一種草莓開花基因FvbHLH78及其應用的製作方法

2023-04-24 03:04:56 1

技術領域：
：本發明屬於分子生物學、基因工程
技術領域：
，具體涉及一種草莓開花相關基因fvbhlh78及其應用。
背景技術：
：：草莓屬薔薇科多年生草本植物，其果實柔軟多汁，營養豐富，素來有「水果皇后」之譽。草莓在世界上栽培面積較廣，佔小漿果栽培面積的首位，熟期長達6～7個月，可以補充水果淡季市場。近年來草莓的栽培發展很快，栽培品種也越來越多，已經受到了廣大消費者的喜愛。bhlh(basichelix-loop-helixprotein)是真核生物中存在最廣泛的一大類轉錄因子，bhlh轉錄因子在真核生物的生長發育和調控中起到重要作用。bhlh(basichelix-loop-helix，鹼性螺旋–環–螺旋)轉錄因子家族普遍存在於真核生物中，因其含有螺旋–環–螺旋(helix-loop-helix，hlh)結構而被命名。bhlh保守結構域約含有60個胺基酸，其n端為富含鹼性胺基酸的dna結合區，c端為α螺旋1–環–α螺旋(maetal，1994)。bhlh轉錄因子家族基因成員在擬南芥(baileyetal.，2003)、水稻(lietal.，2006)、菸草(rushtonetal.，2008)、葡萄(尹歡等，2013)和番茄(sunetal，2015)等作物中相繼被發現並報導。bhlh轉錄因子可參與植物多個生長發育過程(nesietal，2000；ramsayetal，2003；groszmannetal.，2008；kondouetal.，2008；fujisawaetal.，2013)，而且在植物響應乾旱(seoetal.，2011)、高鹽(zhouetal.，2009；陳李淼等，2013)、脫落酸(abeetal.，2003)、低溫(chinnusamyetal.，2003；wangetal.，2012)、缺鐵(zhangetal.，2015)和低磷(yietal.，2005)等非生物脅迫過程中也發揮重要作用。其通過特定的胺基酸殘基與靶基因相互作用，進而調節相關基因的表達。然而，由於植物bhlh家族成員眾多、參與的生物過程複雜，對於其了解還不是十分清楚。植物中bhlh家族成員的數量眾多，僅次於myb類轉錄因子，例如擬南芥中就有超過140個的bhlh轉錄因子，水稻中bhlh轉錄因子則超過160個。這一龐大的轉錄因子家族導致不可避免的功能冗餘，因此研究單個bhlh轉錄因子的功能就變得相對困難。植物bhlh轉錄因子既可以作為轉錄激活子又能作為轉錄抑制子發揮生物學作用，其作用方式多種多樣。在單子葉和雙子葉植物的氣孔發生、形態等方面，玉米和水稻中均存在ice1的同源基因(liu，2009)，揭示了bhlh轉錄因子在調控氣孔發育過程普遍存在。植物中大多數的bhlh轉錄因子具有組織與時空特異性，表明bhlh轉錄因子主要在特定的發育階段起作用。然而目前，關於bhlh轉錄因子參與植物開花調控的研究鮮有報導。技術實現要素：：(1)本發明提供了一種調控植物開花的草莓bhlh轉錄因子基因fvbhlh78，所述基因編碼核苷酸序列如seqidno.1所示。所述的調控植物早花的草莓fvbhlh78基因編碼的蛋白質，具有序列表中seqidno.2所述的胺基酸序列。(2)本發明提供了含有上述草莓bhlh轉錄因子fvbhlh78的植物表達載體pri101-gfp。將fvbhlh78基因克隆到pri101-gfp，獲得pri101-gfp-camv35s-fvbhlh78。(3)本發明所述基因fvbhlh78在培育早花植物中的應用。具體是將fvbhlh78基因通過表達載體轉入目的植物內。所述植物優選是模式植物擬南芥。(4)本發明的有益效果：利用現有的植物基因工程技術，利用克隆及rt-pcr技術，分離與鑑定草莓開花相關基因序列信息，並通過農桿菌浸花法將基因轉入擬南芥，鑑定證明轉基因植株開花時間明顯早於野生型(圖4)，說明fvbhlh78基因對植物提早開花有一定的影響。附圖說明：圖1fvbhlh78基因編碼區序列的擴增結果。圖2螢光定量pcr分析不同組織器官中fvbhlh78基因的表達情況。圖3重組載體pri101-gfp-camv35s-fvbhlh78的構建。(a)大腸桿菌bhlh78-pmd18-tpcr檢測電泳結果。(b)大腸桿菌pri101-gfp-camv35s-fvbhlh78pcr檢測電泳結果。圖4轉基因擬南芥及野生型對照開花時期對照，轉基因植株比野生型提早開花。具體實施方式：實施例1草莓bhlh78基因的克隆(1)以二倍體森林草莓『ruegen』為試材，材料在溫室大棚中生長。(2)rna提取：用ctab法進行試驗材料的總rna提取，整個操作過程按照ctab法rna提取流程，然後再以該總rna為模板反轉錄得到cdna第一鏈。(3)基因的克隆：以反轉錄的果實cdna第一鏈為模板，利用引物bhlh78-f和bhlh78-r進行pcr擴增，回收pcr產物，獲得1653bp的目的片段。bhlh78-f：gcagtcgacatggaaaaggacaacagttcaggbhlh78-r：gcaggatccatgctcaactttcatctgagc註：bhlh78-f和bhlh78-r引物序列中前九個鹼基，即gcagtcgac和gcaggatcc，為構建載體需要，人為加入的不屬於fvbhlh78基因序列的酶切位點與保護鹼基。bhlh78-r引物由於構建gfp融合表達載體需要，去掉了終止密碼子。實施例2植物表達載體的構建(1)膠回收目的片段之後，將其連接到pmd18-t載體(購自takara公司)，後轉化大腸桿菌感受態細胞trans5α(購自北京全式金生物技術有限公司)，篩選陽性單菌落，提取質粒，測序。(2)選用salⅰ和bamhⅰ分別對測序正確的bhlh78-pmd18-t重組質粒和pri101-gfp質粒雙酶切，回收載體大片段和目的基因小片段，用t4連接酶連接後轉化大腸桿菌trans5α感受態細胞(購自北京全式金生物技術有限公司)，鑑定重組質粒後，得到帶有目的基因的植物過表達載體。實施例3轉化擬南芥及轉基因功能驗證(1)浸花法侵染擬南芥。挑取一個含有目的基因bhlh78的農桿菌gv3101陽性克隆，接種於加入kan(卡那黴素)50mg/l+rif(利福平)25mg/l的液體yep培養基中，28℃200rpm振蕩培養24h，取1ml培養好的菌液，加入50ml液體yep培養基活化，使od600＝0.8左右。將菌液轉入無菌的50ml離心管中，5000rpm，10min離心收集菌體，再用同等體積的重懸液(1/2ms+0.5g/lmes+5％sucrose)重懸農桿菌，並加入表面活性劑silwet，使其終濃度達到300μl/l。將剛開花的擬南芥植株花序在此溶液中浸泡20s。將浸染菌液的擬南芥花序蓋膜保溼，黑暗培養24小時左右，置於光照下正常管理成熟收穫種子。(2)轉基因植株的抗性鑑定收集當代轉基因植株種子(t0代)，播種於含有kana(卡那黴素)(30mg/l)的1/2ms固體培養基上篩選。將生長2周左右的綠色抗性植株轉栽到營養缽裡，基質為草炭、蛭石和珍珠巖比為3：3：1(體積比)。收集t1代種子。將該種子種植於含有kana(卡那黴素)(30mg/l)的1/2ms培養基上，統計分離比，選取符合3存活：1死亡分離比的轉基因株系植株移栽至缽裡進行栽培，收集t2代種子，將該種子種植於含有kana(卡那黴素)(30mg/l)的1/2ms培養基上，種子在培養基上全部為綠苗，t2代為純合系。(3)轉基因植株進行表型鑑定。將轉基因擬南芥t2代植株(轉入pri101-gfp-camv35s-fvbhlh78表達載體的轉基因擬南芥)和野生型擬南芥在同等短日照(8h光照/16h黑暗)條件下進行培養，測試結果如表1所示。表1表型開花時間蓮座葉野生型擬南芥3313.5±0.8轉基因株系1226.9±0.6轉基因株系2226.8±0.5與野生型擬南芥相比，轉基因擬南芥(轉入pri101-gfp-camv35s-fvbhlh78表達載體的轉基因擬南芥)開花時蓮座葉僅有7片葉，轉基因植株都比野生型擬南芥提前開花，同等短日照培養條件下，野生型擬南芥需要33天開花，而轉入fvbhlh78基因的轉基因擬南芥僅需要22天開花。根據結果表明，fvbhlh78基因超表達促進擬南芥提前開花。試驗結果表明，草莓fvbhlh78基因為有功能的基因，具有促進生殖生長，縮短開花時間的作用。序列表seqidno:1atggaaaaggacaacagttcaggcacgcccagctggaacccttcaagcttaatgcactccaatgagctcaattgtgctccacaccaacttcccaattcttacttcaatgccaattgggacaatccaatggatcagagcgatccctttgagtctgctttgagttccatggtgtcctcaccggcggcttccaacgccgtcgctgccaccgccttccccggagaaggcggaggagacatgacaagagaactgattggaagactaggaagcatttgcaactcaggagacatatcttcattgtcttacaataacagtactaacaattcatgctatagtaccccactaaactcttcaccgccaaataagttcaacttgtcaatggttgatccacatatgagaggcaattttccaatcccagcaccctcatcacacccaagtttggctccattttcagctgaccctggttttgtagagagggctgcaaggttttccagctttggaaatcatggtggtctgaatggtcagttcaatttgaatgaagctgaattggcatatagatcaatgctgaagcttgattcacccaagctttccagagcttctagcaatcaatcactgagatctcaaatgggtgctgttcaagaaagcatcaaaagctcttcaccccaagatgagaattcatttcctgataagaaggtcagcaggttctcaaggtccaccaccccagataatggtgaattgggtgattccagagaagggtcatcagtttctgagcagatcccaactggggatttgagtgtgaaagcagagaatgtttccaactcaaggaagaggaaggctgttccaaaaggaaaagccaaagaaacctcttcatctccatctgttaaaaatggcaaggctgtgactgaagagcaaccaaattccaagagaagcaaaactgatgaagcttctgggaatgaaaaggaaactcaaaagtcaaacaaagaatcaaatggaggtggcaaaactaccaaggataaaccaggggttgttgagcctccaaaggactatatacatgtcagagccagaaggggtcaagctactgatagccatagtctggcagaaagagttcgaagagagaaaattagtgaaaggatgaagttccttcaagatcttgttcctggttgcaacaaggtaactgggaaagctgtgatgctagatgagatcataaactatgttcaatcattgcagcgccaagtcgagtttctttcgatgaaattggcgactgtgaatcctagaatggatttgaacatggaagatcttctgtcaaaggaaattcttcaatctcaaggagctttacagaatgccctctaccaattagattccgcagtcccagcatcatttccttttgggtatcaaccccagcaacttccacctttacatagcaacagcatctctaatgaggcagacacacattttccagtaaatttaaatgctgcgctgactcaaaattcaaccatgcaatcgccagcttttgatagatttggtggagcaaatcctcag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