一種基於細胞學動態信息集成鑑別道地中藥材的方法
2023-04-23 22:11:11
專利名稱：一種基於細胞學動態信息集成鑑別道地中藥材的方法
技術領域：
本發明涉及一種生物學領域，具體是指一種基於細胞學動態信息集成鑑別道地中藥材的方法。
背景技術：
目前，鑑別中藥材的方法往往採用物理方法，化學方法，生物化學分析方法，基因分析方法和動物實驗方法。物理方法包括外觀，氣味，酸鹼度，和使用紫外光譜、高效液相色譜(HPLC)、紅外光譜、核磁共振、透射電鏡、X射線、薄層分析(TLC)、氣相色譜(GC)、質譜 (MC)、電子顯微鏡、電感耦合等離子體原子發射光譜(ICP)等分析法；化學方法包括單體的元素分析、結構或基團分析，胺基酸分析，糖組成分析等；生物化學分析方法包括酶分析，抗體分析和活性分析等；以上方法用於化學單體是成功的，但用於中藥分析潛在難以克服的問題。因為一味藥材本身就是一個大複方，由已知和未知的含量不等的化學成分組成，其中某一種甚至幾種成分或組分的多少或幾個比例往往難以反映道地藥材和中草藥的質量高低和好壞，對於由道地藥材和中草藥組成複方的質量判斷，往往束手無策。雖然，以上方法已列入中華人民共和國藥典，尤其是高效液相色譜分析方法，各版藥典不斷增加，讓它反映中醫藥理論和鑑別道地藥材是困難的。基因分析方法是只測定中草藥的幾個比例不到鹼基的特徵位點的鹼基序列， 因為絕大多數的中草藥沒有完成全基因序列的測定，特徵位點的鹼基序列只能說明物種或個體的相似性，不能代表中藥的功效，因為基因的表達與生態環境有關，所以，基因分析方法用於中藥材質量判斷可以作為一個鑑別項目，但需要有與功能相關的指標配合。動物實驗方法是目前常用的藥物研究方法，中國為中藥材的藥理毒理研究制訂了一整套的規範，努力想通過動物實驗直接反映中草藥的功效。因為動物與人類的天生差異， 又因為動物實驗的周期長，成本高，穩定性差，一直沒有用於中藥材的質量檢測，也無法用於道地藥材的鑑別。中醫藥是中國的國寶，而道地藥材則是寶中之寶。道地藥材是指來自特定產區、生產歷史悠久、栽培和加工技術精細、質量優良、療效顯著的藥材。道地藥材是優質藥材的代名詞。道地藥材是一約定俗成的概念，是一個古代藥物標準化的概念。它的產生是以幾百年甚至上千年的實踐教訓和經驗為依據的、經過臨床的考驗的、有著豐富的中醫藥內涵的科學。中藥材的最大特點和精華是它的道地性。從生物學上說，道地藥材的形成是基因型與生境之間相互作用的產物。道地藥材這一概念的形成和發展的全過程都離不開特定產地，其本質是同一藥材在不同產地中質量最佳者。因此，道地藥材一般在藥材前冠以地名，如陽春砂、宣木瓜、茅蒼朮、岷當歸、關黃柏及四大川藥、四大懷藥、遼五味、浙八味等等。古人早就有了概括「離其本土，則效異」。今天，大量存在著離開道地產區種植道地藥材，用有人稱之為「唯有效成分論」的化學藥管理方法鑑定中藥材品質優劣。收效甚微。導致道地藥材不道地，甚至瀕臨滅絕，導致中醫處方不錯而療效不好的現象時常發生，導致國內外中藥材市場信用危機。問題就出
3在沒有一種鑑別道地藥材的實用而有效的方法。所以，科學界、中醫界和中藥產業界希望有一個接近人體的、簡易的、周期短的、成本低的，穩定性好，與人體相關性強的鑑別道地藥材的方法出現。一種基於高通量的細胞學信息鑑別道地中藥材的方法是一種可重複、穩定、有對應相關和簡易的新方法。
發明內容
本發明針對現有技術中的不足，提出了一種穩定性好、操作方便、成本低廉，而且重複性好的方法，用於鑑別中藥材是否為地道藥材，本發明是充分利用了現代生物學技術、 現代檢測技術與傳統中藥材的結合而得出的。本發明是通過下述技術方案得以實現的一種基於細胞學動態信息集成鑑別道地中藥材的方法，其特徵在於，包括下述步驟(1)中藥材提取取中藥材，烘乾，打粉，加蒸餾水溶解，浸泡30min，以頻率42KHz超聲lOmin，沸水浴加熱20min，10000轉/分離心分離lOmin，取上清液備用；(2)常規細胞培養細胞培養基選用1640培養基、DMEM/高糖、DMEM/低糖、MEM培養基、IMDM培養基、DMEM/F12培養基、或McCoy』 s 5A培養基中的一種；上述各種細胞培養基都是目前在公開市場上可以購得，也可以公知的方法製備而得，且相應的名稱的培養基為行業內所熟知， 特定簡稱的細胞培養基與特定的組成相對應，在本發明中為公知技術；胎牛血清、0. 25%胰酶(為體積比例)、PBS，其中PBS的製備是取Nacl 8g，Kcl 0. 2g, KH2PO4 0. 24g, Na2HPO4 · 12H20 3. 58g，加蒸餾水 1000ml，調 pH 至 7· 4 ；經 121°C，30min 的高壓滅菌後可使用。細胞培養液配方細胞培養基加10%胎牛血清，本發明中是指體積比例，即100毫升中加10毫升血清製備而得；選用貼壁細胞為細胞株，於37°C、5% CO2的細胞培養箱中培養，待細胞長到密度為 80% 90%，吸去培養液，加PBS潤洗1 2次，再用0. 25%胰酶消化細胞，直至細胞鼓起、 加入細胞培養液終止消化，用細胞培養液將細胞稀釋成濃度IO4 IO5個/ml，待用；(3)種板測基線取16孔或96孔檢測板，每孔加入細胞培養基，通過檢測板底部連接的電子傳感器，檢測孔底部排列的微電極陣列的阻抗；當沒有細胞時，檢測孔底部排列的微電極陣列的阻抗分布均勻；對於阻抗測量的簡單原理是將96或16孔細胞板的每個小孔底部都分布著電極陣列，覆蓋率在80%，形成一個電流迴路。當這個迴路的上面覆蓋了細胞時， 會產生阻抗(電阻)的變化，由此反映小孔內細胞的各種狀況。目前對此技術已為相關文獻所公開，專利號03822454. 2的專利公開了一種裝置，通過測量由細胞和/或分子導致的阻抗的改變來檢測細胞和/或分子。裝置的一個公開的實施方案包括一個帶有沿著長軸的兩個相對末端的基片。多個電極陣列被定位於基片上。每個電極陣列包括至少兩個電極， 並且在電極陣列中，每個電極通過絕緣材料區域與至少一個相鄰的電極分開。電極在它的最寬點的寬度為絕緣材料區域寬度的約1. 5倍到10倍。裝置也包括導電跡線，它們基本沿
4長軸延伸到基片的兩個相對末端中的一個，並且與其它導電跡線是互不交錯的。每條跡線與至少一個電極陣列電連通，即可測得；另外03822348. 1也公開了一種裝置，包括一個適合於接受和保持細胞樣品的上室，一個有至少兩個電極的下室，和一個生物相容的有孔膜， 所述膜具有適合於細胞經過膜遷移的孔隙度。膜在裝置上將上室和下室分隔開。細胞經多孔膜的遷移使得遷移細胞接觸到下室的一個或多個電極。所述接觸引起電極間一個可測量的阻抗改變。本發明對於阻抗的測定，正是利用了已公開的現有技術進行測量的。接種細胞將上述步驟O)中用細胞培養液稀釋好的細胞加到檢測板中，細胞密度為IO3 IO4個/孔；(4)細胞動態學檢測接種細胞在檢測板上的貼壁、生長，同時檢測板底部連接的電子傳感器測量其阻抗；阻抗的大小用細胞指數進行衡量，檢測數據以時間為橫坐標，以細胞指數為縱坐標製得動態曲線圖；(5)給藥待細胞長到接種後18 M小時，細胞已貼壁，將每孔的細胞培養基吸出，換成無血清培養基，培養2小時，進行給藥；將步驟(1)中備用的上清液，往檢測板上孔中進行給藥；同時有對照孔中加滅菌的蒸餾水，並繼續進行細胞動態學檢測；(6)數據分析將給藥前的最後一個時間點測得的細胞指數為基準，對上述步驟(5)中加了上清液和對照孔中的細胞繼續進行動態學檢測，分別測得各自的阻抗值，通過所得阻抗值的對比即可得知待測中藥材的性質。本發明正是以現代分子生物學和細胞生物學為基礎建立的快速、微量、體外篩選模型和測試方法，結合自動化技術發展起來的已商品化的市售技術平臺或儀器的一種高通量地從各種細胞捕獲中藥材細胞學動態信息技術。將從各種細胞捕獲中藥材細胞學動態信息經組合構成的數值，經各種統計學分析方法轉換成數學矩陣表示，也可以轉換成數字或字母構成的條碼表示，賦予一種或一類中草藥及其代謝產物或其複方製品的特有信息，作為它們的各種生物功能的象徵標記。其中，使用象徵標記區別相同物種不同生長地、不同物種不同生長地的道地藥材、 中草藥和天然藥物。使用象徵標記作為一種或一類中草藥及其代謝產物和它們的中成藥質量標準的鑑別項目。使用象徵標記指導中國道地藥材、中藥材和飲片及天然藥物的選種、選地、栽培或養殖或培養(克隆)、採集或終止培養、加工的質量標準的控制指標。使用象徵標記作為指標或模型分離中國道地藥材、中草藥和天然藥物中的有效組分和有效成分分離模型。有益效果本發明利用現代分子生物學和細胞生物學為基礎，結合現代信息技術， 可以更快速、準確、方便地檢測出同一物種因地域不同所產生的不同性質，以及方便鑑別出地哪些為地道藥材、天然藥物等，具有重複性好、操作方便等特點。
圖1 :A549細胞株(非小型肺癌細胞)的細胞圖譜圖2 =RBL細胞株(大鼠嗜鹼性白細胞)的細胞圖譜圖3 :HepG2細胞株(人肝胚細胞瘤細胞)細胞圖譜圖4 六種細胞的細胞圖譜的數值呈量效關係圖5來自青藏高原的不同產地的17種冬蟲夏草對A549細胞圖譜圖6中國市場上8種與「蟲草」相關產品的A549細胞圖譜
圖7青藏高原冬蟲夏草標準編碼
具體實施例方式下面結合附圖，對本發明的實施作具體說明實施例1中藥材提取取中藥材烘乾，打粉(100目)，稱取中國藥典中藥材人用量的千分之十五的量，加 Iml蒸餾水，浸泡30min，超聲(頻率42KHz) IOmin,沸水浴加熱20min，10000轉/分離心 lOmin，取上清液備用。常規細胞培養選用主要設備器材超淨工作檯、細胞培養箱(37°C，5% CO2)、倒置顯微鏡(50倍 400倍)、水浴箱、 細胞培養瓶(50ml、100ml、250ml)、移液器(0. 5 IOulUO lOOulUOO IOOOul)、槍頭 (10ul、300ul、IOOOul)、吸管(lml、5ml、10ml、20ml)、細胞計數板。主要試劑細胞培養基1640培養基、DMEM/高糖、DMEM/低糖、MEM培養基、IMDM培養基、 DMEM/F12培養基、McCoy，s 5A培養基，規格500ml, Hyclone公司產品。胎牛血清規格500ml，Gibco公司產品。0. 25%胰酶(消化貼壁細胞)規格100ml，Hyclone公司產品。PBS =Nacl :8g，Kcl :0. 2g, KH2PO4 :0. 24g, Na2HPO4 · 12H20 :3. 58g，加蒸餾水 1000ml, 調pH:7. 4。高壓滅菌(121°C，30min)後可使用。細胞培養用培養液配方細胞培養基加10%胎牛血清。選合適\穩定的細胞株，一般為貼壁細胞，於細胞培養箱(37°C，5% CO2)培養，待細胞長到密度為80% 90%，吸去培養液，加PBS潤洗1 2次，用0. 25%胰酶消化細胞， 細胞鼓起，加入細胞培養液終止消化，輕輕將細胞從瓶壁吹打下來，並進行細胞計數，用細胞培養液將細胞稀釋成濃度IO4 IO5個/ml。種板測基線取16孔或96孔檢測板，每孔加入50ul細胞培養基，測基線。檢測板底部整合了電子傳感器，沒有細胞時，檢測孔底部排列的微電極陣列的阻抗分布近似均勻。接種細胞稀釋好的細胞每孔IOOul種板，細胞密度為IO3 IO4個/孔。細胞動態學檢測細胞在檢測板上的貼壁、生長狀況與傳感器測量得到的阻抗相對應。阻抗的大小
6用細胞指數Cell Index進行衡量，檢測得到以時間為橫坐標，以細胞指數Cell Index為縱坐標的動態曲線圖。根據阻抗得到的細胞指數，反映了細胞生物學狀態包括細胞增殖、存活、凋亡、形態變化。細胞附著和生長18-24小時以達到穩定視為正常。給藥待細胞長到接種後18 M小時，細胞已貼壁，將每孔的細胞培養基吸出，換成無血清培養基，150ul每孔，培養2小時，進行給藥。取中藥材提取液，按IOul/孔進行給藥，對照加IOul/孔滅菌的(12rC，30min)蒸餾水，給藥完成，繼續進行細胞動態學檢測。數據分析將給藥前的最後一個時間點測得的細胞指數Normalize為1，得到以時間為橫坐標，以Normalized Cell hdex為縱坐標的曲線圖。不同的中藥材呈現不同的獨有的細胞動態圖譜。用市售的永生化細胞和基因改造過的不同細胞株，捕獲的冬蟲夏草細胞動態信息，見圖1 4，所獲細胞學信息提示1、.同一中藥(冬蟲夏草)從不同來源的細胞株捕獲到的動態信息不同；2、同一細胞株對同一中藥不同濃度的圖譜呈量效關係，可用於中藥材的有效部位或有效成分的含量或作用強弱判斷。圖1 4分別是使用購自ATCC的細胞株A549 (非小型肺癌細胞)，RBL (大鼠嗜鹼性白細胞細胞株)，HepG2 (人肝胚細胞瘤細胞)，COSl (非洲綠猴腎細胞_1)，NIH-3T3 (小鼠胚胎成纖維細胞)，Hela (人宮頸癌細胞)，MCF7/adr (人乳腺癌耐藥細胞)。實施例2按實施例1相同的方法，取同樣來自青藏高原的不同產地的18種冬蟲夏草，它們對A549細胞株的動態信息有相同和不同，見圖5，所獲細胞學信息提示青藏高原的冬蟲夏草對A549細胞株的動態信息大多數相同，而且細胞學動態信息的重複性好。我們取其均值和均值士離差，在23 65小時期間，用9位字母和數字，按預先設定的條件，轉換成字母和數字表示CHC76M67和條碼，見圖7。如果我們把CHC76M67和條碼當成冬蟲夏草的A549 細胞株的動態信息標準編碼。再取市售各「蟲草」產品，結果見圖6，其中只有一種產品落在標準區間編碼內，經調查了解，落在標準區間編碼內的產品是由青藏高原產的冬蟲夏草磨粉所制，其他「蟲草」產品與冬蟲夏草的圖譜相差甚遠。其它各種不同物種，通過本發明的實施，都可以看出在不同的產生，具有不同的圖譜，從而可以鑑別出哪一種為地道藥材。本發明所舉實施例，僅為對本發明的舉例說明，並不表示對本發明內容的限制，通過對本發明的了解，在不經過創造性勞動情況下，所獲得的技術內容，都屬於本發明所要保護的範圍。
權利要求
1. 一種基於細胞學動態信息集成鑑別道地中藥材的方法，其特徵在於，包括下述步驟(1)中藥材提取取中藥材，烘乾，打粉，加蒸餾水溶解，浸泡30min，以頻率42KHZ超聲lOmin，沸水浴加熱20min，10000轉/分離心分離lOmin，取上清液備用；(2)常規細胞培養細胞培養基選用1640培養基、DMEM/高糖、DMEM/低糖、MEM培養基、IMDM培養基、 DMEM/F12培養基、或McCoy』 s 5A培養基中的一種；胎牛血清、0.25%胰酶、PBS，其中PBS的製備是按質量比例取Nacl 8份，Kcl 0. 2份， KH2PO4 0. 24 份，Na2HPO4 · Iffl2O 3. 58 份，加蒸餾水 1000 份，並調節 pH 至 7. 4，在 121°C 高溫下滅菌30min後可使用；細胞培養液配方細胞培養基加10%胎牛血清；選用貼壁細胞為細胞株，於37°C、5% CO2的細胞培養箱中培養，待細胞長到密度為 80% 90%，吸去培養液，加PBS潤洗1 2次，再用0. 25%胰酶消化細胞，直至細胞鼓起、 加入細胞培養液終止消化，用細胞培養液將細胞稀釋成濃度IO4 IO5個/ml，待用；⑶種板測基線取16孔或96孔檢測板，每孔加入細胞培養基，通過檢測板底部連接的電子傳感器，檢測孔底部排列的微電極陣列的阻抗；當沒有細胞時，檢測孔底部排列的微電極陣列的阻抗分布均勻；接種細胞將上述步驟O)中用細胞培養液稀釋好的細胞加到檢測板中，細胞密度為 IO3 IO4個/孔；(4)細胞動態學檢測接種細胞在檢測板上的貼壁、生長，同時檢測板底部連接的電子傳感器測量其阻抗；阻抗的大小用細胞指數進行衡量，檢測數據以時間為橫坐標，以細胞指數為縱坐標製得動態曲線圖；(5)給藥待細胞長到接種後18 M小時，細胞已貼壁，將每孔的細胞培養基吸出，換成無血清培養基，培養2小時，進行給藥；將步驟(1)中備用的上清液，往檢測板上孔中進行給藥；同時有對照孔中加滅菌的蒸餾水，並繼續進行細胞動態學檢測；(6)數據分析將給藥前的最後一個時間點測得的細胞指數為基準，對上述步驟(5)中加了上清液和對照孔中的細胞繼續進行動態學檢測，分別測得各自的阻抗值，通過所得阻抗值的對比即可得知待測中藥材的性質。
全文摘要
本發明公開了一種生物學領域，具體是指一種基於細胞學動態信息集成鑑別道地中藥材的方法。本發明是通過採用中藥材的提取、再進行常規細胞的培養、種板到一定程度，然後進行細胞動態學檢測，在檢測過程中再對細胞進行給藥過程，並同時進行細胞動態學檢測，將所檢測結果與標準道地藥材的數值進行數值比較，即可得所測藥材的結果。本發明的優點是利用現代分子生物學和細胞生物學為基礎，結合現代信息技術，可以更快速、準確、方便地檢測出同一物種因地域不同所產生的不同性質，以及方便鑑別出地哪些為地道藥材、天然藥物等，具有重複性好、操作方便等特點。本發明在傳統中藥材檢測行業內具有廣泛用途。
文檔編號G01N27/02GK102393406SQ201110223048
公開日2012年3月28日 申請日期2011年8月5日 優先權日2011年8月5日
發明者傅惠英, 徐洋, 柯越海, 翟雲燕 申請人:杭州柯氏生物科技有限公司