IgM半定量細螺旋體病診斷試劑盒的製作方法
2023-04-24 05:51:56
本發明涉及由第一試劑盒及第二試劑盒構成的細螺旋體病診斷試劑盒及細螺旋體病診斷方法。
技術背景
細螺旋體病是由一種螺旋菌(Spirillum)的腎臟鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)被感染髮病的人和動物共通傳染病。這是帶有黃疸和腎臟疾病的急性熱性疾病，在1887年被命名為韋爾氏病(Weil's disease)，且被知為傳染性疾病。在1918年，從韋爾氏病患者分離原因菌命名為出血性黃疸螺旋體(Spirochaetaicterohaemorrhagiae)，之後改稱為出血性黃疸細螺旋體(Leptospira icterohaemorrhagiae)。在分類學上，細螺旋體(Leptospira)屬於細螺旋體科(Leptospiraceae family)，細螺旋體屬(Leptospira genus)根據病原性與否分為腎臟鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)和雙曲鉤端螺旋體(Leptospira biflexa)。具有病原性的腎臟鉤端螺旋體到現在為止被知為由30個血清組(serogroup)分類，包括約300個血清型(serovar)，且這些被知為根據區域血清型分布不同。腎臟鉤端螺旋體存在於感染腎臟鉤端螺旋體的動物組織內，或即使通過動物的排洩物排出，也在維持約20℃溫度可存活數周，所以，通過排洩物排出的菌生存於土壤或水，可感染人。因此，人主要可通過處理感染的動物組織或被咬於感染的動物，或由腎臟鉤端螺旋體汙染的飲食或水被感染。細螺旋體病被知為主要發生在歐洲、美國、澳大利亞、越南、太過、馬來西亞、臺灣、中國、日本等。1942年在韓國報告了由血清學證明的細螺旋體病患者的發生，在1984年從肺出血患者細螺旋體菌被分離確認。之後，在韓國與恙蟲病、腎症候群出血熱、地方性斑疹傷寒一同被指定為第三群法定的傳染病。
細螺旋體病的症狀在發病初期表現出發熱、頭痛、肌肉痛、虛脫等典型臨床症狀的急性熱性疾病，嚴重時可誘發如肺出血的內部器官出血、黃疸、腎功能衰竭的症狀。細螺旋體病的發病原理是通過黏膜或受傷的皮膚滲透的細螺旋體，通過血管迅速擴散到全身且滲透到組織內，使細螺旋體菌毒素損傷血管的內皮細胞。這引發長期出血、血液量的低下、低血壓等症狀，但在發病初期可處方如青黴素的抗生劑，所以，從發病到一至兩天，最晚在三至四天內發現極為重要。
用於診斷細螺旋體病的方法，具有世界衛生組織(World Health Organization；WHO)標準方法的顯微鏡凝集實驗(microscopic agglutination test；MAT)。MAT比起其他診斷方法可具有正確診斷的優點。但是，利用存活的菌，所以，具有維持及管理麻煩，且需要高價的設備，並且只有熟練的專家才能進行試驗的缺點。所以，在保健所及醫院等醫療機關，需要開發簡單且迅速，可正確地診斷細螺旋體病的方法。反映此，最近開發了適用免疫層析法(immunochromatography assay)的快速(rapid)試劑盒。快速試劑盒適用現場診斷床邊檢測(point-of-care testing；POCT)概念，是在15分鐘內可迅速正確地診斷細螺旋體病被開發的醫療器械。但是，通常，這些細螺旋體病診斷試劑盒實質上不區分細螺旋體病的流行區域(epidemic region)和地方性區域(endemic region)的被開發使用。但是，在細螺旋體病地方性區域(endemic region)使用試劑盒診斷患者時，因存在於過去被感染的患者或具有隱性感染(inapparent infection)患者的抗體，具有將其診斷為細螺旋體病患者的問題。因此，需要開發區分流行區域(epidemic region)和地方性區域(endemic region)，可診斷細螺旋體病的試劑盒。
技術實現要素：
技術課題
本發明的目的是提供細螺旋體病診斷試劑盒及利用此的診斷方法，更具體地提供由第一試劑盒及第二試劑盒構成的細螺旋體病診斷試劑盒及利用此的診斷方法。
但是，本發明要解決的課題不限定於上述提及的課題，且沒有被提及的其他課題，可從以下記載明確地理解給從業者。
技術方案
本發明的第一側面是提供一種細螺旋體病診斷試劑盒，由第一試劑盒及第二試劑盒構成，其中，所述第一試劑盒包括1.2μg至2.0μg的細螺旋體抗原，且所述第二試劑盒包括0.6μg至0.9μg的細螺旋體抗原及BSA，並且所述細螺旋體抗原源於細螺旋體脂多糖的多糖。
根據一個實施例，使用所述細螺旋體病診斷試劑盒，可由MAT測定的Ab效價(Ab titer)判別1:50至1:200。
根據一個實施例，所述BSA可以是0.1至0.4μg。
根據一個實施例，所述第一試劑盒還可包括OD 3.5至4.5的金-共軛-山羊-抗人IgM抗體，及所述第二試劑盒還可包括OD 1.5至2.5的金-共軛-山羊-抗人IgM抗體。
根據一個實施例，所述試劑盒可以是利用免疫層析法的條類型、利用免疫層析法的設備類型或微型板塊類型。
根據一個實施例，所述條類型的試劑盒可包括硝化纖維膜、共軛墊、吸收墊及樣品墊。
本發明的第二側面提供一種用於診斷細螺旋體病提供信息的方法，由MAT測定的Ab效價(Ab titer)為了提供1:50至1:200的細螺旋體病患者診斷所需的信息，包括：使用所述細螺旋體病診斷試劑盒，檢測患者的樣品內細螺旋體IgM抗體。
根據一個實施例，所述患者的樣品可以是血清、血漿或全血。
根據一個實施例，其步驟還可包括：比較所述第一試劑盒內檢測出細螺旋體IgM抗體與否和所述第二試劑盒內檢測出細螺旋體IgM抗體與否。
根據一個實施例，檢測所述抗體的步驟利用抗原-抗體反應，且所述抗原-抗體反應可利用從酶聯免疫吸附法(ELISA)、放射免疫檢定法(radioimmnoassay；RIA)、夾心式測定(sandwich assay)、免疫印跡、免疫沉澱法、免疫組化染色法(immnohistochemical staining)、流式細胞術(flow cytometry)、螢光激活細胞分離法(FACS)、酶基質比色法及抗原-抗體凝聚法形成的群中選擇的一個以上方法。
技術效果
根據本發明的由第一試劑盒及第二試劑盒構成的，細螺旋體病診斷試劑盒及利用此的診斷方法，可由MAT診斷測定的Ab效價(Ab titer)為1:50至1:200的細螺旋體病患者，所以，不僅在流行區域(epidemic region)，而且在地方性區域(endemic region)也可診斷細螺旋體病患者。
附圖說明
圖1是示出根據本發明的一個實施例的條型細螺旋體病診斷試劑盒。
具體實施方式
以下，參考附圖對實施例進行詳細地說明。示出在各圖的相同參考符號表示相同的部件。
在以下說明的實施例中，可附加多樣的變更。以下說明的實施例不限於實施形態，應該理解為，包括對這些的所有變更、均等物或者代替物。
在實施例中使用的用語，只是為了說明特定的實施例而被使用，而不是意圖限定實施例。除了明確的指定意思以外，單數的表現包括複數的表現。在本說明書中，「包括」或者「具有」等用語是為了指定說明書上記載的特徵、數字、步驟、動作、構成要素、組件或者這些組合的存在，並且要理解為，不是預先排除一個或者其以上的其他特徵，或者數字、步驟、動作、構成要素、組件或者這些組合的存在或者附加可能性。
除了被定義為其他，包括技術或者科學用語，這裡所使用的所有用語與實施例所屬領域的技術人員一般的理解，具有相同的意思。一般使用的，如被定義在字典的用語被解釋成與相關技術上下文具有相同的意思，並且除了在本申請中明確地定義以外，不能解釋成理想的或者過度形式的意思。
還有，參考附圖進行說明時，與圖的符號無關，相同的構成要素賦予相同的參考符號，對此的重複說明給予省略。在說明實施例時，對相關公開技術的具體說明，被判斷為模糊實施例的說明時，其詳細地說明給予省略。
在本發明使用的用語『診斷』意味著確認病理狀態的存在後特徵。此外，本發明在目的上的診斷是確認細螺旋體病。
在本發明使用的用語『細螺旋體病』，是指細螺旋體(Leptospira)內病院螺旋菌引發的疾病。
在本發明使用的用語流行區域(epidemic region)，是指在哪個時期特定傳染病集中發生的區域。
在本發明使用的用語地方性區域(endemic region)，是指特定傳染病持續發生的區域。
本發明的細螺旋體病診斷試劑盒由第一試劑盒及第二試劑盒構成，且所述第一試劑盒包括1.2至2.0μg的細螺旋體菌抗原，所述第二試劑盒包括0.6至1.0μg的細螺旋體菌抗原及BSA，且所述細螺旋體菌抗原源於細螺旋體菌脂多糖的多糖。
為了檢測對細螺旋體菌的抗體，本發明的細螺旋體病診斷試劑盒，在細螺旋體內的脂多糖(LPS)將脂分離的多糖(polysaccharide)利用為抗原。細螺旋體菌的脂多糖(LPS)由脂類A(lipid A)、核心多糖(core polysaccharide)及O-特性側鏈(O-specific side chain)構成。脂類A和核心多糖由2-酮-3脫氧辛酸(2-keto-3-deoxyoctanic acid；KDO)連接，核心多糖由葡萄糖、半乳糖及N-乙醯氨基葡萄糖構成。更具體地，為了增加抗原抗體反應性，將去除脂類A的以屬(genus)特性的特性側鏈及核心多糖構成的多糖，利用為抗原(參照實施例1)。
歷來使用的細螺旋體病診斷試劑盒的抗原及金-共軛濃度，其目的只是檢測抗體的存在與否，所以，只可判別因抗原-抗體反應的發色與否，來任意選定抗體量並使用。但是，本發明的細螺旋體病診斷試劑盒是從檢測存在於患者內抗體的與否，進一步地，只有哪種程度範圍的抗體量滴定到診斷試劑盒時，選擇性地發色的診斷試劑盒。需要這些診斷試劑盒是根據流行區域和地方性區域，存在於生命體的抗體量相異，所以，只由單純的測定抗體與否的診斷試劑盒，很難正確地進行診斷。
本發明的細螺旋體病診斷試劑盒由第一試劑盒及第二試劑盒構成，且所述第一試劑盒包括1.2至2.0μg的細螺旋體菌抗原，優選地是1.4至1.8μg，更優選地是1.6μg，所述第二試劑盒包括0.6至0.9μg的細螺旋體菌抗原，優選地是0.8μg。通過所述第一試劑盒及第二試劑盒的抗原-抗體反應，可判別IgM切斷(cut-off)為50(MAT Ab titer 1:50)至IgM切斷(cut-off)為200(MAT Ab titer 1:200)的患者。此外，第二試劑盒可包括BSA或酪蛋白。因包括BSA或酪蛋白，可調整對細螺旋體菌的抗原-抗體反應程度。
根據本發明的細螺旋體病診斷試劑盒，在生物學樣品用於測定對細螺旋體菌的抗體水準，診斷細螺旋體病的試劑盒，包括用於觀察抗原-抗體複合體形成，作用為在細螺旋體菌的抗體反應的抗原的，源於細螺旋體菌的脂多糖的多糖。
根據一個實施例，包括在本發明的細螺旋體病診斷試劑盒的第二試劑盒的BAS或酪蛋白的量，可以是0.1至0.4μg。包括BSA時，優選地，包括在所述第二試劑盒的BSA及細螺旋體菌抗原的量的總合是1μg。BSA執行降低抗原-抗體特異反應的反應性作用，具有BSA的量超過0.4時，對MAT Ab效價為50至200，可降低第二試劑盒的反應度，且未滿0.1時，抗原-抗體反應性變高，可導致偽陽性的問題。(參照實施例2-3)
根據一個實施例，所述第一試劑盒還包括OD 3.5至4.5的金-共軛-山羊-抗人IgM抗體，及所述第二試劑盒還可包括OD 1.5至2.5的金-共軛-山羊-抗人IgM抗體。所述第一試劑盒的金-共軛-山羊-抗人IgM抗體以未滿OD 3.5被包括時，因抗原-抗體反應的發色可顯示地不好，且以超過OD 4.5被包括時，可具有在切斷值未滿MAT Ab效價50樣品，可導致陽性的問題。此外，所述第二試劑盒的金-共軛-山羊-抗人IgM抗體以未滿OD 1.5被包括時，因抗原-抗體反應的發色可顯示地不好，且以超過OD 2.5被超過時，可具有在切斷值未滿MAT Ab效價200樣品，可導致陽性的問題。(參照實施例2-3)
作為觀察抗原-抗體複合體形成的免疫分析方法，具有免疫印跡、酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbentassay；ELISA)、放射免疫檢定法(radioimmunoassay；RIA)、放射免疫擴散(radioimmunodiffusion)、擴散(Ouchterlony)免疫擴散法、火箭(rocket)免疫電泳、免疫組織著色、免疫沉澱法(immunoprecipitation assay)、補體結合試驗(complement Fixation Assay)、免疫螢光(immunofluorescence)、免疫層析法(immunochromatography)、FACS等，但不限定於此。
本發明的細螺旋體病診斷用試劑盒不只是與抗體特異性結合的所述多糖，而且包括在免疫學分析使用的，在相應領域一般使用的道具、試劑等。由這些道具或試劑可包括適合載體、可生成檢測信號的標誌物質、溶解劑、清洗劑、緩衝劑、穩定劑等，但不限定於此。此外，本發明的診斷用試劑盒不限定於此，可以是微型板塊、試紙設備、免疫層析試紙條、徑向分區免疫鑑定設備、流入式(flow-through)設備等類型。
優選地，診斷試劑盒是利用免疫層析法的試紙條型的診斷試劑盒或設備型的診斷試劑盒。利用免疫層析法的診斷，在生物學樣品血清中的抗體與結合在膠體金顆粒(colloidal gold particle)的示蹤劑抗體(tracer antibody)反應之後，經毛細管現象通過硝化纖維膜的微孔(micropore)移動的過程中，與固定在微孔內部表面的捕捉抗原(capture antigen)結合形成發色條，可由肉眼辨別陽性及陰性。所述「示蹤劑抗體」是指與細螺旋體菌的抗體反應，且與色彩顆粒結合的抗體。
根據一個實施例，本發明的細螺旋體病診斷試劑盒的抗原-抗體複合體可利用色彩顆粒結合法，例如，作為色彩顆粒可使用膠體金顆粒或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)珠子(bead)。更優選地，可利用金膠體。
圖1是示出根據本發明的一個實施例的條型細螺旋體病診斷試劑盒。
根據一個實施例，本發明的細螺旋體病診斷試劑盒，可由吸收樣品的樣品墊(sample pad)；與樣品內的抗體結合的，包括示蹤劑抗體的金共軛墊(gold conjugation pad)；包括本發明多糖的反應線(test line)和包括抑制蛋白質的對照線(control line)及為了去除非特異性抗體的前反應線(pre-test line)被處理的反應膜(test membrane)；及包括吸收剩餘量樣品的吸收墊(absorption pad)的測試條構成。所述反應線包括本發明的多糖，所述對照線包括兔子抗-山羊IgG的抑制蛋白質。此外，前反應線可包括本發明的細螺旋體菌的脂多糖(LPS)和結構類似的革蘭氏陰性菌，例如，將E.coli，假單胞桿菌等的脂多糖(LPS)以0.5至1mg/ml的濃度。所述金共軛墊可包括被金標記的山羊抗-人IgM。
根據一個實施例，本發明的細螺旋體病診斷試劑盒為利用免疫層析法的條類型診斷試劑盒時，診斷細螺旋體病的方法如下。首先，將要檢測的生物學樣品滴定到所述診斷試劑盒樣品被吸收部位的樣品墊時，生物學樣品由毛細管現象，達到金共軛墊(gold conjugation pad)，使樣品內的抗體結合在金共軛墊內的示蹤劑抗體，例如，在金標記抗人IgM山羊抗體(gold labeled anti-human IgM goat antibody)，形成膠體。在這種情況下，要標本的生物學樣品，沒有固定在所述金共軛墊，繼續移動達到本發明的多糖抗原被固定的反應線(test line)。被細螺旋體菌感染的患者的生物學樣品，與所述多糖抗原進行抗原-抗體反應，但結合在患者的金共軛墊內的特定示蹤劑抗體，對細螺旋體菌的抗體結合在固定在反應線的多糖抗原，形成紅紫色條，可由肉眼觀察。並且，與生物學樣品內抗體不反應的剩餘金共軛墊內的示蹤劑抗體達到對照線，與抑制蛋白質進行反應並形成紅紫色條，顯示檢測的適當性。如此的，本發明的所述診斷試劑盒利用由抗原-抗體反應的免疫層析方法，不需特別地設備可由肉眼快速地確認檢測結果。還有，所述診斷試劑盒去除由前反應線(pretest line)，可將實際不保有對細螺旋體菌的抗體，誤判為保有的肯能行，提高細螺旋體病診斷的正確性。
根據一個實施例，可檢測對細螺旋體菌抗體的生物學樣品，包括血液、血清、血漿等，但不限定於此。
實施例1：製造源於細螺旋體菌的多糖抗原
1-1.培養細螺旋體菌株
將EMJH培養基基礎(Leptospira medium base Ellinghausen McCullough Hohnson Harris)融化成0.23g/100ml滅菌後，添加EMJH培養基添加劑10ml製造培養基。在此培養基接種細螺旋體菌，在24℃進行振蕩培養五天。
1-2.製造細螺旋體抗原
將在EMJH培養基培養五天的細螺旋體菌，在4080xg圓心分離20分鐘，將菌體由1X PBS緩仲劑(buffer)(137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4)清洗三回後，在100℃加熱一個小時。其中，使蛋白水解酶(Proteinase)K成為進行處理，在37℃通宵(overnight)地進行反應。之後，使EGTA成為2mM進行添加，在70℃反應15分鐘之後，由4℃、180,000xg圓心分離兩個小時。在澱積物加H2O漂浮，製造脂多糖(lipopolysaccharide)(Westpha&Jann，1965)。在如此淨化的LPS抗原，使乙酸為1％進行處理，在100℃加溫一小時之後，由2980xg圓心分離20分鐘，去除澱積部分的脂A(lipid A)製造多糖抗原。被製造的抗原在人腸桿菌(Escherichia coli)與上述方法相同地處理淨化的LPS(sigma)，將得到的多糖使用為對照菌(standard)測定量。
實施例2：製作診斷試劑盒
將塑料背板(backing)的NC膜作為基本結構，在中間固定抗原，儲蓄中合體的玻璃纖維膜(共軛墊)貼在下部，吸收過量水溶液的纖維質膜接觸地貼在兩端部(樣品墊、吸收墊)，由相互間連接的形態構成。位於下端的玻璃纖維膜吸收力強，不僅在短時間內可吸收樣品，而且溶解的中合體移動到上部免疫條之前，延長停滯時間，可誘導分析物質和中合體間的有效反應。在中間的免疫條上空間上分離固定，可感知分析物質測定抗原(測試線或固定線(capture line))和中合體的特異抗體(對照線(control line))，位於免疫條上端的吸收墊(absorption pad)纖維質膜，可使迅速地吸收過量的樣品。
2-1.在硝化纖維膜上固定化細螺旋體抗原(polysaccharide)
捕獲分析特異抗體作用的特異抗原的固定化，在纖維質(NC)膜上經靜電相互作用(electrostatic interaction)執行。從塑料背板NC膜條4X25mm下端離1cm的部分、抑制抗體(rabbit anti-goat IgG)在離1.4cm的位置使用分散器，將淨化的抗原(dispenser)以1ul/cm的速度滴定。滴定的膜在37℃烘乾一個小時。
2-2.決定用於前反應線(pre-test line)的抗原
發生由抗原(polysaccharide)的非特異性信號時，為了去除非特異抗體，在滴定位置前端滴定前反應線(pretest line)，可進行去除。使用了與細螺旋體LPS一部分類似的其他細菌(E.coli,Psudomonas aeruginosa)的LPS。
2-3.抗原濃度和金-共軛濃度
之前使用的細螺旋體病診斷試劑盒的抗原及金-共軛濃度，單純地以檢測抗體存在與否為目的，所以，只判斷因抗原-抗體反應的發色與否被使用。但是，進一步的從抗體的測定與否，重要的是某些程度範圍的抗體量只滴定到診斷試劑盒時，選擇性地決定發色的抗原及金-共軛濃度。這如上述，根據流行區域和地方性區域，存在於生命體的抗體量可相異，所以，很難只由單純抗體的與否，進行正確地診斷。
(1)抗原濃度和金共軛濃度
將試劑盒內滴定的抗原濃度的每試劑盒作為0.2μg、0.4μg、0.8μg，且將金-共軛OD作為1、2、3、4，在各個情況下製造各9個試劑盒。被使用的抗體以標準IgM分別使用顯示的效價160、320、640。
表1是顯示根據抗原濃度及金-共軛OD的試劑盒反應。
在表1可知，根據抗原濃度及金-共軛的OD，可檢測抗體的量不同，特別地，金-共軛OD值為2的情況下，可根據抗原及抗體的量，獲得顯著性的結果。
(2)第二試劑盒抗原濃度
試劑盒內金-共軛OD值作為2，抗原的濃度的沒試劑盒作為0.2μg、0.4μg、0.8μg，分別製作各10個試劑盒。在各個試劑盒使用IgM效價顯示160、320、640的十個抗體，測試試劑盒的反應。被使用的抗體如下。
-效價160：99-7、00-224、01-224、87-109、88-123
-效價320：90-226、95
-效價640：99-4、00-100、91-188
表2至4顯示根據抗原及抗體濃度的試劑盒反應。
將金-共軛OD值固定為2，測試根據抗原量和抗體量的發色程度的結果，抗原的量滴定到0.4μg以下時，具有發色的程度低，或根據抗體量的區別不容易的問題。
(3)BSA濃度
在試劑盒內滴定的抗原添加BSA，使滴定總量成為每試劑盒1μg的進行製造。各試劑盒分別包括0.1μg抗原+0.9μgBSA、0.2μg抗原+0.8μgBSA、0.4μg抗原+0.6μg BSA、0.6μg抗原+0.4μgBSA、0.8μg抗原+0.2μgBSA。在各個試劑盒使用IgM效價顯示160、320、640的十個抗體，測試試劑盒的反應。被使用的抗體如下。
-效價160：99-7、00-224、01-224、87-109、88-123
-效價320：90-226、95
-效價640：99-4、00-100、91-188
表5至9顯示根據抗原及BSA濃度的試劑盒反應。
添加BSA使根據抗體量的發色程度的判別更容易。此外，0.6μg抗原+0.4μgBSA及0.8μg抗原+0.2μgBSA時，優選地，判別IgM抗體效價160和IgM抗體效價320。
(4)第一試劑盒抗原濃度
分別製造各12個包括每試劑盒抗原濃度由0.8μg、1.6μg或3.2μg的試劑盒，且通過3回(每回各4個)執行實驗。
抗原的濃度為1.6μg時，根據試劑盒內反應的發色程度，最為沒噪音顯示得很好。
2-4.標本的濃度
用於試劑盒的人血清濃度，或試劑盒內抗原或與金共軛相同，過量或少量時，可誘導非特異性反應。因此，優選地，用於診斷試劑盒的標本為血清或血漿時，取由的樣品稀釋液(Sample diluent)稀釋成約100倍使用，全血時取由的樣品稀釋液稀釋成約50倍使用。由微量移液管取此稀釋的標本注入到標本注入部。或由微量移液管取的血清或血漿，或全血，使吸收到標本注入部底板的樣品墊進行注入，且即刻將7滴樣品稀釋液(Sample diluent)注入到標本注入部。
綜上所述，實施例雖然由限定的實施例和圖被說明，但是本領域的技術人員可從上述的說明多樣地修正及變更。例如，由說明的技術與說明的方法和其他順序被執行，和/或由說明的系統、結構、裝置、迴路等，構成要素與說民的方法和其他形態被鍵合或者組合，或者由其他構成要素或者均等物對置或者置換，也可達到適當的結果。
所以，其他具體體現、其他實施例及與專利請求範圍均等的，也屬於後述的專利請求範圍的範圍。