利用一維微流控生物晶片檢測細胞中基因突變的方法

2023-04-23 18:06:16

專利名稱：利用一維微流控生物晶片檢測細胞中基因突變的方法
技術領域：
本發明涉及微全分析系統的生物學應用領域，尤其涉及一維微流控生物晶片在細胞基因突變分析中的應用開發。
背景技術：
美、英、中等七國已於2001年二月宣布完成人類基因組序列的分析初稿，使人類生物醫學研究領域從基因組時代轉入了後基因組時代，即功能基因組時代。遺傳學家普遍認為後基因組時代的一個重要努力方向便是分析人類基因序列的變異，因為研究人類DNA序列的突變，有助於更加深入的了解人類疾病的產生、發展以及對藥物治療的反應，因此突變的分析檢測方法就顯得非常重要。1985以前，利用Southern印跡法，可以篩選出基因的缺失、插入和移碼重組等突變形式。對於用該法不能檢測的突變，只能應用複雜費時的DNA序列測定分析法。多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術是突變研究中的最重大進展，使基因突變檢測技術有了長足的發展，但是PCR技術的費時、容易出現假陽性而且不能同時檢測多個靶位點等缺點限制了PCR方法在突變檢測中的應用。微陣列晶片(Microarray)的出現為突變檢測提供了一種十分高效的檢測平臺，直接實現了突變分析的高通量和信息集成，然而該方法的分析儀器非常昂貴，而且檢測靈敏度低。微流控技術為實現突變檢測的微量化、快速化及高靈敏度提供了可能，但是在高通量性能上還有待進一步發展。

發明內容
本發明旨在提供一種可應用於細胞基因突變的識別和分析的新型檢測方法，以解決當前基因突變分析方法中存在的微量檢測、高靈敏度以及高通量分析等特點難以並存的缺陷，並促進該技術領域的進一步發展。
本發明通過以下技術方案實現本發明目的利用一維微流控生物晶片檢測細胞中基因突變的方法，包括一維微流控生物晶片上二氧化矽微珠用鹼活化，再用生物素與親和素進行預處理，然後分別加入生物素修飾的突變檢測捕獲探針，將修飾了突變檢測捕獲探針的二氧化矽微珠逐個移入所述生物晶片微通道的小室，形成功能化微珠陣列；將總RNA或靶DNA樣品於包含有螢光探針的雜交緩衝液中稀釋，並在壓力驅動下流過微通道進入功能化微珠陣列，雜交後將含有甲醯胺的高嚴謹洗脫液注入通道進行洗脫，最後通過螢光倒置顯微鏡觀察及拍攝微珠表面螢光，並用軟體對顆粒的表面螢光強度進行估算，根據螢光強度的差別判斷該檢測位點的突變類型。
所述總RNA與螢光探針的比例為1.5×107克∶1摩爾，DNA與螢光探針的比例大於或等於56克∶1摩爾；所述壓力驅動下雜交緩衝液的流速為0.1μl/min；所述螢光探針為四甲基羅丹明修飾的信號探針；所述高嚴謹洗脫液含有體積百分數為60％的甲醯胺。


圖1為一維微流控生物晶片用於檢測細胞基因突變的流程圖；圖2為本發明中採用的三明治雜交模型圖；1-二氧化矽微珠， 2-包被的生物素化的牛血清白蛋白，3-鏈酶親和素，4-生物素修飾的捕獲探針，5-突變檢測基因的核酸片斷，6-四甲基羅丹明修飾的信號探針。
圖3為一維微流控生物晶片檢測基因突變的靈敏度結果；圖4為一維微流控生物晶片檢測CNE2、A549和SKBr-3三種腫瘤細胞p53基因175位密碼子突變情況的結果。
一維微流控生物晶片採用三明治模型作為雜交檢測方法，該模型原理是如圖2所示，生物素化的牛血清白蛋白2通過物理吸附作用結合到固相界面二氧化矽微珠1上，鏈酶親和素3與生物素發生有力結合併固定在二氧化矽微珠表面，生物素修飾的捕獲探針4通過修飾的生物素與二氧化矽微珠表面的親和素3特異性結合併固定在二氧化矽微珠上，生物素修飾的捕獲探針4能特異性的選擇識別靶核酸序列5中的互補匹配序列，而另外一條四甲基羅丹明修飾的信號探針6能與靶核酸序列5匹配結合，三者結合後形成了類似於三明治的雜交結構，可以實現靶核酸序列非標記情況下的特異性檢測。
本發明方法的優點是本發明過程利用mRNA與DNA為檢測對象，不需要常規方法中採用的PCR過程，從而避免了PCR過程中因為汙染導致假陽性的情況；同時由於一維微流控生物晶片具有微量檢測和高通量檢測的雙重特性，因此常規突變分析方法中微量檢測、高靈敏度以及高通量分析等特點難以並存的缺陷得到較好的解決；本發明方法在40pM靶濃度條件下仍然能區分單鹼基突變的區，採用一次進樣就可以進行多個目標的同時檢測；此外本發明方法在CCD以及計算機軟體的輔助下可以實時檢測和觀察探針的雜交和洗脫過程，並有望使用本發明方法實現單細胞水平上的基因突變分析，為研究人類疾病的發生、發展以及個性化醫療提供一種高效的分析方法。
具體實施例方式
實施例1，一維微流控突變檢測晶片以DNA序列為對象檢測p53基因突變1.製備突變檢測二氧化矽微珠取直徑40μm的二氧化矽微珠約10～20mg置於1.5ml的Ep管中，加入500μl 0.01M的NaOH活化表面20min，用TE清洗3次，去除上清液；加入80μl 0.1～1.0mg/ml的生物素化的牛血清白蛋白(Biotin-BSA)，置於低溫搖床上4℃，350rpm搖蕩12～48h，然後用TE清洗3次，Biotin-BSA通過物理吸附作用結合到顆粒表面；加入80μl 0.1～1.0mg/ml的鏈酶親和素(Streptavidin)，置於低溫搖床上4℃，350rpm搖蕩4～8h，鏈酶親和素能與顆粒表面的生物素發生有力結合併固定在顆粒表面，用TE清洗3次；分別加入50μl 0.1～1.0μM生物素修飾的突變檢測捕獲探針Capture-C、Capture-G、Capture-T和Capture-A(如表1所示)，於4℃，350rpm搖蕩12～48h，用TE清洗後4℃保存備用。捕獲探針通過修飾的生物素與顆粒表面的親和素特異性結合併固定在顆粒上，從而形成了具有p53基因突變檢測能力的功能化二氧化矽顆粒。
2.製備一維微流控突變檢測晶片將聚二甲基矽氧烷與固化劑充分混合後於真空泵中除去氣泡，然後平鋪在晶片陽模板上，置於75℃烘箱中20～40min，待固化後取出，最後將聚二甲基矽氧烷(PDMS)片基從陽模板上剝離下來，該片基中包含有許多用於容納微珠的小室；將該片基放置在倒置螢光顯微鏡上，通過顯微操作的方法將直徑在40μm左右的修飾有突變檢測探針的功能化微珠放置在片基微通道中的小室中首先，使用一套進口的燒針、拉針及磨針系統製備顯微操作微吸管，將微吸管固定在倒置螢光顯微鏡的顯微作業系統上，然後在顯微條件下，將不同的功能化微珠按照位置編碼的方式放入通道中的小室內，每個小室對應不同的功能化微珠用於樣品的多目標檢測；最後用潔淨的玻片與片基緊密結合完成晶片的封裝。
3.按圖1的操作流程，將含有濃度為1pM～10nMp53-G樣品和10nM四甲基羅丹明修飾信號探針(F-probe)的雜交緩衝液(所述雜交緩衝液的成分為10mM磷酸鉀緩衝液(pH7.6)、300mMNaCl、體積百分數為0.1％的吐溫20和體積百分數為30％的甲醯胺)在壓力驅動下以0.1μl/min的流速通過一維生物晶片微通道中放置的突變檢測功能化微珠陣列，雜交20min後，用5μl的TE清洗通道；然後在壓力驅動下以2μl/min的流速通入含有體積百分數為60％甲醯胺的高嚴謹洗脫緩衝液(所述洗脫緩衝液的成分為10mM磷酸鉀緩衝液(pH7.6)、150mMNaCl、體積百分數為0.1％的吐溫20和體積百分數為60％的甲醯胺)，利用匹配(Capture-C與p53-G)與單鹼基不匹配(Capture-G，Capture-T，Capture-A與p53-G)序列間熱動力學差別進行洗脫識別，5min後再次用TE清洗通道。將反應後的晶片按照圖1所示的流程置於螢光倒置顯微鏡中的CCD成像系統下，對顆粒進行觀察拍攝，並用螢光圖像分析軟體進行分析，可獲得如圖3所示的突變檢測靈敏性能的結果。結果表明，當靶序列濃度在0.04nM時，信噪比為4(信噪比定義為完全匹配性雜交所產生的螢光信號除以單鹼基不匹配性雜交產生的螢光信號，同時認為只有完全匹配性雜交所產生的螢光信號除以單鹼基不匹配性雜交產生的螢光信號大於4時數據有效)，隨著靶序列濃度的提高，完全匹配性雜交產生的螢光也不斷提高，當靶序列濃度達到3nM時，完全匹配性雜交產生的螢光信號達到最大，由此可見利用本發明方法能在0.04nM靶序列濃度下識別單鹼基突變。
表1合成的用於檢測p53基因突變的寡核苷酸探針

實施例2，一維微流控突變檢測晶片以mRNA序列為對象檢測p53基因突變1.製備突變檢測二氧化矽微珠取直徑40μm的二氧化矽微珠約10～20mg置於1.5ml的Ep管中，加入500μl 0.01M的NaOH活化表面20min，用TE清洗3次，去除上清液；加入80μl 0.1～1.0mg/ml的生物素化的牛血清白蛋白(Biotin-BSA)，置於低溫搖床上4℃，350rpm搖蕩12～48h，然後用TE清洗3次，Biotin-BSA通過物理吸附作用結合到顆粒表面；加入80μl 0.1～1.0mg/ml的鏈酶親和素(Streptavidin)，置於低溫搖床上4℃，350rpm搖蕩4～8h，鏈酶親和素能與顆粒表面的生物素發生有力結合併固定在顆粒表面，用TE清洗3次；分別加入50μl 0.1～1.0μM的生物素修飾的突變檢測捕獲探針Capture-C、Capture-G、Capture-T和Capture-A(如表1所示)，於4℃，350rpm搖蕩12～48h，用TE清洗後4℃保存備用。捕獲探針通過修飾的生物素與顆粒表面的親和素特異性結合併固定在顆粒上，從而形成了具有p53基因突變檢測能力的功能化二氧化矽顆粒。
2.製備一維微流控突變檢測晶片將聚二甲基矽氧烷與固化劑充分混合後於真空泵中除去氣泡，然後平鋪在晶片陽模板上，置於75℃烘箱中20～40min，待固化後取出，最後將PDMS片基從陽模板上剝離下來，該片基中包含有許多用於容納微珠的小室。將用聚二甲基矽氧烷澆鑄的一維微流控生物晶片片基放置在倒置螢光顯微鏡上，通過顯微操作的方法將直徑在40μm左右的修飾有突變檢測探針的功能化微珠放置在微通道中的小室中首先，使用一套進口的燒針、拉針及磨針系統製備顯微操作微吸管，將微吸管固定在倒置螢光顯微鏡的顯微作業系統上，然後在顯微條件下，將不同的功能化微珠按照位置編碼的方式放入通道中的小室內，每個小室對應不同的功能化微珠用於樣品的多目標檢測；最後用潔淨的玻片與片基緊密結合完成晶片的封裝。
3.對鼻咽癌細胞(CNE2)、肺癌細胞(A549)和乳腺癌細胞(SKBr-3)這三種細胞分別抽提總RNA，並通過紫外吸收方法進行定量；分別取3μg(所述三種細胞的)總RNA於20μl的雜交緩衝液中(所述雜交緩衝液成分為10mM磷酸鉀緩衝液(pH7.6)、300mMNaCl、體積百分數為0.1％的吐溫20和體積百分數為30％的甲醯胺)進行稀釋，同時加入四甲基羅丹明修飾的信號探針且使其在雜交緩衝液中的終濃度為10nM，；然後在壓力驅動下以0.1μl/min的流速通過一維生物晶片中的功能化微珠陣列，雜交反應20min後，用TE清洗通道並在壓力驅動下用高嚴謹洗脫緩衝液洗脫5min(所述洗脫緩衝液的成分為10mM磷酸鉀緩衝液(pH7.6)、150mMNaCl、體積百分數為0.1％的吐溫20和體積百分數為60％的甲醯胺)，流速為2μl/min；將反應後的晶片置於螢光倒置顯微鏡中的CCD成像系統下，對顆粒進行觀察拍攝，並用螢光圖像分析軟體進行分析，可獲得如圖4所示的突變檢測靈敏性能的結果。結果顯示，三種腫瘤細胞中只有SKBr-3細胞發生了(CGC＞CAC)的鹼基轉換，而其他兩種細胞p53基因的175位密碼子沒有發生突變，仍然為野生型。該結果與傳統的序列測定結果是一致的。
權利要求
1.一種利用一維微流控生物晶片檢測細胞中基因突變的方法，包括一維微流控生物晶片上二氧化矽微珠用鹼活化，再用生物素與親和素進行預處理，然後分別加入生物素修飾的突變檢測捕獲探針，將修飾了突變檢測捕獲探針的二氧化矽微珠逐個移入所述生物晶片微通道的小室，形成功能化微珠陣列，其特徵在於將總RNA或靶DNA樣品於包含有螢光探針的雜交緩衝液中稀釋，並在壓力驅動下流過微通道進入功能化微珠陣列，雜交後將含有甲醯胺的高嚴謹洗脫液注入通道進行洗脫，最後通過螢光倒置顯微鏡觀察及拍攝微珠表面螢光，並用軟體對顆粒的表面螢光強度進行估算，根據螢光強度的差別判斷該檢測位點的突變類型。
2.根據權利要求1所述的利用一維微流控生物晶片檢測細胞中基因突變的方法，其特徵在於所述總RNA與螢光探針的比例為1.5×107克∶1摩爾，DNA與螢光探針的比例大於或等於56克∶1摩爾。
3.根據權利要求1或2所述的利用一維微流控生物晶片檢測細胞中基因突變的方法，其特徵在於所述壓力驅動下的流速為0.1μl/min。
4.根據權利要求1或2所述的利用一維微流控生物晶片檢測細胞中基因突變的方法，其特徵在於所述螢光探針為四甲基羅丹明修飾的信號探針。
5.根據權利要求1或2所述的利用一維微流控生物晶片檢測細胞中基因突變的方法，其特徵在於所述高嚴謹洗脫液含有體積百分數為60％的甲醯胺。
全文摘要
本發明公開了一種利用一維微流控生物晶片檢測細胞中基因突變的方法，其特徵在於構建基於一維微流控微珠陣列晶片的功能化的突變檢測晶片，將總RNA或靶DNA樣品於包含有螢光探針的雜交緩衝液中稀釋，並在壓力驅動下流過微通道進入功能化微珠陣列，雜交後將含有甲醯胺的高嚴謹洗脫液注入通道進行洗脫，最後通過螢光倒置顯微鏡觀察及拍攝微珠表面螢光，並用軟體對顆粒的表面螢光強度進行估算，根據螢光強度的差別判斷該檢測位點的突變類型。本發明方法解決了基因突變分析方法中微量檢測、高靈敏度以及高通量分析等特點難以並存的缺陷，並有望實現單細胞水平上的基因突變分析。
文檔編號G01N33/48GK101046448SQ200710034888
公開日2007年10月3日 申請日期2007年5月8日 優先權日2007年5月8日
發明者王柯敏, 張何, 羊小海, 文建輝, 譚蔚泓 申請人:湖南大學