一種破傷風類毒素新型培養基的製備方法
2023-04-23 13:26:41 1
一種破傷風類毒素新型培養基的製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種破傷風類毒素新型培養基的製備方法，包括配方和製備工藝。本發明採用蛋白腖、酵母粉、維生素和無機鹽構成配方，配以相應的製備工藝的技術方案，克服了現有技術存在水解程度差異大、品質一致性差、毒素難以純化、產毒量不穩定的問題與不足，使破傷風類毒素的培養基，達到了減小水解差異、提高品質一致性、毒素易於純化、穩定提高產毒量的目的。
【專利說明】一種破傷風類毒素新型培養基的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種微生物培養基的製備方法，具體是指用於培養破傷風菌種獲取破傷風類毒素的一種破傷風類毒素新型培養基的製備方法。
【背景技術】
[0002]破傷風類毒素是配製破傷風疫苗的重要製劑，破傷風類毒素是在培養基中接種破傷風菌種，從培養獲取的破傷風桿菌中提取的；因此，培養基的優劣便成為能否獲取優質、高效、穩定、純化一致的破傷風類毒素的關鍵；用於接種破傷風菌種、培養破傷風桿菌、獲取破傷風類毒素的培養基，本文簡稱培養基。現有技術採用酶或酸對牛肉、酪素、黃豆等動植物蛋白質進行水解來製備培養基；實際生產中，由於現有培養基的各個批次的水解程度難以保持一致，水解過深使現有培養基的產毒量下降，水解度過淺使現有培養基所產毒素中含有過量的雜質蛋白，毒素難以純化；而毒素中過量的雜質蛋白會導致最終的類毒素製品對人體引發不良反應；因此，現有技術存在水解程度差異大、品質一致性差、毒素難以純化、產毒量不穩定的問題與不足。
【發明內容】
[0003]針對上述現有技術存在的問題與不足，本發明採用蛋白腖、酵母粉、維生素和無機鹽構成配方，配以相應的製備工藝的技術方案，提供一種破傷風類毒素新型培養基的製備方法，旨在使破傷風類毒素的培養基達到減小水解差異、提高品質一致性、毒素易於純化、穩定提尚廣毒量的目的。
[0004]本發明的目的是這樣實現的:一種破傷風類毒素新型培養基的製備方法，包括配方和製備工藝，其中:所述的配方，包括新培養基配方、I號生長因子配方和II號生長因子配方；
[0005]所述新培養基配方簡稱基配方，所述基配方為:
[0006]原料1:蛋白腖酵母粉，藥用級，14.62毫克；
[0007]原料2:胰蛋白腖，藥用級，5.64毫克；
[0008]原料3:酵母粉，10克；
[0009]原料4:三水合乙酸鈉(CH3COONa.3H20)，分析純，5克；
[0010]原料5:磷酸二氫鉀(KH2PO4)，分析純，I克；
[0011]原料6:磷酸氫二鈉(Na2HPO4),藥用級，0.4克；
[0012]原料7:甘油，藥用級，60毫升；
[0013]原料8:葡萄糖，分析純，2.5克；
[0014]原料9:1號生長因子，5暈升；
[0015]原料10:11號生長因子，2暈升；
[0016]原料11:六水合三氯化鐵(FeCl3.6H20)，分析純，0.03克；
[0017]原料12:注射用水，770毫升；
[0018]脫色劑:活性炭，藥用級，2克；
[0019]中和劑:NaOH溶液，20%，按需量，毫升；
[0020]稀釋劑:注射用水，(至100ml的)餘量，暈升；
[0021]配方中各物質的用量為1000毫升單位容積培養基的用量；
[0022]所述I號生長因子配方簡稱I配方，所述I配方為:
[0023]原料A:鹽酸硫胺，生化試劑，0.3g ；
[0024]原料B:核黃素，生化試劑，0.3g ；
[0025]原料C:鹽酸吡哆辛，生化試劑，0.3g ；
[0026]原料D:泛酸鈣，生化試劑，1.2g ；
[0027]原料E:維生素H，生化試劑，4mg
[0028]原料F:無水乙醇，分析純，250ml ；
[0029]稀釋劑G:注射用水，餘量，暈升；
[0030]I配方中各物質的用量為1000毫升單位容積的I號生長因子的用量；
[0031]所述II號生長因子配方簡稱II配方，所述II配方為:
[0032]原料a:煙酸，生化試劑，0.25g ；
[0033]原料b:L-胱氨酸，生化試劑，75g ；
[0034]原料c:尿嘧啶，生化試劑，2.5g ；
[0035]原料d:稀鹽酸，藥用級，150ml ;
[0036]原料e:七水合硫酸鎂(MgSO4.7H20)，分析純，50g ；
[0037]原料f:七水合硫酸鋅(ZnSO4.7H20)，分析純，1g ；
[0038]稀釋劑h:注射用水，餘量，暈升；
[0039]II配方中各物質的用量為1000毫升單位容積的II號生長因子的用量；
[0040]所述的製備工藝，包括I號生長因子製備、II號生長因子製備、新培養基製備；其中，
[0041]所述I號生長因子製備為，將所述I配方中原料B置於燒杯內，加入稀釋劑G浸沒混勻，之後，加入原料F攪拌溶解，之後，加入原料A、原料C、原料D和原料E攪拌溶解，之後，加入稀釋劑G使總量至1000ml，攪拌混合均勻；獲得I號生長因子，待用；
[0042]所述II號生長因子製備為，將所述II配方中的原料a、原料b和原料c置於燒杯內，加入稀釋劑h浸沒混勻，之後，加入原料d攪拌溶解，之後，加入原料e和原料f混合攪拌溶解，之後，加入稀釋劑h使總量至1000ml，攪拌混合均勻；獲得II號生長因子，待用；
[0043]所述新培養基製備為:
[0044]步驟一、將所述基配方中的原料1、原料2、原料3、原料4、原料5和原料6加入反應釜內，邊攪拌邊加熱至50?60°C，使之充分溶解，獲得初溶料；
[0045]步驟二、用燒杯從反應釜內取樣20ml測定所述初溶料的pH值，用基配方中的中和劑將反應釜內初溶料的PH值調節至7.4±0.2，獲得中和料；
[0046]步驟三、將基配方中的原料7投入反應釜內與所述中和料加熱攪拌混合，加熱溫度至100°c，使之沸騰，沸騰持續時間3?5分鐘，停止加熱，獲得含油料；
[0047]步驟四、將基配方中的所述原料8和原料12置於燒杯中攪拌溶解後投入反應釜內與所述含油料攪拌混合，攪拌混合用時I?2分鐘，獲得含糖料；
[0048]步驟五、將所述含糖料冷卻至60°C從反應釜內取出，經板框濾器(NA12濾板)過濾後再次置於反應釜中，獲得濾液；
[0049]步驟六、將基配方中的所述原料9、原料10、原料11和原料12投入反應釜中與所述濾液攪拌混合，在加熱升溫至60°C的溫度下攪拌2分鐘，獲得濃液，停止加熱，之後，用基配方中的所述稀釋劑對所述濃液進行攪拌稀釋，使總量至100ml ;靜置冷卻至室溫，獲得稀料；
[0050]步驟七、用燒杯從反應釜內取樣20ml測定所述稀料的pH值，用基配方中的中和劑將反應釜內稀料的PH值調節至7.2±0.2，獲得中和稀料；之後，將基配方中的脫色劑投入反應釜中對中和稀料進行攪拌脫色，攪拌脫色用時2分鐘，獲得脫色料；
[0051]步驟八、將所述脫色料移至貯存罐中，將貯存罐移至高壓蒸汽滅菌釜內對所述脫色料進行連罐連蓋的溼熱滅菌，溼熱滅菌時貯存罐的罐蓋開啟，溼熱滅菌溫度為112°C，溼熱滅菌用時30分鐘，之後，開啟高壓蒸汽滅菌釜，乘熱封閉貯存罐的罐蓋，之後，取出貯存罐，此時貯存罐內的物質即為破傷風類毒素新型培養基的成品。
[0052]有益效果
[0053]實驗證明，本發明製備的破傷風類毒素新型培養基用於培養製備破傷風類毒素，接種培養用時67小時，破傷風桿菌產毒量為80Lf/ml，精製後毒素純度大於2600Lf/ml，類毒素純度大於2000Lf/ml ;產毒量大且穩定，毒素品質一致性好，且易於高度純化。
[0054]上述，本發明採用蛋白腖、酵母粉、維生素和無機鹽構成配方，配以相應的製備工藝的技術方案，克服了現有技術存在水解程度差異大、品質一致性差、毒素難以純化、產毒量不穩定的問題與不足，所提供的一種破傷風類毒素新型培養基的製備方法，使破傷風類毒素的培養基，達到了減小水解差異、提高品質一致性、毒素易於純化、穩定提高產毒量的目的。
實施例說明
[0055]以下通過具體實施例對本發明的一種破傷風類毒素新型培養基的製備方法作進一步詳細說明，所屬領域的技術人員可以參照實施例的配方及工藝方法製得破傷風類毒素新型培養基製品，但不應理解為對本發明的任何限制。
【具體實施方式】
[0056]
[0057]實施例
[0058]品名:破傷風類毒素新型培養基
[0059]配方:包括新培養基配方簡稱基配方、I號生長因子配方簡稱I配方和II號生長因子配方簡稱II配方；其中，
[0060]基配方為:
[0061]原料1:蛋白腖酵母粉，藥用級，14.62毫克；
[0062]原料2:胰蛋白腖，藥用級，5.64毫克；
[0063]原料3:酵母粉，10克；
[0064]原料4:三水合乙酸鈉(CH3COONa.3H20)，分析純，5克；
[0065]原料5:磷酸二氫鉀(KH2PO4)，分析純，I克；
[0066]原料6:磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，藥用級，0.4克；
[0067]原料7:甘油，藥用級，60毫升；
[0068]原料8:葡萄糖，分析純，2.5克；
[0069]原料9:1號生長因子，5暈升；
[0070]原料10:11號生長因子，2暈升；
[0071]原料11:六水合三氯化鐵(FeCl3.6H20)，分析純，0.03克；
[0072]原料12:注射用水，770毫升；
[0073]脫色劑:活性炭，藥用級，2克；
[0074]中和劑:NaOH溶液，20%,按需量，毫升；
[0075]稀釋劑:注射用水，(至100ml的)餘量，毫升；
[0076]配方中各物質的用量為1000毫升單位容積培養基的用量；
[0077]I配方為:
[0078]原料A:鹽酸硫胺，生化試劑，0.3g ；
[0079]原料B:核黃素，生化試劑，0.3g ；
[0080]原料C:鹽酸吡哆辛，生化試劑，0.3g ；
[0081]原料D:泛酸鈣，生化試劑，1.2g ；
[0082]原料E:維生素H，生化試劑，4mg
[0083]原料F:無水乙醇，分析純，250ml ；
[0084]稀釋劑G:注射用水，餘量，暈升；
[0085]I配方中各物質的用量為1000毫升單位容積的I號生長因子的用量；
[0086]II配方為:
[0087]原料a:煙酸，生化試劑，0.25g ；
[0088]原料b:L-胱氨酸，生化試劑，75g ；
[0089]原料c:尿嘧啶，生化試劑，2.5g ；
[0090]原料d:稀鹽酸，藥用級，150ml ;
[0091 ]原料e:七水合硫酸鎂(MgSO4.7H20)，分析純，50g ；
[0092]原料f:七水合硫酸鋅(ZnSO4.7H20)，分析純，1g ；
[0093]稀釋劑h:注射用水，餘量，暈升；
[0094]II配方中各物質的用量為1000毫升單位容積的II號生長因子的用量；
[0095]製備
[0096]製備條件、設備
[0097]環境氣壓:一個大氣壓；環境溫度:室溫；
[0098]製備設備:設備:燒杯，100ml ;不鏽鋼貯存罐；板框濾器(NA12濾板);反應釜；
[0099]製備工藝:
[0100]包括I號生長因子製備、II號生長因子製備、新培養基製備；
[0101]I號生長因子製備為:
[0102]將所述I配方中原料B置於燒杯內，加入稀釋劑G浸沒混勻，之後，加入原料F攪拌溶解，之後，加入原料A、原料C、原料D和原料E攪拌溶解，之後，加入稀釋劑G使總量至1000ml，攪拌混合均勻；獲得I號生長因子，待用；
[0103]II號生長因子製備為:
[0104]將所述II配方中的原料a、原料b和原料c置於燒杯內，加入稀釋劑h浸沒混勻，之後，加入原料d攪拌溶解，之後，加入原料e和原料f混合攪拌溶解，之後，加入稀釋劑h使總量至1000ml，攪拌混合均勻；獲得II號生長因子，待用；
[0105]新培養基製備為:
[0106]步驟一、將所述基配方中的原料1、原料2、原料3、原料4、原料5和原料6加入反應釜內，邊攪拌邊加熱至50?60°C，使之充分溶解，獲得初溶料；
[0107]步驟二、用燒杯從反應釜內取樣20ml測定所述初溶料的pH值，用基配方中的中和劑將反應釜內初溶料的PH值調節至7.4±0.2，獲得中和料；
[0108]步驟三、將基配方中的原料7投入反應釜內與所述中和料加熱攪拌混合，加熱溫度至100°c，使之沸騰，沸騰持續時間3?5分鐘，停止加熱，獲得含油料；
[0109]步驟四、將基配方中的所述原料8和原料12置於燒杯中攪拌溶解後投入反應釜內與所述含油料攪拌混合，攪拌混合用時I?2分鐘，獲得含糖料；
[0110]步驟五、將所述含糖料冷卻至60°C從反應釜內取出，經板框濾器(NA12濾板)過濾後再次置於反應釜中，獲得濾液；
[0111]步驟六、將基配方中的所述原料9、原料10、原料11和原料12投入反應釜中與所述濾液攪拌混合，在加熱升溫至60°C的溫度下攪拌2分鐘，獲得濃液，停止加熱，之後，用基配方中的所述稀釋劑對所述濃液進行攪拌稀釋，使總量至100ml ;靜置冷卻至室溫，獲得稀料；
[0112]步驟七、用燒杯從反應釜內取樣20ml測定所述稀料的pH值，用基配方中的中和劑將反應釜內稀料的PH值調節至7.2±0.2，獲得中和稀料；之後，將基配方中的脫色劑投入反應釜中對中和稀料進行攪拌脫色，攪拌脫色用時2分鐘，獲得脫色料；
[0113]步驟八、將所述脫色料移至貯存罐中，將貯存罐移至高壓蒸汽滅菌釜內對所述脫色料進行連罐連蓋的溼熱滅菌，溼熱滅菌時貯存罐的罐蓋開啟，溼熱滅菌溫度為112°C，溼熱滅菌用時30分鐘，之後，開啟高壓蒸汽滅菌釜，乘熱封閉貯存罐的罐蓋，之後，取出貯存罐，此時貯存罐內的物質即為破傷風類毒素新型培養基的成品。
[0114]有益效果
[0115]實驗證明，本發明製備的破傷風類毒素新型培養基用於培養製備破傷風類毒素，接種培養用時67小時，破傷風桿菌產毒量為80Lf/ml，精製後毒素純度大於2600Lf/ml，類毒素純度大於2000Lf/ml ;產毒量大且穩定，毒素品質一致性好，且易於高度純化。
【權利要求】
1.一種破傷風類毒素新型培養基的製備方法，包括配方和製備工藝，其特徵在於:所述的配方，包括新培養基配方、I號生長因子配方和II號生長因子配方； 所述新培養基配方簡稱基配方，所述基配方為: 原料1:蛋白腖酵母粉，藥用級，14.62毫克； 原料2:胰蛋白腖，藥用級，5.64毫克； 原料3:酵母粉，10克； 原料4:三水合乙酸鈉CH3COONa.3H20，分析純，5克； 原料5:磷酸二氫鉀KH2PO4,分析純，I克； 原料6:磷酸氫二鈉Na2HPO4，藥用級，0.4克； 原料7:甘油，藥用級，60毫升； 原料8:葡萄糖，分析純，2.5克； 原料9:1號生長因子，5暈升； 原料10:11號生長因子，2毫升； 原料11:六水合三氯化鐵FeCl3.6H20，分析純，0.03克； 原料12:注射用水，770毫升； 脫色劑:活性炭，藥用級，2克； 中和劑:氫氧化鈉NaOH溶液，20%,按需量，毫升； 稀釋劑:注射用水，餘量，毫升； 配方中各物質的用量為1000毫升單位容積培養基的用量； 所述I號生長因子配方簡稱I配方，所述I配方為: 原料A:鹽酸硫胺，生化試劑，0.3g ； 原料B:核黃素，生化試劑，0.3g ； 原料C:鹽酸吡哆辛，生化試劑，0.3g ； 原料D:泛酸鈣，生化試劑，1.2g; 原料E:維生素H，生化試劑，4mg 原料F:無水乙醇，分析純，250ml ； 稀釋劑G:注射用水，餘量，毫升； I配方中各物質的用量為1000毫升單位容積的I號生長因子的用量； 所述II號生長因子配方簡稱II配方，所述II配方為: 原料a:煙酸，生化試劑，0.25g ； 原料b:L-胱氨酸，生化試劑，75g ； 原料c:尿嘧啶，生化試劑，2.5g ； 原料d:稀鹽酸，藥用級，150ml ； 原料e:七水合硫酸鎂MgSO4.7H20，分析純，50g ； 原料f:七水合硫酸鋅ZnSO4.7H20，分析純，1g ； 稀釋劑h:注射用水，餘量，毫升； II配方中各物質的用量為1000毫升單位容積的II號生長因子的用量； 所述的製備工藝，包括I號生長因子製備、II號生長因子製備、新培養基製備；其中， 所述I號生長因子製備為，將所述I配方中原料B置於燒杯內，加入稀釋劑G浸沒混勻，之後，加入原料F攪拌溶解，之後，加入原料A、原料C、原料D和原料E攪拌溶解，之後，加入稀釋劑G使總量至1000ml，攪拌混合均勻；獲得I號生長因子，待用； 所述II號生長因子製備為，將所述II配方中的原料a、原料b和原料c置於燒杯內，加入稀釋劑h浸沒混勻，之後，加入原料d攪拌溶解，之後，加入原料e和原料f混合攪拌溶解，之後，加入稀釋劑h使總量至1000ml，攪拌混合均勻；獲得II號生長因子，待用；所述新培養基製備為: 步驟一、將所述基配方中的原料1、原料2、原料3、原料4、原料5和原料6加入反應Il內，邊攪拌邊加熱至50?60°C，使之充分溶解，獲得初溶料； 步驟二、用燒杯從反應釜內取樣20ml測定所述初溶料的pH值，用基配方中的中和劑將反應釜內初溶料的PH值調節至7.4±0.2，獲得中和料； 步驟三、將基配方中的原料7投入反應釜內與所述中和料加熱攪拌混合，加熱溫度至100°C，使之沸騰，沸騰持續時間3?5分鐘，停止加熱，獲得含油料； 步驟四、將基配方中的所述原料8和原料12置於燒杯中攪拌溶解後投入反應釜內與所述含油料攪拌混合，攪拌混合用時I?2分鐘，獲得含糖料； 步驟五、將所述含糖料冷卻至60°C從反應釜內取出，經板框濾器(NA12濾板)過濾後再次置於反應釜中，獲得濾液； 步驟六、將基配方中的所述原料9、原料10、原料11和原料12投入反應釜中與所述濾液攪拌混合，在加熱升溫至60°C的溫度下攪拌2分鐘，獲得濃液，停止加熱，之後，用基配方中的所述稀釋劑對所述濃液進行攪拌稀釋，使總量至100ml ;靜置冷卻至室溫，獲得稀料；步驟七、用燒杯從反應釜內取樣20ml測定所述稀料的pH值，用基配方中的中和劑將反應釜內稀料的PH值調節至7.2±0.2，獲得中和稀料；之後，將基配方中的脫色劑投入反應釜中對中和稀料進行攪拌脫色，攪拌脫色用時2分鐘，獲得脫色料； 步驟八、將所述脫色料移至貯存罐中，將貯存罐移至高壓蒸汽滅菌釜內對所述脫色料進行連罐連蓋的溼熱滅菌，溼熱滅菌時貯存罐的罐蓋開啟，溼熱滅菌溫度為112°C，溼熱滅菌用時30分鐘，之後，開啟高壓蒸汽滅菌釜，乘熱封閉貯存罐的罐蓋，之後，取出貯存罐，此時貯存罐內的物質即為破傷風類毒素新型培養基的成品。
【文檔編號】C12N1/20GK104498388SQ201410692050
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月18日 優先權日:2014年11月18日
【發明者】楊盼景, 陳培培, 熊細雙, 楊廷潺 申請人:浙江衛信生物藥業有限公司