檢測真菌毒素的膜基質蛋白質晶片及製備方法
2023-04-24 09:01:51
專利名稱：檢測真菌毒素的膜基質蛋白質晶片及製備方法
技術領域：
本專利涉及生物技術領域，具體涉及一種可同時檢測多種常見重要真菌毒素的膜
基質蛋白質晶片，可用於穀物、飼料及食品中真菌毒素的快速檢測。
背景技術：
真菌毒素是真菌產生的次級代謝產物，目前已知有200多種不同的真菌毒素。由 於真菌的寄生和真菌毒素的產生，嚴重影響農作物的產量，降低農產品和飼料品質，造成巨 大經濟損失。全世界每年由於真菌毒素引起的農產品和工業原料的損失達數百億美元。據 調查，除糧食、飼料以外，在油料作物種子、水果、乾果、蔬菜、調味品、菸草、麻類、乳和乳制 品、魚蝦、肉類、發酵產品等都發現了不同程度的真菌毒素汙染。研究發現，人或動物攝入 被真菌毒素汙染的農、畜產品，或通過吸入及皮膚接觸真菌毒素可引發多種中毒症狀，如致 幻、催吐、出血症、皮炎、中樞神經受損等。 目前，常見的真菌毒素檢測方法有高效液相色譜法、氣相色譜_質譜聯用分析法、 酶聯免疫吸附檢測法及膠體金免疫層析法等。高效液相色譜法和氣相色譜_質譜聯用分析 法具有檢測準確、重複性好等特點，但同時也有儀器價格昂貴、操作繁瑣、樣本檢測耗時長、 不能同時檢測多個樣品等缺點，因而其使用受到極大的限制，不適於基層廣泛使用。酶聯 免疫吸附檢測法是目前常用的大規模篩查方法，但是酶聯免疫吸附檢測法也需要儀器的配 合，檢測時間偏長，難以滿足基層現場快速檢測的需要，膠體金免疫層析法作為常見的免疫 學診斷方法在農業、生物醫學領域特別是醫學檢驗中得到了廣泛應用，它具有操作簡便、快 速，不需要藉助儀器檢測來判讀結果等特點，適宜於基層的檢測。 以上方法均不能同時檢測樣品中的多種真菌毒素，然而真菌毒素常常是混合汙
染，樣品中同時汙染多種真菌毒素的情況較為普遍。開發出操作簡單、檢測準確、便捷快速
且可肉眼直接判斷的可同時檢測多種真菌毒素的檢測方法就顯得頗為重要。 近年來新興的生物晶片技術為解決這個問題提供了一個新的思路。蛋白質晶片
技術採用基因晶片的微點陣技術將系列抗原或抗體密集點陣於介質載體形成免疫微陣列，
沿用傳統ELISA檢測原理通過免疫反應產生檢測信號，從而對實驗結果進行定性或定量分
析。與微點陣技術相對應的是宏陣列點陣技術，該技術是構建在載體面積相對較大的一種
晶片形式，將抗原或者抗體以相對寬大的間距點陣於玻璃載體基質或者硝酸纖維素膜基質
上面，加入抗體或者酶標記抗原，運用生物素_親和素信號系統或者辣根過氧化物酶信號
系統將信號放大，以不溶性四甲基聯苯胺為顯色底物，直接通過肉眼來判斷結果。
發明內容
本發明的目的在於提供一種可同時檢測穀物、飼料及食品中重要真菌毒素(黃曲 黴毒素Bp玉米赤黴烯酮、赭麴黴毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬菌素Bp伏馬菌素B》的 膜基質蛋白質晶片。 本發明還涉及上述膜基質蛋白質晶片的製備方法。
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本發明的技術方案如下 本發明所述的膜基質蛋白質晶片由聚偏二氟已烯膜基片以及固定在該基片上的 點樣物組成。 所述的點樣物為黃麴黴毒素Bp玉米赤黴烯酮、赭麴黴毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯 醇、伏馬菌素Bp伏馬菌素B2的牛血清白蛋白偶聯物(真菌毒素全抗原)，各真菌毒素與牛 血清白蛋白的摩爾結合比為10-30 : 1; 所述的用於固定點樣物的穩定物由蔗糖、甲醇及防腐劑組成，其中真菌毒素全抗
原總量與防腐劑的重量比為i : o.oi-o. 5、與蔗糖的重量比為i : 50-200、與甲醇的重量 比為i : o. oi-o. i。 本發明所述防腐劑為苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸丁脂、苯甲酸鈉中的任意一種。 本發明所述的黃麴黴毒素B"玉米赤黴烯酮、赭麴黴毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、 伏馬菌素Bp伏馬菌素B2的牛血清白蛋白偶聯物(真菌毒素全抗原)用於捕獲結合各自 對應的真菌毒素抗體；穩定物用於穩定固相結合於聚偏二氟乙烯膜基質上的真菌毒素全抗 原。 本發明所述的膜基質蛋白質晶片的製備方法是先將聚偏二氟乙烯膜置於甲醇中
浸泡後，將膜平整放置於濾紙上端，用點樣儀將點樣物點於膜上，溫育後再用雜蛋白封閉膜
上沒有結合點樣物的多餘位點，洗滌晾乾後真空封裝。
更具體地說，本發明所述的膜基質蛋白質晶片的製備方法是 1)膜的前處理，將聚偏二氟乙烯膜置於甲醇中浸泡5-20分鐘，用蒸餾水將膜上甲 醇洗滌乾淨；2)點樣，將處理過的膜平整置於濾紙上端，用玻棒去除氣泡，點樣儀將點樣物 點於膜上，置於25-37t:中溫育2-3小時；3)封閉，將膜置於3-10% (m/v% )的脫脂奶粉 中，25-37t:中溫育2-3小時；4)洗滌，用pH為7. 2_8. 0的磷酸鹽緩衝液洗滌封閉後的膜， 晾乾後真空封裝於鋁箔袋中可長期保存待用。 目前的蛋白質晶片通常用的基質都是玻璃載體或是氨基化、醯基化修飾後的玻璃 載體、硝酸纖維素膜等材料，為了更好的實現肉眼辨別且適合基層大規模使用，本發明選用 了聚偏二氟乙烯作為膜基質，該膜具有很強的蛋白質吸附能力，物理化學性能較好，耐酸鹼 有機溶劑等優點，但該膜由於很強的疏水性，一般條件下很難將蛋白質均勻的點樣於膜上， 本發明通過甲醇活化後，用水洗滌，直接將膜鋪於濾紙上，通過毛細滲透作用，將蛋白質均 勻且牢固的點樣於膜上，無需額外的點樣緩衝液，方便而且快捷，同時選用了普通的脫脂奶 粉進行封閉，降低了製作成本，封閉完成後的乾燥及抽真空步驟都可大大增加蛋白質晶片 的長期保存。 本發明由於將6種(黃麴黴毒素B工、玉米赤黴烯酮、赭麴黴毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌 烯醇、伏馬菌素Bp伏馬菌素B2)真菌毒素全抗原同時點樣於一張膜上，借鑑間接競爭ELISA 原理，從而可達到在一張膜上可同時檢測6種不同的真菌毒素，只需要提取一次樣品就可 知該樣品中含有的真菌毒素種類，樣品提取完成後與6種真菌毒素抗體混勻，真菌毒素膜 基質蛋白質晶片浸泡在混有真菌毒素抗體和待檢樣品的液體中反應2-5分鐘後，用磷酸緩 衝液洗滌未結合及游離的真菌毒素抗體，然後再將真菌毒素膜基質蛋白質晶片浸泡於辣根 過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG 二抗工作液中反應2-5分鐘，用磷酸緩衝液洗滌未結合及
4游離的二抗，加入沉澱型的四甲基聯苯胺(TMB)顯色液進行顯色，顯色完畢後用水終止顯 色，肉眼判斷結果。若樣品中不含有該項真菌毒素，則點樣有該真菌毒素全抗原的位置將顯 色，表明為陰性；反之，則不顯色，表明為陽性。 本發明操作簡單、方便快速、無需任何儀器設備就可一次性完成多種真菌毒素種 類的測定，並可長期保存，兼具了ELISA靈敏度高的特點，膠體金免疫層析技術肉眼判別的 特點以及生物晶片高通量檢測的特點，製備工藝簡單，可大規模化生產。
具體實施例方式
本發明將通過以下實施例作進一步的說明。 實施例l。製作可同時檢測多種真菌毒素的膜基質蛋白質晶片
( — )膜的前處理 1、將聚偏二氟乙烯膜浸沒於分析純甲醇溶液中，浸泡10分鐘；
2 、將膜取出，用蒸餾水衝洗5次；
3、用吹風機將膜上水分晾乾。
( 二 )點樣 1、將6種真菌毒素全抗原用磷酸緩衝液(pH = 7. 4)稀釋成0. 5mg/mL，待用； 2、分別取6種真菌毒素全抗原lmg，混合加入O. 5mg苯甲酸、50mg蔗糖、100iiL分
析純甲醇，混勻，置於96孔酶標板中，製備完成6種真菌毒素點樣物待用； 3、將處理好的膜平鋪置於濾紙上端，用玻璃棒趕走中間氣泡； 4、用點樣儀各取6種真菌毒素點樣物3ii L，依次點樣於膜上，置於37t:溫箱中孵
育2小時。(三)封閉 1、稱取7.5克脫脂奶粉，加入lOOmL磷酸鹽緩衝液(pH = 7. 4)，混勻待用；
2、將上述點樣完畢的膜取出，置入配好的脫脂奶粉溶液中，37t:溫育2小時；
3、溫育完畢後，用磷酸鹽緩衝液(pH = 7. 4)衝洗4次，晾乾。
(四)真空保存 1、將封閉完畢的膜置於超淨工作檯中，開啟最大風速，吹2小時； 2、取出膜，置於鋁箔袋中，抽真空去除袋中空氣，熱封口，長期保存。 實施例2。採用可同時檢測多種真菌毒素的膜基質蛋白質晶片檢測玉米樣品( — )真菌毒素蛋白質晶片的製備 同實施例1 (二)玉米樣品的提取 1、稱取5克有代表性的玉米樣品，充分粉碎後置入250mL的三角燒瓶中，往瓶中加 入25mL 60%甲醇/水溶液，充分振蕩3分鐘； 2、靜置2分鐘，取上層液體2mL，加入6mL 20%甲醇/水，混勻，過濾，濾液即為樣 品提取液。(三)樣品檢測 1、取出2張膜晶片，打開真空包裝，待用； 2、取1. 5mL樣品提取液，加入1. 5mL內含6種真菌毒素抗體的工作液，混勻，作為待檢工作液； 3、取1. 5mL 30%甲醇/水，加入1. 5mL內含6種真菌毒素抗體的工作液，混勻，作 為陰性對照液； 4、2張膜晶片分別投入含有待檢工作液和陰性對照液的反應盒中，浸沒，室溫反應 5分鐘； 5、反應完畢後，取出膜晶片，用磷酸鹽緩衝液(pH = 7. 4)衝洗4次； 6、將2張膜分別投入含有辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG二抗工作液中，浸
泡室溫反應5分鐘； 7、反應完畢後，取出膜晶片，用磷酸鹽緩衝液(pH= 7.4)衝洗4次； 8、將2張膜分別投入沉澱型的四甲基聯苯胺(TMB)顯色液進行顯色1分鐘，顯色
完畢後，用蒸餾水衝洗，終止顯色。(四)結果判斷 1、若樣品中不含有該項真菌毒素，則點樣有該真菌毒素全抗原的位置將顯色，表 明為陰性； 2、若樣品中含有該項真菌毒素，則點樣有該真菌毒素全抗原的位置將不顯色，表 明為陽性； 3、投入陰性對照液中的膜晶片，膜上各點均應顯色，表明反應體系正常。
權利要求
一種檢測真菌毒素的膜基質蛋白質晶片，其特徵是由聚偏二氟己烯膜基片以及固定在該基片上的點樣物組成；所述的點樣物為黃麴黴毒素B1、玉米赤黴烯酮、赭麴黴毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬菌素B1、伏馬菌素B2的牛血清白蛋白偶聯物，各真菌毒素與牛血清白蛋白的摩爾結合比為10-30∶1；所述的用於固定點樣物的穩定物由蔗糖、甲醇及防腐劑組成，其中真菌毒素全抗原總量與防腐劑的重量比為1∶0.01-0.5、與蔗糖的重量比為1∶50-200、與甲醇的重量比為1∶0.01-0.1。
2. 根據權利要求1所述的膜基質蛋白質晶片，其特徵是所述防腐劑為苯甲酸、山梨酸、 對羥基苯甲酸丁脂、苯甲酸鈉中的任意一種。
3. 權利要求1所述的膜基質蛋白質晶片的製備方法，其特徵是先將聚偏二氟乙烯膜置 於甲醇中浸泡後，將膜平整放置於濾紙上端，用點樣儀將點樣物點於膜上，溫育後再用雜蛋 白封閉膜上沒有結合點樣物的多餘位點，洗滌晾乾後真空封裝。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特徵是1)將聚偏二氟乙烯膜置於甲醇中浸泡5-20 分鐘，用蒸餾水將膜上甲醇洗滌乾淨；2)將處理過的膜平整置於濾紙上端，用玻棒去除氣 泡，點樣儀將點樣物點於膜上，置於25-37t:中溫育2-3小時；3)將膜置於3_10% (m/v% ) 的脫脂奶粉中，25-37t:中溫育2-3小時；4)用pH為7. 2_8. 0的磷酸鹽緩衝液洗滌封閉後 的膜，晾乾後真空封裝於鋁箔袋中。
全文摘要
檢測真菌毒素的膜基質蛋白質晶片及製備方法，由聚偏二氟己烯膜基片以及黃麴黴毒素B1、玉米赤黴烯酮、赭麴黴毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬菌素B1、伏馬菌素B2的牛血清白蛋白偶聯物等六種點樣物組成；將聚偏二氟乙烯膜置於甲醇中浸泡後，將膜平整放置於濾紙上端，用點樣儀將點樣物點於膜上，溫育後再用雜蛋白封閉膜上沒有結合點樣物的多餘位點，洗滌晾乾後真空封裝。本發明操作簡單、方便快速、無需任何儀器設備就可一次性完成多種真菌毒素種類的測定，並可長期保存，兼具了ELISA靈敏度高的特點，膠體金免疫層析技術肉眼判別的特點以及生物晶片高通量檢測的特點，製備工藝簡單，可大規模化生產。
文檔編號G01N33/569GK101696975SQ20091018633
公開日2010年4月21日 申請日期2009年10月27日 優先權日2009年10月27日
發明者何慶華, 李燕萍, 王丹, 許楊, 黃志兵 申請人:南昌大學;