力、增強記憶力、改善老年人思維的生物製劑和增強造血機能、促進心肌細胞和肝細胞修復的新型生物藥物。
權利要求
1.一種新的提取純化羊胎素工藝，其特徵在於，包括抽提和鹽析、超濾和脫鹽、透析和濃縮、以及羧甲基纖維素葡聚糖凝膠陽離子交換層析四個步驟；所述的抽提和鹽析的步驟包括將新鮮或冷凍的羊胎剪除胎膜和大血管，洗淨殘餘的血塊，切碎，再在組織搗碎機中反覆搗碎，製成勻漿；將該勻漿在冰浴中攪拌，棄沉澱，取上清液再攪拌，鹽析沉澱，即得到含有羊胎素的粗提物；所述的超濾和脫鹽的步驟包括先在截留值為30000千道爾頓～4000道爾頓的過濾機中初濾，再在攝氏0-15度的低溫條件下採用截留值為100道爾頓～800道爾頓的超濾器進行分級超濾和脫鹽；所述的透析和濃縮的步驟包括將粗提物用少量冷去離子水溶解後，再徹底透析；收集透析液並濃縮，計算總體積，測定蛋白質濃度；所述的羧甲基纖維素葡聚糖凝膠陽離子交換層析步驟包括將羊胎素粗提物濃縮液透析，然後上樣於預先用同樣緩衝液平衡過的羧甲基纖維素葡聚糖凝膠陽離子交換層析柱進行洗脫，得到第一個蛋白峰；待該蛋白峰下降至基線位置時，再遞次用上述磷酸鹽緩衝液洗脫，分別可得到第二個蛋白峰和第三個蛋白峰；分別收集上述CMF1、CMF2和CMF3組份，分別命名為羊胎素1，羊胎素2和羊胎素3待測其蛋白質濃度和生物活性。
2.根據權利要求1所述的一種新的提取純化羊胎素工藝，其特徵在於，所述的將羊胎盤製成勻漿的要求是在1℃～6℃的條件下，每公斤組織塊加入含0.5mmol/L苯甲基璜醯氟的0.15mol/L硫酸銨溶液2L，在組織搗碎機中反覆搗碎3分鐘，製成勻漿。
3.根據權利要求1所述的一種新的提取純化羊胎素工藝，其特徵在於，所述的透析是將粗提物用少量冷去離子水溶解後，置於截留值＜4000的透析袋內，在1℃-4℃下不斷攪拌，對水徹底透析。
4.一種檢測羊胎素生物學活性的方法，其特徵在於，包括分子量測定和胺基酸組成分析兩大步驟；所述的分子量測定是採用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯銨凝膠電泳法，其步驟為將標準蛋白和待測蛋白樣品加入等體積的樣品緩衝液中混勻後，加熱，然後按預定順序電泳；當樣品開始進入上層膠中時，逐漸被濃縮；當染料前沿進入分離膠時，並達到分離膠底部時，剝膠並標記；脫色後測量從分離膠起始處到標記染料區帶及蛋白區帶中心位置的距離；然後以標準蛋白分子量對數為縱坐標，以相對遷移率(Rm)為橫坐標，在半對數坐標紙上作出標準曲線；根據待測蛋白的Rm值在標準曲線上算出其對應的分子量。所述的胺基酸組成分析方法在基酸自動分析儀上進行。所述的羊胎素組份生物活性的測定採用氚-胸腺嘧啶核苷摻入法進行，其步驟為取成纖維細胞經0.25％胰蛋白酶消化後製成細胞懸液，接種於培養板上，24小時後換培養液，置於37℃，5％CO2飽和溼度條件下繼續培養；次日加入倍比稀釋的羊胎素不同組份，同條件下繼續培養。48小時後結束培養，傾去培養液，加入0.25％胰蛋白酶消化3min，多頭細胞搜集器收集細胞於玻璃纖維濾片上，水洗後固定，再烘乾，置閃爍液中，通過儀器測各樣品管的cpm值；再以含羊胎素組份的蛋白質濃度為橫坐標，以每孔的cpm數為縱坐標，描記氚-胸腺嘧啶核苷摻入曲線，其中一個活性單位(ED50)定義為最大刺激活性一半時所需的羊胎素組份的含量。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述的緩衝液由10％聚乙醯胺12-烷基磺醯鈉、1％硫基乙醇、0.01mol/LPH7.8磷酸鈉構成。
6.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述的電泳的電泳體系是濃縮膠濃度為3％，PH6.8，分離膠濃度為15％，PH8.8。
7.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述的濃縮時間約為40分鐘-50分鐘。
8.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述的
9.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述的閃爍液為0.3％PPO和0.03％POPOP的甲苯溶液。
全文摘要
本發明公開了一種新的提取純化羊胎素工藝和檢測其生物活性的方法,採用現代生物技術提取純化羊胎盤蛋白組份,主要包括採用勻漿、鹽沉澱(硫酸胺鹽或氯化鈉鹽)、低溫離心、低溫超濾、葡聚糖層析、核酸蛋白檢測和胺基酸組成分析等步驟,用該方法所獲得的羊胎素具有純度高、勻一性好、生物活性強和得率多、成本低等優點,有極大的實用價值。
文檔編號G01N27/26GK1333294SQ00119440
公開日2002年1月30日 申請日期2000年7月11日 優先權日2000年7月11日
發明者張建軍 申請人:張建軍